Protein Isolation du développement embryonnaire Souris Coeur Région Valve

Résumé

L’analyse de l’expression des protéines dans les jeunes valves embryonnaires de souris a été entravée par le tissu limité disponible. Ce manuscrit fournit un protocole pour la préparation de protéines à partir de régions valvulaires embryonnaires de souris en développement pour l’analyse par transfert Western.

Résumé

L’analyse par transfert Western est une technique couramment utilisée pour détecter et quantifier les niveaux de protéines. Cependant, pour les petits échantillons de tissus, cette méthode d’analyse peut ne pas être suffisamment sensible pour détecter une protéine d’intérêt. Pour surmonter ces difficultés, nous avons examiné des protocoles d’obtention de protéines à partir de valves cardiaques humaines adultes et avons modifié ces protocoles pour les homologues embryonnaires précoces en développement. En bref, les régions de la valve aortique embryonnaire de souris, y compris la valve aortique et la paroi aortique environnante, sont collectées dans le volume minimal possible d’un tampon de lyse à base de Tris avec des inhibiteurs de protéase. Si nécessaire, selon la stratégie de reproduction, les embryons sont génotypés avant de regrouper quatre régions de la valve aortique embryonnaire pour l’homogénéisation. Après homogénéisation, un tampon d’échantillon basé sur SDS est utilisé pour dénaturer l’échantillon afin de l’exécuter sur un gel SDS-PAGE et de l’analyse ultérieure par transfert Western. Bien que la concentration en protéines demeure trop faible pour être quantifiée à l’aide d’essais de quantification des protéines par spectrophotométrie et qu’il reste de l’échantillon pour des analyses ultérieures, cette technique peut être utilisée pour détecter et semi-quantifier avec succès les protéines phosphorylées par transfert Western à partir d’échantillons groupés de quatre régions embryonnaires de la valve aortique de souris du jour 13,5, chacune produisant environ 1 μg de protéines. Cette technique sera bénéfique pour l’étude de l’activation de la voie de signalisation cellulaire et des niveaux d’expression des protéines au cours du développement précoce de la valve embryonnaire de souris.

Introduction

Etre capable d'identifier et de quantifier les niveaux d'expression de protéine est une technique standard pour animale et des expériences basées sur des cellules. Cependant, malgré un intérêt de longue date dans le développement de valve cardiaque embryonnaire précoce, l'évaluation de l'expression des protéines dans ce tissu spécifique au cours du développement est actuellement limité à l'immunohistochimie à la fois le poussin et ^1,2 de la souris. Une partie de la difficulté à quantifier l'expression des protéines dans les soupapes de développement de la plupart des organismes modèles (par exemple, poulet et de souris) est la petite taille des vannes, ce qui limite la quantité de protéine qui peut être obtenue. Ainsi, pour des analyses quantitatives, les chercheurs s'appuient généralement sur ​​l'extraction de l'ARN et l'amplification de la PCR quantitative ultérieure ou l'analyse des microréseaux ^2-5. Cependant, les niveaux d'expression d'ARN et de protéines ne sont pas entièrement corrélative ^6, donc en mettant l'accent sur ​​l'expression de l'ARN ne peuvent pas fournir un compte rendu rigoureux des nombreux changements qui se produisent dans toute signalisation donnévoie à différents moments de l'évolution. Sur la base de cette limite dans la méthodologie actuellement disponibles, l'objectif de cette procédure était de développer un protocole pour obtenir de manière fiable des quantités suffisantes de protéine à partir de la souris embryonnaire régions de valve cardiaque en développement pour l'analyse quantitative des changements qui se produisent dans différentes voies de signalisation qui sont importantes dans la maturation de ce tissu.

Vannes embryonnaires sont déjà couramment disséqués de souris pour l'isolement de l'ARN et l'analyse ultérieure gène d'expression ^2-5. Toutefois, ces études ont été limitées à l'utilisation de l'expression des gènes en tant que sortie de lecture de signalisation activation de la voie, ce qui ne permet pas la détection de détecter des modifications post-traductionnelles des protéines qui sont susceptibles d'affecter la signalisation en aval. En utilisant les techniques d'isolation de l'ARN comme un point de départ, nous avons commencé par disséquer les régions d'intérêt. Parce que notre intérêt détectait protéines phosphorylées qui sont des indices de pat signalisationHway activité pendant une période spécifique du développement de la valve aortique (E13.5-14.5), on a effectué toutes les dissections dans du tampon Tris-phosphate libre et recueilli les soupapes dans un tampon de lyse à base de Tris avec des inhibiteurs de phosphatase et protéase. Dans notre cas particulier, que les régions de la valve aortique ont été recueillies, mais la région de la valve pulmonaire peuvent facilement être obtenues en même temps. Les régions de soupapes sont ensuite homogénéisé et combiné avec un tampon d'échantillon qui est actuellement utilisé pour étudier l'expression des protéines dans les valves cardiaques adultes ^7. En utilisant des volumes d'échantillon de petite taille (par exemple, 2 pi) et la mise en commun des régions de soupape à partir d'embryons avec le même génotype, nous avons pu détecter des protéines phosphorylées et non phosphorylés à jour embryonnaire 13,5 ^8. Étant donné que les régions de la vanne peuvent être congelés et stockés dans un tampon de lyse, les embryons peuvent être génotypés si nécessaire avant la mise en commun.

Cette technique élargit l'ensemble des outils qui sont disponibles pour l'évaluation signalin cellulaireg voies au cours du développement et fournit un compliment quantitative de l'immunohistochimie, en particulier pour les valves cardiaques en développement. Cette technique devrait être bénéfique non seulement pour les cardiologues de développement, mais aussi à tous les biologistes du développement qui travaillent avec des embryons de stade précoce sont intéressés dans les régions qui contiennent des tissus limitée.

Protocole

NOTE: Toutes les expériences ont été approuvées par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle à l'Université de Caroline du Nord à Chapel Hill.

1. accise de la valve aortique

1. En utilisant une technique d'euthanasie approuvé pour le stade embryonnaire d'intérêt, euthanasier une souris enceinte de chiots à la journée embryonnaire souhaitée (E) de développement.
2. Utiliser 70% d'éthanol pour stériliser l'abdomen de la femme enceinte. Soulevez la peau et les muscles du bas-ventre et à l'écart des organes internes, et de disséquer cavité abdominale inférieure ouverte la femme de permettre l'accès à la corne utérine.
3. Pour récupérer la corne utérine, maintenez le col avec une pince et caudale soigneusement découpées à la pince. Soulevez la corne utérine, la coupe de tout le tissu conjonctif qui maintient la corne en place, et terminer la suppression en coupant la jonction de la corne de l'utérus avec l'oviducte.
4. Placez la corne utérine disséqué dans un col boîte de Pétri contenantd 0,1 M de tampon Tris (pH 7,6) et rincer au besoin. Ensuite, couper la corne utérine ouverte sens de la longueur pour exposer les sacs embryonnaires.
5. Pour exposer l'embryon, couper ouvrir un sac embryonnaire à la jonction du placenta et de l'embryon et couper les vaisseaux ombilicaux pour libérer l'embryon. Placez l'embryon disséqué dans une deuxième boîte de Pétri avec un tampon froid Tris 0,1 M. Retour de la première boîte de Pétri avec les embryons restants undissected à glace jusqu'au moment de la prochaine embryon.
6. Pour améliorer l'accès de la paroi thoracique dans l'embryon, décapiter l'embryon. Si le génotypage est nécessaire, enlever et sauver un morceau de tissu supplémentaire dans un tube Eppendorf placé sur la glace.
7. Placer l'embryon sur le dos, et couper la paroi thoracique à la verticale le long du côté de la cage thoracique, à proximité d'un membre antérieur, et horizontalement au-dessus du diaphragme pour visualiser le coeur. Ensuite, ouvrez la paroi thoracique à exposer le cœur.
8. En utilisant une pince pour tenir haut le long des gros vaisseaux, soulever le cœur à l'aide de pinces et couper les navires de moins. Lan, couper au-dessus de la pince pour libérer le cœur. Si les vaisseaux pulmonaires restent non coupés, les poumons peuvent être enlevées avec le cœur et doivent être retirés avant de poursuivre.
9. Couper et enlever l'artère pulmonaire au-dessus du niveau de la vanne; aux stades embryonnaires décrits ici, l'artère pulmonaire est légèrement opaque, ce qui facilite sa discrimination de la région de la soupape. Coupez juste en dessous de la valve pulmonaire, en évitant le myocarde ventriculaire trabéculaire et de recueillir comme décrit à l'étape 1.10 si cette région est également intéressant. Ici et dans l'étape suivante, utilisez l'action capillaire pour attirer tampon Tris excès loin de la zone d'intérêt avant de recueillir dans un tampon de lyse.
10. Retirer soigneusement la aorte distale de la valvule aortique, juste au-dessus du niveau de la vanne; comme l'artère pulmonaire, l'aorte reste légèrement opaque à ces stades embryonnaires, ce qui facilite son extraction. Coupez juste en dessous de la valve aortique, en évitant encore le myocarde ventriculaire trabéculaire, et transférer levanne à l'aide de pinces dans un tube Eppendorf avec du tampon de lyse 2 ul (décrit dans le tableau des matériaux) contenant des inhibiteurs de protease et de phosphatase sur de la glace.
11. Répétez les étapes 1.6 à 1.10 jusqu'à ce que les vannes ont été excisés de tous les embryons, la collecte de chaque valve dans un tube Eppendorf séparé. Si tous les embryons ont le même génotype, toutes les vannes peuvent être collectées dans un seul tube Eppendorf.
12. Si génotypage doit être effectuée afin de déterminer les vannes à mettre en commun, mettre immédiatement les échantillons dans un tampon de lyse à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure. Les échantillons peuvent ensuite être regroupées après génotypage (étape 2.1.1).

Extraction de la protéine 2

1. Décongeler les tissus prélevés sur la glace et centrifuger à 13 100 g pendant 1 min pour recueillir les tissus dans un tampon de lyse au fond du tube.
   1. Si les embryons ont été génotypés, utiliser une pipette pour recueillir doucement et le tampon de lyse piscine contenant les régions de soupape à partir d'embryons avec des génotypes similaires. Pour assurer une forte bet, la mise en commun des régions 3-4 de soupape à partir d'embryons E13.5 par échantillon est recommandé.
   2. Si tous les embryons sont du même génotype et toutes les régions de la vanne ont été rassemblées à l'étape 1.10, lyser l'ensemble de l'échantillon, comme décrit dans l'étape 2.2.
2. Vérifiez le volume de l'échantillon global résultant et ajouter un tampon de lyse à un volume total de 40 ul; alors, perturber et homogénéiser les échantillons à l'aide de 5 mm billes d'acier inoxydable dans des tubes Eppendorf. Actionnez le lyser pour 2-4 min à 50 Hz, selon les instructions du fabricant. tubes à centrifuger brièvement, (~ 13 100 x g pendant 1 min), et de transfert des échantillons dans de nouveaux tubes, laissant derrière les débris insolubles.
3. Préparer des échantillons distincts pour SDS-PAGE et transfert ultérieur pour analyse western blot, à la suite d'un protocole tel que Eslami et al ^9. Buvard pour une protéine de contrôle du chargement est essentiel pour la quantification des protéines.

Résultats

Grâce à cette technique de préparation, nous avons pu détecter phosphorylée Smad ^1,5,8 (pSmad) dans les régions de la valve aortique unique à partir de E13.5 embryons. Comme le montre la Figure 1A, la protéine isolée à partir d'une même région de la soupape est suffisant pour détecter une bande de pSmad faible. L'intensité du signal augmente proportionnellement au nombre de régions de soupapes qui sont mises en commun. Fait important, la pSmad rapport a / β-actine reste à peu près constant à ...

Discussion

La capacité à quantifier les niveaux de protéines au début embryon de souris et poussin régions cardiaques de soupape constitue un outil supplémentaire pour comprendre les événements de signalisation cellulaires critiques pour le développement de la vanne. Notre protocole décrit ici ne diffère pas beaucoup de procédures d'isolement de protéines standard. Cependant, en modifiant quelques étapes clés, nous avons réussi à obtenir des protéines phosphorylées de tailles très petits échantillons. Pour atteindre ce résulta...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Souris			À disséquer au stade embryonnaire d’intérêt
Microscope stéréoscopique	Nikon	SMZ645
0,1 M Tris, pH 7,6
Microciseaux	Outils de science fine	15003-08
Pince fine, #5	Outils de science fine	11251-30
Aiguille de dissection Ted	Pella Inc.	13560
Aiguilles de dissection	Ted Pella Inc.	13561-10
Micropipette, 20 &mu ; l, avec embouts
Tampon			50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 %
Triton PhosSTOP	Roche	4906845001	Ajouter 1 comprimé à 10 ml de tampon de lyse
TissueLyser LT	Qiagen	85600
Perles d’acier inoxydable	Qiagen	69989
Microcentrifugeuse