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Sondage haute densité fonctionnels des puces à protéines pour détecter les interactions protéine-protéine

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DOI :

10.3791/51872

⸱

2 août 2015

 ,  , 
1Department of Genetics, Stanford University, 2Stanford Center for Genomics and Personalized Medicine, Stanford University

Dans cet article

Résumé

En utilisant des puces à protéines contenant presque toute la S. cerevisiae protéome est sondé pour interrogatoire impartiale rapide de milliers d'interactions protéine-protéine en parallèle. Cette méthode peut être utilisée pour la molécule de protéine-petite, la modification post-traductionnelle, et d'autres dosages in à haut débit.

Résumé

Haute densité des puces à protéines fonctionnelles contenant 4,200 ~ protéines de levure recombinantes sont examinées pour les interactions protéine-protéine kinase en utilisant une protéine de fusion purifiée par affinité de la kinase de levure contenant une étiquette V5-épitope de lecture. Kinase purifiée est obtenue par la culture d'une souche de levure optimisé pour la production de protéines de haute copie hébergeant un plasmide contenant une fusion kinase-V5 construire sous un promoteur inductible GAL. La levure est cultivée dans des milieux restrictive avec une source de carbone neutre pendant 6 heures, suivi par induction avec 2% de galactose. Ensuite, la culture est récoltée et la kinase est purifiée en utilisant des techniques standards de Chromatographie d'affinité pour obtenir une protéine kinase hautement purifiée pour une utilisation dans le dosage. La kinase purifiée est diluée avec un tampon de kinase à une gamme appropriée pour le dosage et les puces à protéines sont bloqués avant l'hybridation avec le microréseau de protéines. Après l'hybridation, les tableaux sont sondés avec des anticorps monoclonaux V5 antiborps d'identifier les protéines liées par la protéine kinase-V5. Enfin, les tableaux sont numérisés à l'aide d'un scanner de puces à ADN standard, et les données sont extraites pour analyse informatique aval 1,2 à déterminer un niveau de confiance élevé définir des interactions des protéines pour la validation aval in vivo.

Introduction

La nécessité de réaliser des analyses globales de biochimie des protéines et de l'activité in vivo de liaison a abouti à l'élaboration de nouvelles méthodes de profilage interactions protéine-protéine (IPP) et les modifications post-traductionnelles de protéomes entiers 1,3-8. Puces à protéines sont fabriqués comme puces fonctionnelles de protéines en utilisant des protéines fonctionnelles pleine longueur 4-6,8,9, ou des puces à protéines analytiques contenant des anticorps 10,11. Ils sont conçus pour contenir une grande densité de protéines disposées sur des lames de microscope avec une variété de compositions chimiques de surface pour faciliter une variété de conditions expérimentales requises pour effectuer biochimique large 12 analyses. Nitrocellulose et de la surface de l'aldéhyde chimies pour la fixation chimique à travers lysine ou fixation d'affinité des méthodes telles que nickel diapositives chélatés pour fixer les protéines et les glutathion His-étiqueté pour la fixation d'affinité entre autres 13.

L'utilisation de puces à protéines fonctionnelles pour détecter les interactions protéine-protéine nécessite l'accès à une bibliothèque de protéine fonctionnelle de haute qualité 14. S. cerevisiae est susceptible de produire une telle bibliothèque à travers le jumelage de haute affinité copie étiqueté constructions de protéines à haut débit avec des techniques de purification chromatographique. La grande majorité du génome de la levure a été séquencé et la quasi-totalité du protéome peut être exprimée à partir d'un plasmide grand nombre de copies pour la purification et l'analyse biochimique 12. Une fois que les protéines sont obtenus et disposés en format de 384 puits, ils sont imprimés sur une lame de microscope permettant une analyse biochimique rapide parallèle multi-paramétrique et l'interrogatoire bioinformatique 8,14-16. microréseaux de protéines ont été utilisées pour les dosages enzymatiques et des interactions avec des protéines, des lipides, des petites molécules et des acides nucléiques, parmi beaucoup d'autres applications. L'accessibilité des protéines sur la surface du protéometableaux rendent prêtent à différents types de détection analytique, y compris immunitaire affinité, résonance plasmonique de surface, la fluorescence et de nombreuses autres techniques. En outre, il permet un contrôle précis de la condition expérimentale où il pourrait être difficile de le faire in vivo.

L'objectif de ce protocole est de démontrer l'usage approprié des puces à protéines fonctionnelles pour détecter les interactions protéine-protéine. Cette application permet à l'analyse biochimique parallèle à haut débit des activités de liaison de protéines en utilisant un analyte hautement purifiée (protéine) d'intérêt. A C-terminal (carboxy-terminale) étiqueté V5-fusion protéine appât d'intérêt est produit à partir d'un plasmide grand nombre de copies dans une souche de levure optimisé pour la purification des protéines. C-terminal marquage assure que la protéine pleine longueur a été traduit. La protéine utilisée dans cette étude est TDA1-V5 protéine de fusion kinase, qui est purifiée en utilisant une résine d'affinité de nickel via un tag His6X. La fusion construc TDA1-V5t est purifié par élution série en utilisant un gradient d'imidazole pour éluer la fraction la plus hautement enrichi destiné à être utilisé dans le dosage.

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Protocole

1. Préparation de la sonde

  1. Culture et purifier les sondes kinase V5-fusion utilisées pour examiner les interactions avec d'autres protéines comme suit:
    1. Utilisez fraîchement striée souche de levure Y258 (MATa pep4-3, his4-580, ura3-53, leu2-3,112) contenant des protéines V5-fusion (exprimé de Gateway vecteur pYES-DEST52). Utilisez la protéine isolée comme sonde sur les puces. Plaque sur la levure synthétique complet-uracile (Sc-Ura) / 2% de dextrose / agar et de croître à 30 ° C pendant 3 jours de culture congelée (-80 ° C glycérol stock).
    2. Inoculer des cultures de démarrage (5-20 ml) à partir d'une seule colonie et de croître pendant la nuit dans Sc-Ura / 2% de dextrose à secouer la plate-forme (220-250 rpm) ou de la roue à 30 ° C.
    3. Le lendemain matin, inoculer 400 ml de la Sc-Ura / 2% de la culture de raffinose avec la culture de démarrage suffisant pour une DO finale 600 de 0,1.
    4. Cultivez les inoculums à DO 600 de 0,6 suivie par induction par le galactose de la fu V5-kinasesion construire expression par addition d'une solution d'extrait de levure 3x / Peptone (YEP) additionné de 6% de galactose, en suffisant pour diluer le support d'induction d'un facteur 3 en ajoutant de sorte que la concentration finale de 2% de galactose est.
    5. Induire les cellules à 30 ° C pendant 6 heures sur une table d'agitation. Utilisez un L Erlenmeyer de 2 pour assurer une aération appropriée.
    6. Récolte des cellules en utilisant un rotor JA-10 (ou comparables), la rotation 400 ml de suspension de cellules à 1000 g pendant 5 min à 4 ° C.
    7. Laver les cellules une fois avec 50 ml de glace tampon PBS froid et transférer dans un tube conique de 50 ml. Laver le culot de nouveau dans un tampon PBS glacé (sans détergents ou d'autres additifs) utilisés pour la lyse et le transfert à 2 ml à bouchon tubes de lyse.
    8. Faites tourner les cellules à 20.000 g pendant 1 min à 4 ° C à une pastille et la pipette loin le tampon.
    9. Placer les tubes sur la glace et passez à l'étape de lyse.
    10. Lyse des cellules (250-350 pi granulés) avec 00,5 mm billes de zircone dans un 1: 1: volume de culot cellulaire, des perles, et une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1 tampon de lyse et le vortex le mélange en utilisant une plate-forme d'agitation 3 fois à intervalles de 2 min à 4 ° C.
    11. Centrifuger le lysat à 20.000 xg dans une centrifugeuse de table pendant 10 min à 4 ° C.
    12. Pipette surnageant dans le tube de centrifugeuse en polycarbonate à haute vitesse et de clarifier par ulracentrufugation pendant 30 minutes à 150 000 g à 4 ° C.
    13. Transférer le lysat clarifié dans un tube contenant de la résine Ni 2+ prélavé d'affinité (~ 100 ul) et incuber sur un nutator pendant 2 h à 4 ° C pour capturer l'histidine (His) 6X protéine étiquetée V5-fusion.
    14. Laver la résine trois fois pendant 10 min à 4 ° C avec le tampon de lavage. Pellet la résine en utilisant une centrifugeuse de table pendant 5 min à 1000 g à 4 ° C et aspirer le surnageant. Ajouter tampon de lavage fraîche pour chaque lavage et retourner le tube du nutator pour l'agitation pendant le lavage.
    15. Après la ste de lavageps sont complets, appliquer la résine lavée à une colonne G-25 frais pour l'élution.
    16. Appliquer 25 pi de tampon d'élution d'une manière par étapes en commençant avec 100 mM d'imidazole à 500 mM d'imidazole 50 mM par incréments pour un total de neuf fractions.
    17. Doser les fractions recueillies en utilisant du gel de dodécylsulfate de sodium et de polyacrylamide (SDS-PAGE) et coloration de Coomassie pour déterminer la fraction (s) le plus fortement enrichi pour être utilisé dans l'essai et ajouter du glycérol à 30% et stocker à -80 ° C jusqu'à utilisation dans le dosage.

2. Sonder les tableaux

NOTE: S'il vous plaît voir l'étape 2.6 de cette section pour préparer la solution d'anticorps avant de commencer l'essai.

  1. Pour détecter les interactions, diluer l'anticorps conjugué V5-fluorophore (c. AlexaFluor 647) à 260 ng / ml dans le tampon de la sonde et mélanger soigneusement par agitation.
    NOTE: Préparer cette solution d'anticorps 30 min avant de les utiliser et placer le tube sur un nutatou ou la roue pour assurer un mélange complet et une suspension homogène d'anticorps.
  2. Diluer la sonde de protéines V5-fusion sur une plage de concentration de 5-500 pg / ml.
    REMARQUE: optimisée pour chaque essai d'interaction protéine-protéine, en utilisant un tampon de la sonde. L'optimisation consiste à ajouter plusieurs sondes pour sonder tampon. Typiquement, 10 ug / ml est utilisée comme point de départ et ajusté en conséquence en fonction de la puissance du signal.
  3. Retirer les puces à protéines du congélateur (-20 ° C) et porter à 4 ° C au réfrigérateur juste avant l'utilisation.
  4. Ajouter un tampon bloquant directement le support de diapositives contenant les micorarrays de protéines et de couvrir le dessus avec du parafilm pour éviter les fuites. Bloquer les tableaux dans un tampon de blocage pendant 1 heure en agitant à 50 rpm sur une scène à 4 ° C.
  5. Après blocage, les ensembles de transférer une chambre humidifiée refroidi à 4 ° C et ajouter 90 ul de sonde diluée directement à la surface du tableau. Superposer l'arrays avec un bordereau de lifter soulevé et incuber statique (sans agitation) dans la chambre humide à 4 ° C pendant 1,5 heures.
  6. Laver les tableaux 3 fois pendant 1 min dans un tampon de chaque sonde dans trois 50 ml tubes coniques. Ajouter la diapositive à tubes coniques contenant un tampon de la sonde pré-réfrigérés assez pour envelopper complètement la diapositive. Laisser le bordereau de levier pour doucement glisser hors de la puce de protéine (ne pas forcer off car cela pourrait entraîner des dommages à la surface de la matrice).
  7. Appliquer la solution d'anticorps directement au tableau immédiatement après avoir terminé le lavage (étape 2.5) et la superposition avec un glissement de levage soulevé comme avant. Incuber les matrices pendant 30 minutes à 4 ° C en chambre humide.
  8. Effectuez la même étape de lavage comme avant (3 fois 1 min dans un tampon de la sonde), et de spin dans un tube conique de 50 ml à 800 xg dans une centrifugeuse de table pendant 5 min à température ambiante. Air-sécher les tableaux dans un support de diapositives dans l'obscurité pendant 30 min avant de balayer le tableau à 647 nm.

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Résultats

L'activité de l'interaction protéine-protéine a été observée à l'aide d'un lecteur de puce standard pour évaluer la TDA1-V5 protéine kinase Construction d'une fusion protéine d'appât contre une puce de protéine fonctionnelle de levure contenant environ 4200 uniques S. cerevisiae des protéines de fusion GST. Nouvel interrogatoire avec le logiciel Genepix révélé une multitude d'événements de différentes intensités de liaison. L'affinité a été évaluée à partir de l'intensité graduelle du signal provenant d'un mono...

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Discussion

Le protocole présenté a été effectuée en utilisant 85 des protéines kinase-V5 de fusion protéine de levure uniques pour comparer l'activité de liaison à travers familles distinctes et liées des protéines kinases de la levure conduisant à l'identification de nouveaux réseaux d'interactions in vivo une kinase. En tant que technologie de profilage protéomique émergents, le développement de High Throughput (HTP) de dépistage du protéome en utilisant des puces à protéines appuyés sur des bibli...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par une subvention du NIH. Les analyses présentées à la figure 1 ont été effectuées par le Dr Joseph Fasolo. Nous remercions le Dr Rui Chen pour ses commentaires utiles.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Boîtes de PétriVWRNC-10747ou extrait de
levure BactoDifco0217-17
Bacto peptoneDifco0118-17
Bacto agarDifco0140-01
DextroseSigmaD9434
RaffinoseSigmaR0514
GalactoseSigmaG0750
Sc-Ura Média de décrochageMP Bio114410622
Petits tubes de cultureVWR/Fisher
Grand erlenmeyerVWR/Fisher
Rotor
Tubes à centrifuger (500 ml)
Tube Falcon (50 ml)VWR/Fisher21008-951
PBS ComprimésSigmaP4417
FastPrep Tubes (tube à bouchon à vis de 2 ml)
FastPrep MachineMP Biomedicals116004500
Zircon BeadsBioSpec11079105
Triton X100SigmaP4417
DTTSigmaD9779
MgCl2SigmaM8266  ;
NaClSigmaS3014  ;
Imidazole (pH = 7,4)SigmaI5513  ;
PMSFSigma93482
Cocktail Complet d’Inhibiteurs (Sans EDTA)Roche11873580001
Cocktail d’Inhibiteurs de Phosphatase 1sigmaP2850
BSASigmaA2153  ;
Tween-20SigmaP1379  ;
ATPSigmaA1852° ;
Incubateur à secousses (30 ° ; C)
Nickel Affinity Resin LifeTechnologiesR901-01
G25 colonneGE life sciences27-5325-01  ;
NutatorVWR/Fisher
SDS-PAGE Gel (NuPage)Life Technologies
Coomassie Blue StainLife Technologies
Monoclonal V5 AntibodyLife TechnologiesR960-25
Alexa647 Taggé monoclonal V5 AntibodyLife Technologies451098
Protein Microarrays KitLife TechnologiesPAH0525013
Genepix ScannerDispositifs
moléculaires Sliper SlipsScientifichttp://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/ Tampon de
lyse : 0,1 % Triton X-100, 0,5 mM DTT,
2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM imidazole (pH 7,4), Cocktail complet d’inhibiteurs de protéase &ndash ; Sans EDTA, inhibiteur de la phosphatase Cocktail 1, 1 mM PMSF  ; (ajouter juste avant l’utilisation)		Ajouter les réactifs à 1 tampon de phosphate de 0,01 M, chlorure de potassium à 0,0027 M, chlorure de sodium à 0,137 M ; pH 7,4) pour obtenir le volume souhaité de solution de lyse
Tampon de blocage : 1 % d’albumine sérique bovine (BSA), 0,1 % de Tween-20Ajouter les réactifs à 1 x PBS pour obtenir le volume souhaité de tampon
de blocageTampon de sonde : 2 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 0,05 % Triton X-100, 50 mM NaCl, 500 &mu ; M ATP (pour les kinases), 1 % BSAAjouter le réactif à 1 x PBS pour obtenir le volume souhaité de tampon de sonde
Tampon de lavage : 0,1 % Triton X-100, 500 mM NaCl, 0,5 mM DTT, 50 mM imidazole (pH 7,4), 2 mM MgCl2le réactif à 1 PBS pour obtenir le volume souhaité de tampon
de sondeTampon d’élution : 0,1 % Triton X-100, 0,5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 &ndash ; 500 mM d’imidazole (pH 7,4), cocktail complet d’inhibiteurs de protéase &ndash ; Sans EDTA, inhibiteur de la phosphatase Cocktail 1, 1 mM PMSF (ajouter juste avant l’utilisation)Avant de commencer, il est important de noter le gradient de concentration de l’imidazole (50 &ndash ; 500 mM) et de créer des tubes séparés pour chaque concentration (il est conseillé de créer l’intervalle en utilisant des incréments de 50 mM). Ajouter le réactif à 1 PBS pour obtenir le volume souhaité de tampon de sonde
3 x YEP + 6 % de galactose : Dissoudre 30 g d’extrait de levure et 60 g de peptone dans 700 ml de H2O, et autoclave. Ajouter 300 ml de galactose 20 % stérilisé (poids/vol) Le galactose ne doit pas être autoclavé
comparable Centrifugeuse JA-10 Thomas Ajouter

Références

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Mots-clés

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