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Article de méthode

L'utilisation de l' Ex Vivo Chandler boucle Appareil pour évaluer la biocompatibilité des conduits de sang polymères modifiés

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DOI :

10.3791/51871

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20 août 2014

 ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Pediatrics, The Children's Hospital of Philadelphia, 2University of Pennsylvania Perelman School of Medicine

Dans cet article

Résumé

L’exposition sanguine aux conduits sanguins polymères déclenche la réaction à un corps étranger qui a été impliquée dans les complications cliniques. Ici, l’appareil à boucle de Chandler, un outil expérimental imitant la perfusion sanguine à travers ces conduits, est décrit. L’appendice du CD47 recombinant entraîne une diminution des signes de réaction à un corps étranger sur ces conduits.

Résumé

La réaction de corps étranger se produit lorsqu'une surface synthétique est introduit dans le corps. Il est caractérisé par l'adsorption de protéines du sang et la fixation subséquente et l'activation des plaquettes, des monocytes / macrophages adhérence, et les événements de signalisation des cellules inflammatoires, ce qui conduit à des complications post-procédure. L'Appareil Chandler Loop est un système expérimental qui permet aux chercheurs d'étudier les interactions moléculaires et cellulaires qui se produisent lorsque de grandes quantités de sang sont perfusés sur des conduites polymériques. A cet effet, ce dispositif a été utilisé comme un modèle ex vivo permettant d'évaluer les propriétés anti-inflammatoires des différentes modifications de surface polymère. Notre laboratoire a montré que les conduits sanguins, modifiées de façon covalente par photoactivation chimie avec CD47 recombinant, peuvent conférer à la biocompatibilité des surfaces polymères. L'ajout de CD47 sur des surfaces polymères pourrait être un moyen efficace de promouvoir l'efficacité de conduits sanguins polymères. Sonein est la méthodologie en détail la chimie de photoactivation utilisé pour ajouter CD47 recombinant à des conduits sanguins cliniquement pertinentes polymères et l'utilisation de la boucle de Chandler comme un modèle expérimental ex vivo pour étudier les interactions de sang avec le CD47 modifiée et de contrôle des conduits.

Introduction

De nombreuses procédures cliniques, tels que la circulation extracorporelle et de dialyse rénale, nécessitent l'utilisation de conduits sanguins polymères et sont souvent associés à des complications post-procédure 1. Lorsque perfusé avec du sang, ces polymères illicite la réaction de corps étranger (FBR), résultant en adsorption des protéines et des plaquettes sanguines, des monocytes / macrophages adhérence, et la libération de cytokines pro-inflammatoires, qui contribuent tous complications post-procédure et / ou défaillance de l'appareil 2,3. Ainsi, les stratégies pour résoudre ce problème restent un domaine important et continu de recherche sur les biomatériaux. Les enquêteurs ont tenté de résoudre ce problème en modifiant les surfaces en contact avec le sang ou bioactifs bioinertes molécules 4-6. Recherche dans notre laboratoire a mis l'accent sur l'ajout de CD47 recombinant (recCD47) de biomatériaux polymères comme une stratégie pour atténuer la FBR et augmenter l'efficacité de ces matériaux. CD47 est un transmembr exprimée de manière ubiquitaireprotéine ane avec un rôle connu dans l'évasion immunitaire, conférant le statut de «soi» sur des cellules exprimant 7-10 et présente des résultats prometteurs à conférer biocompatibilité lorsqu'elle se rapporte à des surfaces polymères 11-13. Signal alpha-protéine de régulation (SIRPα), le récepteur apparenté pour le CD47, et un élément de motif d'inhibition à base de tyrosine d'immunorécepteur (ITIM) contenant famille de protéines transmembranaires, est exprimé sur les cellules d'origine myéloïde 14. Nous avons précédemment démontré que CD47, par l'intermédiaire de la signalisation cellulaire médiée par SIRPα, régule à la baisse les réponses immunitaires à de polyuréthane (PU) et le chlorure de polyvinyle (PVC) dans in vitro, ex vivo et in vivo dans des modèles de 11 à 13.

Au cœur de nos enquêtes est relativement nouveau en chimie des photoactivation, décrit ici, dans lequel les groupes thiol chimiquement réactifs sont ajoutés de manière covalente à un tube polymère en faisant réagir le tube avec un polymère multifonctionnel (PDT-BzPh), composée de 2-pyridyldithio (PDT), la benzophénone photo-réactif (BzPh) et une polyallylamine carboxy modifié 11-13. La réduction des groupes PDT annexés covalente avec le tris (2-carboxyéthyl) phosphine chlorhydrate (TCEP) 11 donne une surface thiolé qui peut être ensuite mis à réagir avec des fragments thérapeutiques. Détaillées ici précédemment et 12,13, recCD47, en outre modifié par l'addition d'une queue poly-lysine C-terminal 12,13, est mis à réagir avec le sulfosuccinimidyl-4-[N -maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC) pendant 1 heure pour produire des groupes thiol réactifs, ce qui permet une formation d'une liaison entre le tube monosulfure et recCD47 11. La capacité anti-inflammatoire des surfaces CD47 fonctionnalisés a été testé, ex viv o, en utilisant l'appareil Chandler boucle avec du sang humain total, qui a été décrite à l'origine en 1958 comme un modèle in vitro de la coagulation thrombotique 15. L'appareil repose sur unSystème de tube fermé partiellement rempli d'air et un moteur rotatif pour faire circuler le sang à travers la tubulure 15. Ce modèle expérimental offre la possibilité d'étudier l'effet de l'exposition du sang à des surfaces modifiés et non modifiés, ainsi que l'effet de ces modifications de surface sur la physiologie des cellules du sang.

recCD47 peut être ajouté à une variété de surfaces de polymères à l'aide de cette chimie de photoactivation, et sa capacité anti-inflammatoire peut être évaluée en utilisant un modèle ex vivo cliniquement pertinente imitant la perfusion sanguine sur des surfaces polymériques 11,12. Grade clinique conduits sanguins modifiés avec recCD47 montrent nettement moins plaquettaire et la fixation des cellules inflammatoires par comparaison à des polymères non modifiés lors d'une exposition à du sang humain dans le dispositif. Une description étape par étape de ce processus de modification est détaillée ci-dessous.

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Protocole

1. Modification des polymères surfaces avec recCD47

REMARQUE:. Le protocole est résumé schématiquement à la figure 1 Figure 1A illustre la génération de surfaces polymères réagissant avec un thiol Figure 1B illustre génération de thiol-réactive recCD47..

  1. Jour 1
    1. Préparer une solution de PDT-BzPh (1 mg / ml) et du bicarbonate de potassium (KHCO 3) (0,7 mg / ml) dans de l'eau stérile. Agiter pendant une nuit à 4 ° C (abri de la lumière).
  2. Jour 2
    1. Couper tube polymère en 40 cm de long morceaux (assez longtemps pour s'adapter autour de rotation des roues).
    2. Faire tremper les tubes dans une solution aqueuse à 0,1% de hexacylpyridinium pendant 90 min à température ambiante sur un agitateur ou en boucle Dispositif Chandler. Rincer les tubes avec 3x d'eau stérile après 90 minutes de trempage.
    3. Acidifier la solution de la PDT-BzPh du jour 1 en ajoutant 15% de potassium aqueux phosphate monosodique (KH 2 PO 4). Ajouter 50 ul KH 2 PO 4 par ml de PDT-BzPh, formant une solution micellaire nuageux.
    4. Faire tremper les tubes dans la solution PDT-BzPh acidifiée pendant 40 min à température ambiante sur un agitateur ou sur un appareil.
    5. Rincer les tubes avec de l'acide acétique dilué (1: 1000) une fois.
    6. Exposer les tubes à rayons UV pour une durée totale de 60 minutes. Tournez tubes ¼ de tour toutes les 15 min pour irradier la totalité de la surface.
    7. Tremper les tubes dans une solution de 20 mg / ml de bicarbonate de potassium (KHCO 3) pendant 20 min à température ambiante sur un agitateur ou sur un appareil.
    8. Rincer les tubes avec 3x de l'eau stérile et conserver à 4 ° C dans de l'eau stérile.
  3. Jour 3
    1. Dissolvez 5 mg sulfo-SMCC dans 200 ul diméthylformamide (DMF) (Attention: Effectuez en hotte).
    2. Ajouter 50 ul de la solution de sulfo-SMCC préparée à l'étape 1 à 0,1 mg / ml de solution de poly-lysine recCD47, et remuer pendant 60 min à rotempérature om.
    3. Pendant 60 min remuer, dégazer stérile saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) et mettre de côté.
    4. Purifier sulfo-SMCC a réagi recCD47 en utilisant une colonne de dessalage 7K de poids moléculaire de coupure de spin selon les instructions du fabricant. Recueillir finale écoulement (thiol-réactive de grande qualité recCD47) et diluer à un volume nécessaire pour revêtir l'intérieur du tube avec du DPBS.
    5. Rincer les tubes du jour 2 avec stérile, dégazée DPBS 3x.
    6. Réagir la surface modifiée des tubes avec une solution de 20 mg / ml de tris (2-carboxyéthyl) phosphine chlorhydrate (TCEP) dans du DPBS dégazés pendant moins de 2 minutes. Rincer les tubes avec stérile dégazé DPBS 4x.
    7. Ajouter le recCD47 Sulfo-SMCC-réagi dans les tubes et laisser incuber pendant une nuit à 4 ° C sur un agitateur ou sur un appareil.

2 immunologique de quantification sur des surfaces modifiées recCD47

  1. Rincer tubes modifiés pour être quantifié à partir de 3 jours d'esprith DPBS 3x. tubes de magasins pas utilisées pour la quantification dans DPBS à 4 ° C.
  2. Utilisez une biopsie poinçon de 4 mm pour réaliser des échantillons de tubes en double et placer pinces à biopsie dans les puits d'une plaque de 96 puits.
  3. Préparer un contrôle négatif constitué par un échantillon de tube non modifié n'est pas traité avec l'anticorps de détection. Préparation d'un anticorps de contrôle constitué d'un échantillon de tube non modifié traité avec l'anticorps de détection. Préparation des échantillons d'essai de tubes modifiés traités avec l'anticorps de détection.
  4. Des échantillons de bloc avec 0,4% d'albumine de sérum bovin (BSA) dans du DPBS pendant 60 minutes à température ambiante sur un agitateur.
  5. Après blocage, aspirer BSA et rinçage avec une solution saline tamponnée au tris plus 1% (TBST) 3x-Tween 20, 10 minutes à chaque fois sur un agitateur.
  6. Préparer une dilution de travail de l'anticorps dans 0,4% de BSA selon la dilution recommandée par le fabricant pour les immunoessais. Diluer l'anticorps CD47 humain-FITC B6H12 1: 100 dans 0,4% de BSA.
  7. Ajouter 200 ul de dilution d'anticorps dans les puits appropriés. Incubatémoins négatifs TE avec 0,4% de BSA seulement. Incuber à température ambiante pendant 60 min sur un agitateur (abri de la lumière).
  8. Rincer avec du TBST 3x, 10 min chacun sur un agitateur. Aspirer le dernier TBST rinçage et ajouter 200 DPBS ul aux puits d'échantillons de tube.
  9. Recueillir le dernier flux continu, qui est un thiol réactif de qualité CD47 recombinant et diluer à un volume nécessaire pour revêtir l'intérieur des tubes avec du DPBS.
  10. Lire FITC intensité de signal en utilisant un lecteur de microplaques avec FITC excitation (485 nm) et d'émission (538 nm) paramètres.
  11. Calculer recCD47 lié à surface polymère sur la base de valeurs standards, ce qui représente pour l'auto-fluorescence et de la liaison non spécifique de l'échantillon de contrôle d'anticorps.

Protocole de Appareil 3. Chandler boucle

Cherchez Institutional Review Board (IRB) l'approbation d'un protocole de collecte de sang et éclairé documents de consentement avant le début de la collecte des échantillons de sang humain. Obtenir infosrmé consentement d'un donneur de sang humain.
REMARQUE: Un diagramme représentant le dispositif est représenté sur la figure 2.

  1. Remplir un bain d'eau avec de l'eau distillée jusqu'à environ 1/2 du diamètre des roues sont submergés. Ajouter suffisamment d'eau de Javel pour le bain d'eau pour obtenir une solution d'eau de Javel à 10%. Set bain d'eau à 37 ° C et laisser s'équilibrer à la température.
  2. Rassemblez adaptateurs métalliques (voir figure 1B), des tubes et des tuyaux non modifiée modifié, et assembler autour des roues de l'appareil, comme le montre la figure 1C. Assurez-vous que le tube est bien ajusté autour de la roue avec l'adaptateur métallique en place.
  3. Obtenir 30 ml d'échantillon de sang en utilisant un protocole approuvé par l'IRB, dans un flacon pré-rempli avec 2 ml de citrate ou un autre anticoagulant, et mélanger par inversion une fois pour empêcher la coagulation de l'échantillon a été collecté.
  4. Ajouter environ 10 ml de sang de chaque tube en utilisant la soupape de métal et d'une seringue, ce qui laisse un peu d'air dans le tube. Fixer le bouchon de la valve et rOtate pendant 3 heures.
  5. Drainer le sang dans un bécher de déchets traités avec une solution d'eau de Javel à 10% (ou tel que requis par la politique institutionnelle).
  6. Rincer délicatement l'intérieur du tube avec du DPBS pour éliminer toute trace de sang. Recueillir accréditives dans le bécher de déchets. Disposer de sang conformément à la politique institutionnelle.
  7. Désinfecter l'appareil et tout contact avec le sang des surfaces en utilisant une solution d'eau de Javel à 10% ou conformément à la politique institutionnelle.
  8. Traitement des échantillons pour la microscopie électronique à balayage ou microscopie à fluorescence comme décrit ci-dessous.

4. microscopie à fluorescence et Comptage des cellules

  1. Préparer un 4% de paraformaldéhyde (PFA) solution (Attention: Effectuez en hotte).
  2. Incuber les tubes dans une solution de PFA à 4% pendant une nuit à 4 ° C.
  3. Après une nuit d'incubation, retirer 4% PFA et rincer films très doucement avec du DPBS.
  4. Couper le tube en sections pour exposer la surface de lumière de coloration.
  5. Stainune section de la tubulure avec quelques gouttes de milieu de montage avec 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 30 min à température ambiante (abri de la lumière). Après coloration, rincer la tubulure très doucement avec du DPBS à réduire signal de DAPI de fond.
  6. L'image en utilisant un microscope à fluorescence équipé d'un filtre DAPI et un appareil photo numérique pour compter le nombre de cellules dans neuf champs de vue sélectionnés en aveugle sous un grossissement de 200X.
  7. cellule d'enregistrement compte par le champ de vision et d'effectuer des analyses statistiques appropriées pour déterminer la signification statistique des résultats.

5. microscopie électronique à balayage

  1. Préparer une solution de glutaraldéhyde à 2% (Attention: Effectuez en hotte).
  2. Incuber les tubes dans une solution de glutaraldéhyde à 2% pendant une nuit à 4 ° C.
  3. Après une nuit d'incubation, rincer délicatement le tube 3x avec du DPBS.
  4. Préparer une solution à 1% de tétroxyde d'osmium (Attention: Grave danger d'inhalation! Utiliser dans une hotte).
  5. Incuber les tubes dans une solution à 1% de tétroxyde d'osmium pendant 15 minutes à température ambiante.
  6. Rincer délicatement le tube 3x avec du DPBS.
  7. Préparer une série de concentrations d'éthanol (25%, 50%, 75%, 95% et 100% d'éthanol).
  8. Déshydrater la tubulure par une incubation dans la série de concentrations d'éthanol. Incuber à 25%, 50%, 75% et 95% d'éthanol pendant 20 min chacun. Incuber à 100% d'éthanol pendant 30 min.
  9. Point supercritique sécher le tube avec du CO 2 pendant 45 min pour éliminer toute trace d'humidité.
  10. Sections de tubes de montage sur un bout de l'échantillon avec de la pâte d'argent ou graphite.
  11. sections de tubes Coat avec 12,5 nm d'or-palladium.
  12. Examiner dans un microscope électronique à balayage.

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Résultats

Génération de surfaces polymères réagissant avec un thiol par l'utilisation de la PDT et TCEP-BzPh avec un groupe thiol réactif recCD47 poly-lysine en utilisant SMCC permet la fixation de recCD47 à des surfaces polymères. Le processus de modification est résumé schématiquement sur ​​la figure 1. L'avantage de ce procédé de modification est qu'elle peut être appliquée à de nombreuses protéines différentes et de nombreuses surfaces polymères différents, en supposant que la protéine peut être modifiée par ...

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Discussion

La chimie de photoactivation (résumé à la figure 1) permet la modification de pratiquement n'importe quelle surface du polymère qui a des hydrocarbures suffisantes pour faciliter PDT-BzPh fixation et l'irradiation UV subséquente de photo-activer la PDT-BzPh. La fonctionnalisation de la surface polymère avec des groupes thiol réactifs permet la fixation ultérieure de toute une série de molécules d'intérêt testables. Dans nos études particulières, nous avons choisi recombinant CD47 11-13....

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Déclarations de divulgation

Recherche présentée dans cette publication a été soutenue par l'Institut national d'imagerie biomédicale et bio-ingénierie, sous le numéro d'attribution R21 EB015612 (SJS) et le National Heart, Lung, and Blood Institute, sous le numéro d'attribution T32 HL007915 (JBS et RJL), de la National Institut de la santé.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
16 % de paraformaldéhyde (PFA)Thermo Scientific58906Attention ! Utilisation dans la hotte 25
 % GlutaraldéhydeVWRAAA17876-AP  ;prudence! Utilisation dans la hotte
2-pyridyldithio,benzophénone (PDT-BzPH)Synthéqué en laboratoireN/A
Albumine sérique bovine (BSA)SigmaA3059-100G
CitrateSigmaS5770-50ML
Appareil photo numériqueLeicaDC500Hors production
Diméthylformamide (DMF)Sigma270547-100MLAttention ! Utilisation dans la hotte
Dulbecco' s Phosphate salin tamponné (DPBS)Gibco/Life Technologies14190-136
Microscope fluorescentNikonTE300
Acide acétique glacialFisher ScientificA38-212Attention ! Utilisation dans la hotte
humaine CD47 (B6H12) &ndash ; Anticorps FITCSanta Cruz BiotechnologySC-12730
Tétroxyde d’osmiumAcros Organics197450050Attention ! Utilisation dans la hotte
Bicarbonate de potassium (KHCO3)Sigma237205-100G
Phosphate de potassium monobasique (KH2PO4)SigmaP5655-100G
Tube PVC (kit de procédure cardiovasculaire)Terumo Cardiovascular Systems60050plupart des tubes de qualité clinique fonctionneront
Scanning Electron MicroscopeJEOLJSM-T330A
Chlorure de sodium (NaCl)Fisher ScientificBP358-212
Lecteur de microplaquesDispositifs moléculairesSpectramax Gemini EM  ;
Sulfo-SMCCSigmaM6035-10MGsensible à l’humidité !
tris (2-carboxyéthyl) phosphine (TCEP-HCl)Thermo Scientific20491
Tween-20Bio-Rad170-6531
Vectashield avec DAPIFisher ScientificH-1200Sensible à la lumière !
Colonnes de dessalage Zeba Spin &ndash ; 7 K MWCOThermo Scientific89891
La

Références

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