Génération de Enterobacter Sp. UEE auxotrophes utilisant mutagénèse par transposon

Résumé

Enterobacter sp. UEE grandit dans un milieu de sels glucose minimes. Les auxotrophes sont générées par le transformant avec un transposome qui se insère de manière aléatoire dans le génome de l'hôte. Les mutants sont trouvés par des répliques de milieu complexe à un milieu minimal. Gènes interrompus sont identifiés par le sauvetage des gènes et le séquençage.

Résumé

Bactéries prototrophes poussent sur M-9 minimal sels du milieu supplémenté avec du glucose (milieu M-9), qui est utilisé comme source de carbone et d'énergie. Auxotrophes peuvent être générés en utilisant une transposome. La, Tn 5 transposome -derived disponible dans le commerce utilisé dans ce protocole consiste en un segment linéaire d'ADN contenant une origine de réplication de R6K γ, un gène de résistance à la kanamycine et deux extrémités séquence mosaïque, qui servent de sites de liaison de la transposase. Le transposome, à condition que un complexe de protéine ADN / transposase, est introduit par électroporation dans la souche prototrophe, Enterobacter sp. UEE, et lui-même intègre de façon aléatoire dans le génome de cet hôte. Les transformants sont étalés sur réplique Luria-Bertani des plaques de gélose contenant de la kanamycine (kan-LB) et sur des plaques de gélose M-9 contenant de la kanamycine moyennes (M-9-kan). Les transformants qui se développent sur des plaques LB-Kan, mais pas sur des plaques M-9-kan sont considérés comme étant auxotrophes. Génomique purifiéL'ADN d'un auxotrophe est partiellement digéré, ligaturé et transformé en un pir ⁺ Escherichia coli (E. coli) souche. L'origine de réplication du plasmide R6Ky permet de se répliquer dans E. pir ⁺ coli et des souches, le marqueur de résistance à la kanamycine pour la sélection permet de plasmide. Chaque transformant possède un nouveau plasmide contenant le transposon flanquée par la région chromosomique interrompue. Séquençage Sanger et le Local Alignment Search Tool base (BLAST) suggèrent une identité putatif du gène interrompu. Il ya trois avantages à utiliser cette stratégie de mutagenèse de transposome. Tout d'abord, il ne repose pas sur l'expression d'un gène de la transposase de l'hôte. En second lieu, la transposome est introduit dans l'hôte cible par électroporation, plutôt que par la conjugaison ou par transduction et est donc plus efficace. Troisièmement, l'origine de réplication R6Ky, il est facile d'identifier le g mutéène, qui est partiellement récupéré dans un plasmide recombinant. Cette technique peut être utilisée pour étudier les gènes impliqués dans d'autres caractéristiques de Enterobacter sp. UEE ou d'un plus grand nombre de souches bactériennes.

Introduction

Bactéries prototrophes poussent dans M-9 sels milieu minimal contenant du glucose (milieu M-9), la conversion du glucose à travers les voies du métabolisme central du carbone pour produire des précurseurs, tels que des acides aminés, des acides nucléiques et des vitamines, pour ^une biosynthèse. M-9, le milieu contient du chlorure d'ammonium comme source d'azote, du sodium et du phosphate de potassium comme source de phosphore et un tampon, le sulfate de magnésium en tant que source de soufre et du glucose comme source de carbone et d'énergie. Luria-Bertani (LB) est riche en acides aminés de tryptone et en vitamines et facteurs de croissance à p....

Protocole

1. L'électroporation de cellules compétentes ^5,11

1. Diluer une culture O / N LB de Enterobacter sp. UEE 20.1 dans 50 ml de milieu LB frais et croître avec secousses à 120 tpm et 30 ° C jusqu'à une DO (600 nm) entre 0,4 et 0,6. Eventuellement, d'autres souches bactériennes se développer à leur température optimale de croissance.
2. Refroidir les cellules sur de la glace pendant 5 min et centrifugation à 4 ° C et 7000 x g pendant 5 min.
3. Jeter le surnageant, remettre en suspension les cellules dans 50 ml d'eau glacée stérile et centrifugation à 4 ° C et 7000 x g pendant 5 min. Répétez cette étape.
4. J....

Résultats

Transformation de Enterobacter sp. UEE par électroporation avec le transposome initié insertion du génome aléatoire dans le génome de l'hôte (Figure 1A, B). Une électroporation réussie a donné plusieurs milliers de transformants qui se sont développées sur des plaques LB-Kan. Pour obtenir 300-400, colonies par plaque bien espacées, la quantité de mélange transformation propagation sur chaque plaque de gélose LB-kan a été optimisé. Chaque transformant contenait au moins un insert de transposon, .......

Discussion

Mutagenèse utilisant un transposon transposome est un outil efficace pour générer auxotrophes à Enterobacter sp. Bactéries positives YSU et d'autres types de bactéries Gram négatif et Gram ^3,4. Le processus a été initié par l'introduction de la Tn 5 transposome -derived dans l'hôte par électroporation. Pour identifier les colonies avec des inserts, la souche non transformée de cible doit être sensible à la kanamycine afin de sélectionner pour le marqueur de résistance porté par l.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
EZ-TN5 R6K&gamma ; ori/KAN-2 Tnp Transposome Kit	Epicentre (Illumina)	TSM08KR
EC100D pir+ E. coli électrocompétent	Epicentre (Illumina)	ECP09500	Capable de répliquer des plasmides avec une origine de réplication R6K&gamma ; à un faible nombre de copies
EC100D pir-116 E. coli électrocompétent	Epicentre (Illumina)	EC6P095H	Capable de répliquer des plasmides avec un R6K&gamma ; réplication de l’origine à un nombre de copies élevé
5X M-9 Sels	Thermo Fisher	DF048517
Lennox LB Broth	Thermo Fisher	BP1427-2
Agar	Amresco, Inc.	J637-1KG	Milieu solide contenant 1,6 % (p/v)
de gélose Sulfate de Kanamycine  ;	Amresco, Inc.	0408-25G	Lorsque nécessaire, le support contenait 50 &mu ; g/ml sulfate de kanamycine
D-Glucose monohydraté	Amresco, Inc.	0643-1KG
Extrait de levure	Amresco, Inc.	J850-500G
Tryptone	Amresco, Inc.	J859-500G
KCl	Sigma-Aldrich	P4504-500G
NaCl	Amresco, Inc.	X190-1KG
MgCl2	Fisher Scientific	BP214-500
MgSO2	Fisher Scientific	BP213-1
Bouillon Super Optimal avec milieu de répression des catabolites (SOC) 0,5			% (p/v) d’extrait de levure, 2 % (p/v) de tryptone, 10 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 10 mM de MgCl2, 20 mM MgSO4 et 20 mM Glucose
BfuC I	NEB	R0636S	Digestion partielle de l’ADN génomique
Xho I	NEB	R0146S	Digestion plasmidique
T4 ADN Ligase	NEB	M0202S
Eau sans nucléase	Amresco, Inc.	E476-1L	Pour dissoudre l’ADN précipité et les réactions d’endonucléases de restriction
GenomeLab DTCS - Kit de démarrage rapide	Beckman Coulter	608120	Séquençage de l’ADN
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120A
Wizard Plus SV Minipreps Système de purification d’ADN	Promega	A1460	Purification de plasmide
Réplique Bloc de placage	Thermo Fisher	09-718-1
Carrés de velours	Thermo Fisher	09-718-2	Réplique de placage
PetriStickers	Diversified Biotech	PSTK-1100	Grille pour réplique de placage
Boîtes de Pétri Thermo	Fisher	FB0875712
Gene Pulser II	BioRad		Electroporation
Cuvettes d’électroporation &ndash ; 2 mm	BioExpress	E-5010-2
Concentrateur d’ADN sous vide CentriVap	Séchage de	l’ADN	7970010
Système d’analyse d’ADN CEQ 2000XL Beckman	Coulter		Séquençage de l’ADN
Vecteur NTI Advance 11.5.0	Life Technologies	12605099	l’analyse des séquences d’ADN