Research Article
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Présenté informatique est un workflow flexible permettant multiplexé analyse basée sur l'image de cellules marquées par fluorescence. Le workflow quantifie marqueurs nucléaires et cytoplasmiques et calcule marqueur translocation entre ces compartiments. Des procédures sont prévues pour perturbation de cellules en utilisant siRNA et la méthodologie fiable pour la détection du marqueur par immunofluorescence indirecte dans des formats de 96 puits.
Les progrès dans la compréhension des mécanismes de contrôle régissant le comportement des cellules dans les modèles de culture de tissus de mammifères adhérentes sont de plus en plus dépendante des modes d'analyse unicellulaire. Méthodes qui fournissent des données composites reflétant les valeurs moyennes des biomarqueurs de populations de cellules risquent de perdre la dynamique des sous-populations qui reflètent l'hétérogénéité du système biologique étudié. Dans cet esprit, les approches traditionnelles sont remplacées par, ou soutenus avec des formes plus sophistiquées de dosage cellulaire développés pour permettre une évaluation par microscopie à haute teneur. Ces analyses génèrent potentiellement un grand nombre d'images de biomarqueurs fluorescents, ce qui a permis en accompagnant des logiciels propriétaires, permet des mesures multi-paramétriques par cellule. Toutefois, les coûts d'investissement relativement élevés et la surspécialisation de plusieurs de ces dispositifs ont empêché leur accessibilité à de nombreux enquêteurs.
Décrit ici est unflux de travail universellement applicable pour la quantification des intensités multiples marqueurs fluorescents provenant de régions sous-cellulaires spécifiques de cellules individuelles appropriées pour une utilisation avec des images de la plupart des microscopes à fluorescence. La clé de ce flux de travail est la mise en œuvre du logiciel Cell Profiler disponible gratuitement 1 à distinguer les cellules individuelles dans ces images, les segmenter en régions subcellulaires définies et livrer l'intensité de marqueur de fluorescence des valeurs spécifiques à ces régions. L'extraction des valeurs individuelles d'intensité de la cellule à partir de données d'image est l'objectif central de ce flux de travail et sera illustrée par l'analyse des données de contrôle à partir d'un écran de siRNA pour G1 régulateurs de points de contrôle dans les cellules humaines adhérentes. Cependant, le flux de travail présenté ici peut être appliquée à l'analyse des données provenant d'autres moyens de perturbation cellulaire (par exemple, les écrans de composés) et d'autres formes de marqueurs cellulaires de fluorescence en fonction et devrait donc être utile pour un large éventail de laboratoires.
Le travail présenté ici décrit l'utilisation du logiciel portable disponible gratuitement Profiler pour effectuer répartition algorithme guidée d'images de microscopie de fluorescence de cellules adhérentes pour identifier des cellules individuelles et des régions subcellulaires définies. Cette approche, appelée segmentation d'image, permet l'analyse multi-paramétrique ultérieur des cellules imagées par la quantification des marqueurs marqués par fluorescence localisées à chaque cellule ou de la région subcellulaire (ci-objets segmentés). Ce flux de travail constitue une base pour permettre une analyse de haut-contenu et est destiné à servir comme un outil qui peut être encore développé et modifié pour répondre multi-paramétrique, cellule individuelle analyses dans les laboratoires, sans accès à des instruments de haut contenu spécialisés ou des logiciels propriétaires. Les fichiers fournis avec ce manuscrit comprennent un ensemble de données d'images brutes pertinentes, les paramètres de l'algorithme et son appui test pour générer l'analyse décrit. Les réglages de l'algorithme fourni fou cellulaire Profiler sont optimisés pour l'ensemble de données d'exemple et les détails de la section Discussion quels ajustements peuvent être nécessaires pour permettre l'utilisation de données d'image d'autres études.
Une fois les données quantitatives a été extrait en utilisant cellulaire Profiler, les laboratoires peuvent avoir des exigences différentes pour savoir comment utiliser l'information présentée par les valeurs des cellules individuelles dans les données brutes; montré ici est une méthode par laquelle les portes sont appliquées aux données brutes pour chaque dosage. L'utilisation de ces portes, les données sont transformées en termes binaires de réponse, permettant la visualisation de l'évolution des traitements différents de liaison avec les sous-populations de cellules subissant une réponse définie par les barrières. Les portes sont fixés en fonction des observations des distributions de données obtenues pour les contrôles négatifs et positifs appropriés pour chaque mesure pertinente. L'utilisation de portes ne est qu'un exemple de la façon de gérer les premières mesures, à base de cellules. Également montré ici est l'utilisation de l'intensité de l'ADN nucléaire moiasurements dans leur forme brute comme une plage continue de valeurs en combinaison avec les données gated. D'autres approches pour la gestion des données d'analyse d'image doivent être envisagés, en fonction de la nature de l'étude; alternatives à l'utilisation de statistiques portes pour affecter les cellules à des sous-populations ont été signalés 2 et systématiques des comparaisons de stratégies pour résumer les données à haute teneur sur un grand nombre de paramètres ont été signalés 3.
Analyses Haute-contenu de données d'image ont trouvé une utilisation dans les études cellulaires de drogues-réponse, la génétique inverse et le stress environnemental signalisation 4-6. Le mérite de tiges analyse à haute teneur du fait que l'analyse algorithmique de données de microscopie à fluorescence permet des paramètres quantitatifs et spatiales à prendre en compte simultanément dans des cellules individuelles 7. De cette manière, les résultats de plusieurs essais cellulaires peuvent être recoupées comportement, de dosage différentiel-dsous-populations de cellules efined peuvent être suivis dans des conditions expérimentales et les essais peuvent inclure l'examen des variables morphologiques. L'analyse des stratégies et des flux de travail a discuté ici, comme pour d'autres approches à haut contenu, sont capables de fournir des données multiplexées qui sont des renvois à des cellules individuelles. Des études de haut contenu méthodes costume qui génèrent des images de microscope à fluorescence et sont applicables à l'analyse des données allant de quelques dizaines d'images produites en microscopie de fluorescence à base conventionnelle faible débit grâce aux milliers d'images produites en utilisant des plates-formes de criblage à haut contenu automatisés.
Le workflow est illustré ici avec des exemples de données à partir de laquelle essais séparés sont mesurés en termes de soit intensités de marqueurs fluorescents nucléaires ou translocation cytoplasmique / nucléaire d'une protéine rapporteur fluorescent, respectivement. Le flux de travail est souple en ce que ces dosages peuvent être considérées séparément ou en combinaison en fonction de l'EACh donnée question de recherche par différents enquêteurs. Les données d'exemple sont produites dans le cadre d'une interférence ARN (ARNi) expérience (Figure 1). Les petits oligonucléotides d'ARN interférents (siARN) sont utilisés pour knockdown protéines spécifiques dans HCT116 cellules de carcinome de côlon humain qui se traduisent par des changements pour deux rapporteurs fluorescents de kinase (CDK) l'activité de la cycline-dépendante. La phosphorylation de la CDK6 dépendante de la protéine du rétinoblastome nucléaire à serine 780 (P-S780 RB1) est évaluée par coloration d'anticorps. Dans les mêmes cellules, un fluorescent reporter vert de la protéine à étiquette de l'activité CDK2 (GFP-CDK2 reporter) est évaluée par sa nucléaire rapport cytoplasmique où en l'absence de l'activité de CDK2 le rapporteur réside dans le noyau et sur les navettes d'activation de CDK2 dans le cytoplasme 8. En outre, l'ADN nucléaire de chaque cellule est coloré en utilisant un colorant intercalant de l'ADN, bisbenzimide, qui sert en tant que moyen pour identifier les cellules et définir les frontières des noyaux dans les images ainsi unemesure de sa abondance de l'ADN de fournir des informations sur la position de cycle cellulaire de la cellule (figure 2).
Les activités de la CDK2 et de la CDK6 peuvent être détectés comme des cellules de transit G1 à la phase S du cycle cellulaire et 5 se succèdent 9,10 et, de ce fait, la concordance étroite entre les deux rapporteurs dans des cellules individuelles est attendue. L'ensemble de données de démonstration utilisée ici analyse comme un exemple de l'effet de siRNA ciblant CDK6, protéine du rétinoblastome (RB1) et un contrôle négatif non-ciblage (tableau 1). Knockdown de CDK6 doit obtenir à la fois une diminution de l'épitope RB1 P-S780 et une accumulation de cellules en phase G1 du cycle cellulaire. Le knockdown de RB1 sert de témoin de réactif pour la spécificité de l'anticorps phospho-S780. Des images de microscopie à fluorescence de la formaline 11 fixés, les cellules de culture de tissu de HCT116 colorées par fluorescence sont utilisés pour l'analyse d'image algorithmique. Les données numériques résultant est ensuite utilisé pourréférence croisée les journalistes et juger de l'impact des différents états knockdown.
La taille potentielle des données produites par ce type d'analyse peut présenter un défi aux outils d'analyse normales. Par exemple, les données de cellules individuelles peuvent être plus grand que certains logiciels de tableur accueillir. Inclus sont des scripts Perl qui effectuent hautement répétitif, de traitement simple, supervisé des données pour faciliter l'analyse de grands ensembles de données. Les scripts Perl sont écrits spécifiquement pour les fichiers de sortie produits par Cell Profiler, lors du traitement des fichiers d'image avec un fichier convention de nommage spécifique (figure 3), et permettent un nombre variable de champs par puits pour être utilisées dans l'analyse. Il est souvent important de données de titrage porte de cellule individuelle pour suivre les tendances dans les sous-populations de cellules 5 et représenté ici est l'utilisation d'un script Perl pour marquer chaque cellule basée sur un ensemble porte prédéterminé pour chaque type d'essai. Sont également inclus les scripts Perl optionnelsqui résument les résultats de données pour des puits individuels (ou conditions), la prestation: pourcentage de cellules dans la grille de jeu et les valeurs moyennes des scores de dosage premières. Ce dernier moyen, plus homogène de la visualisation des données, est valable lorsque des réponses affectent la totalité ou la majorité des cellules à l'intérieur d'un puits. Comme discuté ci-dessus, cette évaluation est moins utile que celle conférée par l'individu déclenchement de données de cellule dans laquelle la réponse est limitée à un sous-ensemble de cellules dans une population.
L'utilité du flux de travail décrite ne est pas limitée à une perturbation par siRNA ou les dosages de marqueurs décrits. Des études ont utilisé cette méthode pour évaluer la réponse dans les expériences de culture de tissu en utilisant des combinaisons de siRNA, inhibiteurs chimiques et des traitements de radiothérapie et d'évaluation des marqueurs autres que CDK6 et l'activité de CDK2 5.
Conceptuellement, la stratégie expérimentale permet une variété de régions subcellulaires biologiquement utiles pour être automatiquement enregistrédans des cellules individuelles présentes dans les images au microscope à fluorescence. En tant que tel, cette approche peut produire des données multiplexées révélant des informations quantitatives, biologique qui peut être manquée par des techniques qui mettent l'accent sur les populations plutôt que des cellules individuelles. Avec des modifications mineures, l'approche et l'analyse flux décrit peut produire des données de cellules quantitatives, individuelles pour toutes les sorties de dosage basés sur la fluorescence et les réponses des cellules biologiques, où l'évaluation quantitative de la teneur en ADN, la quantification de la fluorescence nucléaire ou cytoplasmique ou le mouvement alternatif des marqueurs entre ceux-ci deux compartiments individuellement ou d'une manière multiplexée est d'intérêt. Comme les exigences de publication tendent plus vers la présentation de données brutes librement accessibles, l'accès et la familiarité avec les outils gratuits pour l'analyse d'images de microscopie telles que celles décrites ici sera également un intérêt direct pour les laboratoires qui cherchent à réanalyser les données publiées.
1. expérimentale Perturbation et Cell étiquetage pour les marqueurs de réponse (écran arrière transfection siRNA)
2. Imagerie et segmentation d'images
3. Extraction des données
L'exemple d'images généré en utilisant l'inverse-transfection siRNA protocole de dépistage ont été préparées et analysées avec le logiciel Cell Profiler. Les données brutes numérique résultant est telle que chaque cellule est représentée individuellement, traçables à son image et bien d'origine et mesurée pour plusieurs paramètres d'intensité de fluorescence (figure 6A). Pour chaque cellule identifiée l'intensité moyenne de fluorescence nucléaire pour l'anticorps RB1 P-S780 et l'intensité de l'ADN intégré pour les masques de protection nucléaire de colorant défini ADN sont déterminés. Les valeurs moyennes d'intensité de la GFP pour les régions de noyau et le cytoplasme de chaque cellule sont également enregistrés permettant le calcul de l'énergie nucléaire par rapport fluorescence cytoplasmique du rapporteur GFP-CDK2. En aval de ces fluorescence algorithmique mesures d'intensité on utilise ces données de cellules individuelles pour définir des grilles pour les deux essais, la coloration d'anticorps nucléaire et CDK2-GFP rapporteur. Annotation ultérieure des cellules sur ee base des résultats dosage et l'utilisation de ces étiquettes pour permettre à des sous-populations spécifiques devant être en outre caractérisé par une troisième mesure (teneur en ADN nucléaire) est décrit.
parcelles histogramme des données d'intensité de fluorescence brutes recueillies pour chaque essai sont un moyen efficace d'évaluer comment les sous-populations de cellules se comportent dans des conditions différentes. Les histogrammes de la figure 6B montrent les distributions de population de données cellulaires individuels de puits en triple pour chaque condition knockdown ARNi. Pour la gauche sont les données pour l'intensité d'anticorps nucléaire et sur le droit sont les données correspondantes pour le rapporteur GFP-CDK2. Les données d'anticorps RB1 P-S780 révèle que les cellules existent largement dans deux populations à l'égard de cette modification post-traductionnelle et que les populations de cellules avec une perte de RB1 phosphorylée sur S780 peuvent être distingués en tant que pic de gauche de l'intensité nucléaire qui est enrichie quand CDK6 est renversé par siRNA. Cette même pic gaucheest vu quand RB1 se est la cible ARNi, reflétant la suppression pure et simple de la protéine et donc P-S780 RB1 coloration. En revanche, les mêmes conditions expérimentales pour les mêmes cellules, lorsque observée par l'intermédiaire du dosage de rapporteur GFP-CDK2, présentent une dynamique différente dans les données de cellules individuelles. Une distribution continue est observée, avec un seul pic, mais siRNA qui perturbe le cycle cellulaire (siCDK6) et provoque l'accumulation dans les résultats de la phase G1 dans une extension de l'épaule droite de cette distribution (ce est à dire indiquant la présence accrue des cellules présentant une augmentation du ratio de la GFP nucléaire / cytoplasme, tracé sur l'axe X).
On voit également sur les histogrammes de la figure 6B sont des valeurs de grille (barres verticales) qui sont choisis sur la base des distributions de deux ensembles de données d'essai. La règle utilisée pour les données d'anticorps RB1 P-S780 est de définir la position de grille comme la demi-hauteur: la position de largeur maximale sur l'épaule gauche de la principale(À droite) de pointe lors de l'examen des données négatives de cellules de contrôle (non-ciblage siRNA). Données souligné rouge sont des cellules avec réduite et absent RB1 P-S780, qui sont identifiés avec cette porte. Une porte similaire placé sur l'épaule opposée de la distribution de valeur de rapport est utilisé pour le rapporteur GFP-CDK2. Les cellules de la sous-population à ratio élevé résultant, qui manquent ou la fonction réduction de l'activité de CDK2, sont indiquées en vert. Pour illustrer l'analyse multiplexée des deux dosages Figure 6C montre la mise en œuvre des deux valeurs de grille en utilisant le script 2_gate_classifier.pl perl pour convertir les données brutes (figure 6A) dans le fichier annoté ci-dessous. Ce nouveau fichier comprend des données d'origine le long d'une nouvelle colonne d'étiquettes de classe pour chaque cellule et les deux valeurs de grille utilisés pour les distinguer (dans ce cas des portes de 0,004 pour les données d'anticorps et 1,5 pour le rapporteur GFP-CDK2 ont été utilisés, respectivement) .
Ayant classé les cellules individuelles From chaque condition knockdown sur la base des deux essais, il est maintenant possible d'utiliser ces étiquettes de classe pour aider l'annotation de parcelles de données de titrage. La figure 7 montre dispersent parcelles de données cellulaires individuelles pour le P-S780 RB1 et GFP dosages de CDK2 de l'ensemble pour les trois conditions ARNi données d'exemple. Numéros annoter les quadrants sur les diagrammes de dispersion montrent les pourcentages relatifs de chaque sous-population fermée à l'ensemble de ce contexte d'effet de choc et sont générés dans la R en utilisant les étiquettes de classe décrites ci-dessus. Ces courbes montrent que, par rapport aux cellules transfectées avec des non-ciblage siRNA (figure 7B), les cellules transfectées avec siCDK6 révèlent une distribution de données net déplacé à la fois vers le bas sur l'axe des Y (indiquant l'absence d'RB1 phosphorylation sur la serine 780) et à droite, sur l'axe X (ce qui indique une faible activité de CDK2, Figure 7C). Ces deux changements sont attendus pour effet de choc de cet objectif. Contrairement à cela, les données de SirB1 cellules transfectées (figure 7A) montrer une perte de la coloration d'anticorps conforme à la perte de l'épitope, mais peu d'effet dans la distribution de données pour le journaliste de CDK2 par rapport aux témoins transfectées avec non-ciblage siRNA, suggérant l'absence de grand effet sur la GFP journaliste -CDK2 découle de RB1 knockdown.
Pour explorer davantage l'utilisation des données de la cellule individuelle, la classification des sous-population et le multiplexage dosage figure 8 montre le diagramme de dispersion pour les données siCDK6 de profils d'histogramme Figure 7C aux côtés appariés pour l'intensité de l'ADN intégré. Les paires d'histogrammes concernent moitiés opposées de l'ensemble de la population, répartis sur la base de l'intensité soit d'anticorps (de droite du diagramme de dispersion) ou GFP-CDK2 valeurs de rapport rapporteurs (au-dessus du nuage de points). La quantification de l'intensité de l'ADN nucléaire de ces populations montre deux pics caractéristiques de 2N et 4N teneur en ADN comme des pics de gauche et de droite, respectivement. Le intentions des grilles représentées sur les figures 6, 7 et 8 sont telles que les cellules identifiées comme faible pour P-S780 RB1 (marqué P-S780-) ou avec une forte valeur de rapport à partir du rapporteur GFP-CDK2 (marqués: G1) seront être en phase G1 du cycle cellulaire. En effet, les histogrammes de profils d'ADN pour les sous-populations identifiées avec l'une de ces essais contiennent principalement des cellules avec l'ADN contenu 2N. profils ADN de la population opposée fermée (étiquetés: P-S780 + ou non-G1) contient des cellules avec des distributions allant de 2n à 4N, en accord avec ces cellules adoptant une gamme de cycle cellulaire positionne phase post-G1.
Bien que l'accent ici a été la génération et l'analyse des données de cellules individuelles à partir d'images colorées par fluorescence, il est également utile d'être en mesure de prendre ces données et résumer chaque essai sur une base bien par puits pour surveiller la variabilité entre les répétitions et la performance de tous les puits pour un essai donné dans l'ensemble une plaque de données. A) les données de RB1 et B P-S780) les données rapporteurs GFP-CDK2. Les valeurs tracées dans A et B sont produits par deux scripts Perl supplémentaires fournies avec ce manuscrit; 'Antibody_fluorescence_summary.pl »et« G1assay_summary.pl', respectivement. Ces scripts utilisent les données brutes créées par Profiler cellulaire (Nuclei.csv) et les données du rapport ainsi que par i) cellules totales mesurées par puits, ii) le nombre de cellules dans la porte, iii) pourcentage de cellules dans la porte et iv) la moyenne arithmétique moyenne des données brutes, mesurées pour ce puits. Ce est inclus comme une option appropriée pour la recherche sur de vastes ensembles de données d'essai, avant de se concentrer sur les données individuelles de traitement utilisant l'évaluation des données multiplexé de cellules individuelles comme illustré dans 8. Les graphiques affichés ici complot »iii) pourcentage de cellules au sein de la porte» pour les deux dosages, qui conviennent les distributions de données non-normales observées pour les données de P-S780 RB1 et GFP-CDK2 dans les histogrammes de la figure 6B. Ces scripts calculent aussi 'iv) la moyenne arithmétique des données brutes, mesurées pour ce bien », qui conviendrait à l'analyse des données pour les réactions des populations homogènes et de la distribution normale des données avant et après la perturbation expérimentale.
Figure 1:. Vue d'ensemble des étapes du flux de travail pour l'analyse quantitative des données d'image de microscope marquées par fluorescence Le workflow est représenté ici comme quatre étapes (A) d'abord, il est nécessaire de préparer expérimentalement des cellules pour l'imagerie de fluorescence.. L'exemple décrit ici est celui d'uneécran dans lequel les cellules tumorales humaines adhérentes siARN traités sont cultivées pendant 48 heures, fixées et colorées sur une plaque de culture de tissu à 96 puits. Conditions ARNi différents sont présents en triple exemplaire dans des puits séparés dans la plaque. Les cellules sont colorées avec un colorant d'ADN, un anticorps spécifique pour RB1 phosphorylée sur la CDK4 et 6 sélectif site cible sérine-780 (P-S780 RB1) et ils ont aussi exprimer de manière stable un GFP-CDK2-reporter, les rapports de sortie du cycle cellulaire de G1. Collectivement, ces sondes fluorescentes constituent deux dosages évalués séparément dans le flux de travail. (B) images de microscope parallèle pour chaque sonde fluorescente (canal) sont générés et nommés de manière à inclure des détails par lequel le logiciel d'analyse d'image peut organiser les données. (C) Le fichiers d'images sont chargées dans le logiciel Cell Profiler, qui identifie algorithmique cellules individuelles et les paires associées de noyaux et le cytoplasme avant de céder mesures d'intensité pour les trois sondes fluorescentes détectented dans chaque. (D) Enfin, un script Perl est utilisé pour organiser les données quantitatives brutes produites. Cette étape se applique portes aux données d'intensité de fluorescence pour chaque cellule, binning efficacement les cellules en sous-populations, qui peuvent être tracées, suivis et contre-interrogé. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Les données expérimentales à obtenir par analyse d'image, Les siRNA-traitées, les cellules marquées par fluorescence fixes de l'ensemble ont été imagées et des mesures d'intensité correspondantes prises par cellule données d'exemple.. Des données d'image représentatives sont indiquées pour chaque paramètre enregistré lors de l'analyse de l'image d'intensité (A) ADN nucléaire. L'intensité de la coloration du colorant de l'ADN nucléaire est utilisée pour donner une mesure de l'ADN par noyau (B) Intensité nucléaire de phospho-RB1:. Immuno-coloration spécifique pour P-S780 RB1 l'aide d'un (noir) anticorps primaire et fluorescence marqués anticorps secondaire (rouge) permettent une mesure d'intensité de RB1 phosphorylation au . S780 par noyau (C) GFP-CDK2 journaliste: Les cellules utilisées exprimer de façon stable une protéine rapporteur GFP-tagged que translocation entre le noyau et le cytoplasme dans un modèle d'ensemble avec le cycle cellulaire. Double mesure de l'intensité de la GFP nucléaire et cytoplasmique couplé pour chaque cellule permet le calcul d'un rapport par cellule qui peut être utilisée pour distinguer la phase G1 du reste du cycle cellulaire. Trois cibles d'ARNsi seront utilisés pour illustrer l'analyse; un non-ciblage siRNA contrôle négatif; CDK6 siRNA comme témoin positif dans RB1 perturber la phosphorylation et la progression du cycle cellulaire; RB1 siRNA pour établir la spécificité des anticorps.k "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Organisation des fichiers image avant l'analyse d'image Les images prises à partir de la plaque de culture de tissus sont nommés systématiquement afin de permettre le logiciel d'analyse d'image de relier les données d'image replacer dans le contexte expérimental original.. Cette information est placée dans le nom du fichier pour chaque image. (A) Comme chaque puits sur la plaque d'expérimentation peut correspondre à différentes cibles ou traitements ARNi, les formes d'adresse et une partie du nom de fichier. (B) Le numéro de l'image fait partie du nom de fichier . que chaque puits est imagée pour recueillir multiples, non-chevauchement des cadres (C) sondes fluorescentes de chaque trame sont imagés séparément; par conséquent, les noms de fichiers doivent également refléter le canal chaque image se rapporte. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4:. L'utilisation de cellules Profiler pour mesurer l'ADN nucléaire et la coloration des anticorps Avec les paramètres dans le fichier fourni de pipeline (3_channels_pipeline.cppipe), les valeurs d'intensité des mesures de logiciels d'analyse d'images de fluorescence cellulaire de Profiler pour l'ADN nucléaire et anticorps contraignant relatif à des cellules individuelles . (A) Les noyaux sont identifiés dans l'image de canal «bleu» de l'ADN coloré. (B) < / Strong> Les positions des noyaux d'ADN colorées sont détenues temporairement dans un «masque noyaux». Le masque est ensuite noyaux superposé à (C) les images bleues et rouges canal (ADN et de fluorescence de l'anticorps de données, respectivement) et les valeurs de fluorescence à partir de segments d'image qui se chevauchent avec le masque sont enregistrés contre chaque cellule identifiée. Identification réussie des noyaux voisins séparés, peut être évaluée visuellement à l'apparence du masque noyaux. Pour illustration, montré encerclé dans cette image de masque, sont des exemples où les paramètres choisis pour l'algorithme ont mis-identifiés noyaux voisins comme un seul noyau. Réglage des paramètres de l'algorithme pour minimiser ces événements est introduite dans la section Discussion. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 5: Utilisation de la cellule pour mesurer les intensités de profils GFP nucléaires et cytoplasmiques La CDK2 rapporteur GFP-tagged translocation entre le noyau et le cytoplasme en fonction de la position du cycle cellulaire des cellules.. En même temps que cellule Profiler calcule les ADN et d'anticorps intensités nucléaires par cellule (figure 4), on calcule également le nucléaire à taux de cytoplasme des intensités GFP pour chaque cellule. (A) Les données ADN de colorant pour chaque image est utilisé pour générer un masque noyaux. (B) Cell Profiler utilise le masque de noyaux en liaison avec l'image de la GFP à partir du rapporteur GFP-CDK2 pour ensemencer la position de chaque cellule puis se dilate au périmètre de chaque cellule pour estimer l'ensemble de l'empreinte de chaque cellule. Cela devient une nouvelle, «masque cellulaire '. (C) Le masque de noyaux est soustrait du masque cellulaire pour obtenir une série de forme de beignet de cytoplasme contours, qui deviennentle «masque cytoplasme». (D) Le masque et le cytoplasme masque noyaux sont utilisés par Cell Profiler pour mesurer paires de valeurs de GFP nucléaires et cytoplasmiques. Ces valeurs appariées sont ensuite utilisés par Cell Profiler pour calculer les ratios, qui informent à la position de chaque cellule dans le cycle cellulaire. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6:. Extraction des données - Traitement des données brutes de cellules individuelles en imposant des portes sur l'évolution des valeurs de dosage biologiques à partir des données de cellules individuelles pour la coloration d'anticorps et des dosages de rapporteur GFP CDK2 sont extraites en utilisant les données bloquées. Histogrammes des données brutes permettent d'identifier des valeurs de grille appropriés. Elles sont ensuite imposées avec un script Perl. (A) Leproduit de l'analyse des fichiers d'image avec les paramètres fournis pour cellulaire Profiler final sont séparées par des virgules valeur (.csv). Ces fichiers C ontain données individuelles de cellules relatives à chacun des différents segments de sous-cellulaire. Le fichier 'Nuclei.csv' contient toutes les mesures sélectionnées relatives à l'utilisation du masque noyaux. Ces mesures comprennent l'intensité des anticorps nucléaire, l'intensité de l'ADN nucléaire, et le rapport de la GFP (noyau / cytoplasme). (B) histogrammes d'intensité d'anticorps nucléaire (à gauche) et les rapports de rapporteurs GFP-CDK2 (à droite) tracée à partir des données de cellules individuelles pour chaque état knockdown siARN . Les barres sur les histogrammes affichés montrent les positions de départ désirées pour ces essais. Des données de couleur sur les histogrammes indiquent les sous-populations gated. (C) Les portes pour les deux essais illustrés dans B sont appliquées aux données brutes en utilisant le script Perl «2_gate_classifier.pl '. Le scriptcrée une copie modifiée du fichier de sortie d'origine Cell Profiler (Nuclei.csv) pour aider tracer par la suite. Les deux valeurs de grille sont enregistrés dans le nouveau fichier (surligné en couleur ici) et une nouvelle colonne «Label» est ajouté. Le bac étiquettes chaque cellule dans l'une des quatre sous-groupes possibles en fonction des deux valeurs de dosage bloquées pour chaque cellule. Ces étiquettes sont utilisées dans les parcelles suivantes qui disposent calculs des contributions de chaque sous-population ainsi que le recoupement des paramètres supplémentaires générés dans Cell Profiler. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7:. Les diagrammes de dispersion pour chaque condition siRNA représentant les données brutes de cellules individuelles et les positions de grille Scatter parcelles de individouble données cellulaires à partir de toutes les images pour les conditions siARN indiqué: (A) siRB1; (B) de commande de ciblage Sinon négative; (C) siCDK6. Complotèrent contre les axes Y sont des valeurs de fluorescence nucléaire de l'anti-P-S780 RB1 coloration. Comploté contre les X-axes sont les valeurs de rapport correspondantes calculées à partir du rapporteur GFP-CDK2. Les barres rouges et vertes indiquent les positions des portes pour la porte de la RB1 P-S780 et les portes rapporteurs GFP-CDK2, respectivement. Les deux grilles des cellules se divisent en quatre sous-populations et les nombres résultants sur les quadrants représentent le nombre de cellules de pour cent de chacun de ceux-ci. Annotations autour des axes pour A indiquent les quatre étiquettes-éléments possibles appliquées à chaque cellule par le 2_gate_classifier.pl script Perl. Ces étiquettes sont représentés par rapport à leur grille respective de dosage et sont utilisés dans le R-écriture (analysis.r) pour générer les tracés des figures 6, 7 et Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 8: cellulaires sous-populations définies par les deux dosages de transit G1 montrent profils 2N et 4N ADN en accord avec dosage résultats Le nuage de points de données pour les cellules siCDK6 est répété à partir de la figure 7C.. Entourant le nuage de points sont des histogrammes pour intégrée intensité de l'ADN nucléaire relatif à des sous-ensembles de la population. Ceux au-dessus du nuage de points se rapportent à l'essai rapporteur GFP-CDK2. Ceux à la droite de la nuage concernent nucléaire phospho-RB1 anticorps mesures seuls. Les lignes de grille de couleur sont étendues à montrer leur relation avec les histogrammes. Étiquettes porte par laquelle les données de la cellule ont été sélectionnés pour ces parcelles supplémentaires sont également présentés. Les cellules avec perte de RB1 phosphorylée sur des sérine 780 (P-S780-) ou ceux avec une GFP-CDK2 journaliste nucléaires de haute ratio cytoplasmique (indiquant une faible activité de CDK2) montrent des profils d'ADN principalement 2N-like, alors que leurs homologues opposées pour chaque dosage respective montrer une distribution de 2N et 4N, caractéristique d'un, post-G1 population de phase mixte de cellules. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 9: Résumé des parcelles de valeurs de dosage pour chaque gated siRNA état parcelles de données Résumé de gated (a) P-S780 données RB1 et données (B) GFP-CDK2 de puits en triple pour chaque condition knockdown. SiRNA. Les valeurs ont été calculées à partir de la sortie brute de Profiler cellulaire (Nuclei.csv) en utilisant leScripts Perl, 'antibody_fluorescence_summary.pl' (A) ou «G1assay_summary.pl '(B). Les valeurs tracées sont des moyens de le pourcentage de cellules au sein de la grille appliquée à chaque dosage. Les barres indiquent les erreurs-types calculées à partir des puits en triple. , Les valeurs homoscédastiques test t non apparié P pour chaque condition knockdown par rapport à la non-ciblage siRNA sont indiquées ci-dessus les données tracées où P <0,001 (**) et P <0,05 (*). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure S1. Mise en place logiciel Cell Profiler pour l'analyse d'image. (A) Screenshot of Cell Profiler avant les paramètres d'analyse d'images sont saisies. (B) Screenshot of Cell Profiler après les détails de l'algorithme contenues dans '3_channels_pipeline.cppipe' ont été chargés. La haute onglet allumé dans le coin supérieur gauche indique que cet écran affiche les paramètres pour l'étape "loadImages» de l'analyse. En cliquant sur les autres parties de la liste ci-dessous cela révéler les détails pour les étapes ultérieures de l'analyse. (C) Screenshot of Cell Profiler avec des détails pour dossier d'entrée et de sortie de dossier est entré. (D) Screenshot of Cell Profiler après la «Analyser le bouton de images a été cliqué pour commencer l'analyse. Superposées sont trois nouvelles fenêtres illustrant les masques algorithmique-produits générés par le logiciel à partir des images en cours d'analyse. Ces fenêtres sont accessibles en cliquant sur les icônes «oculaires» à la position ouverte à côté des mesures pertinentes dans l'analyse, dans le coin supérieur gauche de la fenêtre principale Cell Profiler. Ces vues permettent à l'utilisateur de vérifier si les paramètres générant les masques confettis de couleur en accord avec les données en niveaux de gris, d'accompagnement d'origine.
ent "> Figure S2. L'utilisation de Perl et RStudio aux données de cellule individuelle de grille et de tracer les sous-populations de cellules qui en résultent. (A) Le panneau de droite montre le dossier choisi de recevoir les dossiers de la sortie (icônes vertes) de l'analyse cellulaire de Profiler. Les scripts Perl fournis avec le manuscrit (icônes bleues) sont copiés dans ce dossier. surbrillance est le script Perl «2_gate_classifier.pl», qui a été double-cliqué avec la souris pour produire la boîte de dialogue dans le panneau de gauche. indiquées sont les invites et réponses correspondant tapé nécessaires à la porte les données de cellules individuelles à partir du fichier 'Nuclei.csv'. (B) Capture d'écran de RStudio immédiatement après le chargement du script 'analysis.R'. surbrillance sont les commandes de télécharger les données de A gated dans le logiciel avant de traçage (détails de notes dans les lignes 5 et 6 devra être ajustée en fonction de l'endroit où les données fermée se trouve sur le calculr utilisé pour l'analyse). (C) Capture d'écran de RStudio fois que les données ont été téléchargées. (D) Capture d'écran de RStudio démontrant souligné le bloc de code requis pour produire le tracé affiché dans la fenêtre en bas à droite. Codes pour chaque parcelle sont séparés par des lignes vides et regroupés par type de tracé.| cible siRNA | Plaque de puits adresses |
| Non-ciblage (NT) | E5, F5, G5 |
| Rétinoblastome (RB) | E7, F7, G7 |
| Kinase cycline-dépendante 6 (CDK6) | B2, C2, D2 |
Tableau 1: Well adresses et conditions siARN correspondants utilisés dans l'ensemble de données d'exemple.
Les auteurs ne ont rien à divulguer
Présenté informatique est un workflow flexible permettant multiplexé analyse basée sur l'image de cellules marquées par fluorescence. Le workflow quantifie marqueurs nucléaires et cytoplasmiques et calcule marqueur translocation entre ces compartiments. Des procédures sont prévues pour perturbation de cellules en utilisant siRNA et la méthodologie fiable pour la détection du marqueur par immunofluorescence indirecte dans des formats de 96 puits.
Ce travail a été financé par des subventions CRUK 15 043 et 14 251 CRUK.
Nous remercions Daniel Wetterskog et Ka Ho Kei pour l'assistance technique et la lecture critique du manuscrit.
| SiRNA à contrôle négatif AllStars | Qiagen | 1027280 | SiRNA à contrôle négatif. |
| CDK6 siRNA | Dharmacon/ Synthèse personnalisée | NA | Séquence antisens : 5' CUCUAGGCCAGUCUUCUUCUU |
| RB1 siRNA | Dharmacon/ Synthèse personnalisée | NA | Séquence antisens : 5' GGUUCAACUACGCGUGUAATT |
| 5x tampon siRNA | Thermo Scientific | B-002000-UB-100 | À diluer avec de l’eau traitée sans nucléase et non DEPC. |
| Eau sans Nulcease (non-DEPC) | Applied Biosystems | AM9937 | Pour la dilution du tampon siRNA. |
| Hiperfect | Qiagen | 301705 | Transfection lipidique. |
| DMEM | Life Technologies | 41966052 | milieux de culture tissulaire enrichis en pyruvate et en glucose. |
| Plaque de culture tissulaire 96 puits | Falcon | 3072 | Plain, plaque de culture tissulaire 96 puits pour le mélange parallèle et compartimenté de complexes de transfection. |
| Packard Viewplate | Perkin Elmer LAS | 6005182 | plaque TC à 96 puits avec base optique sur laquelle les cellules sont transfectées, cultivées, fixées et finalement imagées. Fourni avec des joints de plaque adhésifs opaques, qui sont utilisés lors du stockage des plaques usagées. |
| Membrane respirante | Alpha Labs | LW2783 | Membrane adhésive stérile, perméable aux gaz. |
| Fixateur de formol tamponné neutre, 10 % | Sigma-Aldrich | HT5012-1CS | 10 % de formol (4 % de formaldéhyde) utilisé pur dans le protocole. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100PC | Détergent |
| [en-tête] | |||
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | Base Trizma (tris(hydroxyméthyl)aminométhane) |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Pour solution de lavage des plaques. |
| Anticorps anti-P-S780 RB1 | Abcam | ab32513 | Monoclonal de lapin |
| AlexaFluor647 Anti-lapin | Invitrogen | A21245 | Anticorps secondaire fortement adsorbé par adsorbage croisé, marqué par fluorescence. |
| Hoechst 33342 (Bisbenzimide) | Sigma-Aldrich | B2261 | Colorant d’ADN fluorescent, intercalant la chromatine. |
| Solution de perméabilisation | NA | NA | 0,1 % Triton X-100 en solution saline 50 mM tamponnée Tris, pH 8,0. |
| Solution de lavage des plaques | NA | NA | Solution saline tamponnée au Tris contenant 0,1 % de Tween-20. |
| Solution en bloc | NA | NA | 5 % de lait en poudre dans une solution saline tamponnée au Tris et 0,1 % Tween-20. Pour le blocage de la plaque avant l’immuno-coloration et la dilution des anticorps. |
| Cell Profiler 2.1 | Broad Institute | http://www.cellprofiler.org/download.shtml | |
| Active Perl Community Edition | ActiveState | http://www.activestate.com/activeperl/downloads | |
| R environnement de programmation | The R Foundation | http://www.r-project.org | |
| Rstudio | Rstudio | http://www.rstudio.com/ | |
