Mesure spatiale et temporelle Ca 2 + Signaux de plantes d'Arabidopsis

Résumé

^Ca la signalisation régule divers processus biologiques dans les plantes. Ici, nous présentons des approches pour le suivi du stress abiotique induit Ca ^{2 +} spatiale et temporelle des signaux dans les cellules et les tissus en utilisant les codés génétiquement ^{Ca2 +} indicateurs Aequorin ou cas12 Arabidopsis.

Résumé

Les indices de développement de l'environnement et induisent des fluctuations de ^{Ca2 +} dans les cellules végétales. spatio-temporelles de ^{Ca2 +} modèles spécifiques de stimulation sont détectées par cellulaires Ca2 ⁺ protéines de liaison qui initient ^{Ca2 +} cascades de signalisation. Cependant, nous en savons encore peu de choses sur la façon dont les signaux ^de stimulus Ca spécifique sont générés. La spécificité d'un signal de Ca2 ⁺ peut être attribuée à la régulation sophistiquées de l'activité des canaux et / ou des transporteurs ^de Ca en réponse à un stimulus donné. Pour identifier ces composants cellulaires et comprendre leurs fonctions, il est essentiel d'utiliser des systèmes qui permettent un enregistrement sensible et robuste des signaux ^de Ca à la fois le tissu et niveaux cellulaires. Codés génétiquement ^{Ca2 +} indicateurs qui ciblent différents compartiments cellulaires ont fourni une plate-forme pour des cellules vivantes imagerie confocale de cellulaires ^{Ca2 +} signaux. Nous décrivons ici l'instructions pour l'utilisation de deux systèmes de ^{Ca2 +} de détection: aequorine base (FAS adhésives Les plants de film luminescence) Ca2 ⁺ et d'imagerie des cellules vivantes cas12 fluorescence confocal basé imagerie de Ca2 ^+. imagerie de luminescence en utilisant le système FAS fournit une détection simple, robuste et sensible spatiales et temporelles des signaux Ca2 ⁺ au niveau des tissus, tandis que la cellule en direct imagerie confocale en utilisant cas12 permet la détection simultanée de cytosolique de Ca2 ⁺ et signaux nucléaires à haute résolution.

Introduction

La cellule de plante répond à l'environnement par l'intermédiaire d'une signalisation qui coordonne les actions cellulaires. Événement de signalisation en réponse à des stimuli de l'environnement d'une cellule début est une augmentation transitoire de Ca2 ^+. Le modèle, ou la signature d'une augmentation transitoire de la concentration de Ca2 ⁺ libre est caractérisé par son amplitude, la fréquence et la durée. Signatures Ca2 ⁺ spatio-temporelles distinctes régissent différentes activités cellulaires ^1. Stimuli spécifiques, tels que la chaleur, le froid, le sel, la sécheresse, la lumière, ou des hormones végétales, peuvent affiner l'activité spatio-temporelle de la membrane localisée canaux ^{Ca2 +} et / ou transporteurs, entraînant spécifiques ^{Ca2 +} signatures. Bien que ^{Ca2 +} transporteurs ont été bien caractérisés, on sait peu sur l'identité et les fonctions moléculaires des canaux ^de Ca dans les plantes ^1. Écrans génétiques pour les mutants avec altéré Ca2 ⁺ réponse au stress stimuli peuvent être une appr efficaceOach pour identifier les composants qui composent Ca ^de signatures. ^{Ca2 +} systèmes de détection récemment fondé plusieurs Aequorin ont été développés qui facilitent écrans génétiques pour Ca2 ⁺ composants de signalisation en réponse à l'attaque d'agents pathogènes et stress abiotique ^2-4.

A été utilisé pour la première Aequorin pour détecter des signaux ^{Ca2 +} dans les usines dans les années 1990 ^5. Depuis lors, l'aequorine a été ciblée pour différents compartiments cellulaires, tels que le cytoplasme ^5, le noyau ^6, les chloroplastes ^7, tonoplastique ^8, les mitochondries ^9, et le stroma ^10, ainsi que de différents types de cellules dans la racine de surveiller cellule spécifique Ca ^{2 + 11} signaux. Les mesures sur la base de Ca ^de l'aequorine révèlent le Ca2 ⁺ réponse spatiale et temporelle d'une population de cellules pour souligner stimuli. Cependant, dans la plupart des cas, les réponses ^du Ca de cellules individuelles sont unsynchronized dans le tissu de répondre ^4. Par conséquent, l'enregistrement ^de Aequorin Ca ne rend pas nécessairement le signal Ca2 ⁺ dans des cellules individuelles. Au cours des dernières années, la protéine fluorescente génétiquement codé (FP) à base de ^{Ca2 +} indicateurs, tels que cameleon jaune (centres jeunesse) ¹² et ¹³ cas12 ont été utilisés pour étudier la signalisation Ca2 ⁺ avec une résolution subcellulaire élevé. Centres jeunesse sont le transfert d'énergie de fluorescence par résonance (FRET) à base d'indicateurs de ^{Ca2 +,} contenant CFP et YFP variants lié par le liant le Ca2 ⁺ et calmoduline de la protéine de peptide liant la calmoduline M13. Calmodulin subit un changement de conformation telle qu'elle se lie au Ca2 ^+, ce qui apporte CFP et YFP rapprocher, ce qui entraîne un transfert d'énergie accrue (FRET accru). Le niveau de FRET avec le temps, plus ou moins calculé comme le rapport de la YFP à la PCP intensités de signal, traduit la dynamique intracellulaire de ^{Ca2 +.} Plusieurs versions YC ont été utilisés dans des plantes. YC3.6 était targeted vers le cytosol ^{14,15, 16} noyau, les mitochondries ^17, et la membrane plasmique ^18, et YC4.6 et D4ER ont été ciblés à l'urgence ^15,19, et D3cpv a été visé aux peroxysomes ^20. Les plantes transgéniques exprimant des centres jeunesse permettent l'imagerie des cellules vivantes de Ca2 ⁺ dynamique au sein de différents compartiments cellulaires de différents types de cellules. Cas (probablement Ca lcium soi RNDS) sont des protéines simples circulairement permutées fluorescentes (cpFPs) abritant une calmoduline et le peptide liant la calmoduline M13. Lors de la liaison à Ca2 ^+, les cas sont soumis à des changements de conformation, conduisant à une augmentation de l'intensité de fluorescence. La corrélation entre la réponse de fluorescence de la CAS et concentration de Ca2 ⁺ intracellulaire de Ca2 ⁺ permet dynamique à mesurer quantitativement. La variante cas12 a 12 fois fluorescence accrue dans les ^{Ca2 +} formes saturés. N. plantes benthiminana transitoire expresser cas12 ou de plantes d'Arabidopsis exprimant de façon stable Case 12 ont été utilisés pour étudier la signalisation Ca2 ⁺ dans la défense et stress abiotique ^4,21. Asynchrone spatiale et temporelle Ca2 ⁺ oscillations dans les cellules répondant à une attaque pathogène, ou au stress de déshydratation ont été révélés avec la société cas12 Ca2 ⁺ imagerie.

Ici, nous présentons des instructions détaillées pour Aequorin imagerie de luminescence en fonction de stimuli et tissulaire spécifique ^{Ca2 +} dynamique en plants d'Arabidopsis, et pour l'imagerie confocale de cytosolique et nucléaire Ca ^{2 +} dynamique dans les cellules d'Arabidopsis profondes qui expriment Cas 12: Luminescence imagerie du SAF pourrait être adapté pour analyser le stress induit par ^{Ca2 +} dynamique dans les plantes ou les tissus ne sont pas décrits ici intacts, ou pour dépister les populations de plantes d'Arabidopsis mutagénisées des mutants avec le stress a induit des troubles de ^{Ca2 +} signaux. L'installation d'imagerie Ca ^{2 +} des cellules vivantes pourrait être adapté pour analyser Ca2 + dynamique au sein des différents compartiments de subcelluar ou dans différents types de cellules à l'aide de ^{Ca2 +} autres indicateurs.

Protocole

1. Aequorin Based Ca2 ⁺ Imaging Utilisation du système FAS

1. Préparer les semis pour l'imagerie de luminescence. Stériliser graines de plantes d'Arabidopsis exprimant Aequorin avec une solution d'eau de Javel à 10% contenant 0,01% de Triton-100. Semez les graines stériles sur une plaque carrée (10 x 10 cm de plat carré de Pétri avec grille,) contenant la pleine force MS (Murashige et Skoog basale sel Mélange), 1% de saccharose et 1,2% d'agar. Placer les plaques verticalement dans une chambre de croissance après stratification à 4 ° C pendant 2 jours (Figure 1A).
2. Transférer les plants sur un film. Placer un film adhésif (figure 1B) sur la partie supérieure de 7-10 jours de culture des plantes de semis de la plaque. Poussez doucement le film par la main pour s'assurer que les plants adhèrent au film (figure 1C). Retirer le film doucement pour que les plants restent collés au film (figure 1D et 1E)
3. Incuber les plants avec cofacteur. Placer la unesemis dhered sur la plaque carrée (10 x 10 cm) contenant 15 ml de 2 pg / ml h-CTZ (coelentérazine) dans l'eau. Incuber les plants à la température ambiante pendant 4 heures à une nuit (figure 1F).
4. Préparez-vous pour l'imagerie de luminescence. Retirer le film de la solution h-CTZ et le couper par le milieu, formant deux pièces. Placez chaque morceau de film avec des plants face vers le haut en deux plaques différentes. Laisser les plaques à l'obscurité pendant 5 min.
5. Acquérir les images de luminescence. Dans l'obscurité, placer les deux plaques côte à côte sur la scène du système d'imagerie par luminescence (figure 1G). Acquérir des images immédiatement après l'ajout de 20 ml de solution de stimuli à la fois les plaques.
6. Analyser les images de luminescence. Choisir la même plage d'affichage de toutes les images de luminescence. Recadrage de la région d'intérêt (ROI) et de générer les images que les fichiers JPEG (figure 2A). Sinon, exporter les images sous forme de fichiers au format SPE et les importer dans leImageJ logiciel d'analyse d'image. Mesures établies pour le calcul de la valeur de gris moyen de retour sur investissement. Sélectionnez la même taille de la zone ROI et de mesurer les données de gris et moyennes présents sous forme de graphiques à barres (figure 2B).

2 Live Cell Imaging confocale Ca2 ⁺

1. Préparer les semis pour l'imagerie confocale. Stériliser graines de plantes d'Arabidopsis exprimant cas12 avec une solution d'eau de Javel à 10% contenant 0,01% de Triton. Semez les graines stériles sur une plaque contenant résistance plein sels MS, 1% de saccharose et 1,2% d'agar. Placer les plaques verticalement dans une chambre de croissance après stratification à 4 ° C pendant 2 jours.
2. Chambres d'imagerie de configuration
   1. Assembler une chambre d'imagerie utilisant une lame et lamelle (Chambre A). Placez un morceau de coton imbibé d'eau sur le milieu de la diapositive. Puis transférer un ou deux 5 jours plantules âgées de la plaque sur le dessus de la laine de coton imbibée d'eau. Collez les petits morceaux d'argile à chaque coin d'une lamelle, uned lieu lamelle sur le dessus des plants de créer un espace (chambre) entre la lamelle et toboggan (figure 3A, panneau de gauche). Raccorder une extrémité du tube de polyéthylène (diamètre 0,58 mm) pour une seringue de 1 ml et placer l'autre extrémité du tube immédiatement adjacente à la chambre. Tenir le tube en place avec du ruban adhésif (figure 3A, panneau de droite).
   2. Assembler une chambre d'imagerie utilisant une chambre en plexiglas (Chambre B).
      1. Étendre une mince couche de graisse de silicone autour de deux tubes en polyéthylène (diamètre 0,58 mm) et appuyez sur les tubes revêtus dans les canaux de chaque côté de la chambre de plexiglas (figure 3B gauche panneau). Étendre une mince couche de graisse de silicone sur la surface de la chambre qui contient les rainures du tube et appuyez sur une lamelle dans la graisse pour sceller un côté de l'ouverture de la chambre (découper).
      2. Transférer un vieux semis de cinq jours à partir de la plaque dans la chambre et placer un morceau de coton imbibé d'eau sur le joint hautf le semis. Etaler de la graisse silicone sur l'autre surface de la chambre, et appuyez sur une autre lamelle sur le dessus pour sceller. Connecter l'extrémité de l'un des tubes à une seringue de 1 ml. Laissez la fin de l'autre tube ouvert (panneau de droite figure 3B).
   3. Préparer une chambre d'imagerie utilisant un couvercle en verre chambré (chambre C). Stériliser le couvercle en verre chambré avec 70% d'éthanol et laisser sur le capot jusqu'à ce que sec. Ajouter 0,6 ml ou 0,2 ml de milieu MS de force complet contenant 1% de saccharose et 0,5% phytagel dans chaque puits d'une chambre à 2 ou bien une chambre à 8 puits (Figure 3C panneau de droite), respectivement. Stériliser les semences et semer les graines directement dans un verre de couverture chambré contenant une fine couche de gel transparent et laisser pousser verticalement pendant 5 jours (figure 3C).
3. Acquérir des images à l'aide d'un microscope confocal. Pour appliquer des stimuli de stress, tels que le sel, le froid ou le peroxyde, injecter lentement environ 200 pi de 150 mM de NaCl, glace-cold eau ou de 1 mM _de H ₂ O ₂ dans la chambre (chambre A ou B) juste avant l'acquisition d'images, ou ajouter doucement 500 ul ou 100 ul d'une solution de stimulation pour le puits d'une chambre 2 ou 8 puits, respectivement . Les images de capture, immédiatement après application de la solution de stimulus en utilisant un Nikon A1R confocal à balayage laser microscope inversé avec un objectif à immersion dans l'eau 20x (ouverture numérique de 0,75). Recueillir une série temporelle d'images à 4 secondes d'intervalle avec excitation et d'émission des longueurs d'onde de 488 nm et de 500 à 550 nm, respectivement, et à une résolution de pixel de 512 x 512.
4. Analyse de l'image
   L'aide de Nikon éléments, ROI ont été établis autour de chaque cellule (ou région) d'intérêt. L'intensité totale dans chaque ROI a été mesurée au cours du temps en utilisant la boîte de dialogue Mesure du temps (ImageJ pourrait être utilisé à la place). Nombre de mesures d'intensité ont été exportées et traitées dans Datagraph. Pointe ^l'amplitude Ca a été définie comme l'intensité de pointe moins l'intensité de repos, la durée comme etemps de e entre le début et la fin d'un pic, et la période de l'intervalle de temps entre les pics de pointes adjacentes de deux pointes. -test T a été utilisé pour comparer les moyennes.

Résultats

Mannitol, NaCl et H ₂ O ₂ ont été utilisés comme substituts pour la déshydratation, le sel et le stress oxydatif stimuli, respectivement. Pour vérifier si les ions de métaux lourds Cu ^{2 +} en synergie avec l'une de ces trois stimuli de stress, on a comparé la réponse de Ca2 ⁺ à chacune des stimuli de la présence ou de l'absence de Cu ^{2 +.} Comme le montre la Figure 2, le SAF luminescence imagerie a révélé que les plantules Arabidoposis réagissaient di...

Discussion

Nous avons démontré un système FAS pour l'enregistrement de la spatio-temporelle Ca2 ⁺ réponse des plants d'Arabidopsis. Cette ²⁺ système d'enregistrement FAS Ca offre une approche simple, sensible et robuste qui pourrait être adapté pour mesurer ^{Ca2 +} dynamique déclenchée par divers stimuli, en plus des stimuli de stress abiotiques qui sont présentés ici. Grâce à ce système, nous pouvons comparer facilement tissulaires ou des stimuli spécifiques spatio-temporelles Ca2 ^+...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Boîte de Pétri carrée de 10 cm x 10 cm	VWR	60872-310
Film adhésif	VWR	60941-062
Tube en polyéthylène	PerkinElmer	9908265
seringue de 1 ml	VWR	53548-000
Graisse silicone	Beckman	335148
verre de couverture à 2 chambres	Nalge Nunc international	155379
de protection à 8 chambres	Nalge Nunc international 155409
Système d’imagerie par luminescence	Princeton Instruments	N/A
Microscope confocal à balayage laser inversé	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon A1R  ;
Logiciel d’imagerie	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon Elements  ;
DataGraph	Visual Data Tools Inc	N/A	DataGraph 3.1.1 est la dernière version
Coelenterazine	NanoLight Technologies	#301B NF-BCTZ-FB
Eau de Javel tout usage	N/A N’importe quel magasin local	N/A
Triton X-100	Fisher	BP151500
MS sel	Phytotechnology	Labs M524-50L
Saccharose	VWR	BDH8029-12KG
Agar	Sigma	A1296-5KG
Phytagel	Sigma	P8169-1KG

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