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Article de méthode

Implantation de fibrine Gel sur la souris Lung pour étudier l'angiogenèse pulmonaire spécifique

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DOI :

10.3791/52012

⸱

21 décembre 2014

 , 
1Vascular Biology Program, Department of Surgery, Boston Children's Hospital and Harvard Medical School

Dans cet article

Résumé

La récapitulation du microenvironnement spécifique à l’organe, qui stimule l’angiogenèse locale, est indispensable pour une régénération réussie des tissus endommagés. Ce rapport fait la démonstration d’une nouvelle méthode pour implanter des gels de fibrine à la surface pulmonaire d’une souris vivante afin d’explorer comment le microenvironnement spécifique aux poumons module l’angiogenèse et la régénération alvéolaire chez la souris adulte.

Résumé

Les récents progrès significatifs dans les techniques de recherche sur les cellules souches et génie biologique ont fait de grands progrès dans l'utilisation de biomatériaux pour régénérer et réparer les dommages dans les tissus simples dans les domaines orthopédique et parodontales. Cependant, les tentatives pour régénérer les structures et les fonctions des organes (3D) en trois dimensions plus complexes tels que les poumons ne ont pas eu beaucoup de succès parce que les processus biologiques de la régénération d'organes ne ont pas été bien explorée. Il devient clair que l'angiogenèse, la formation de nouveaux vaisseaux sanguins, joue un rôle clé dans la régénération des organes. Vascularisations nouvellement formé non seulement fournir de l'oxygène, de nutriments et de divers composants cellulaires qui sont requis pour la régénération des organes, mais également à fournir des signaux instructifs régénération des tissus locaux. Par conséquent, pour régénérer avec succès dans les poumons d'un adulte, il est nécessaire de rappeler les micro-environnements spécifiques au poumon dans lequel l'angiogenèse lecteurs régénération des tissus pulmonaires locaux. Bien que conventional essais in vivo de l'angiogenèse, telles que l'implantation sous-cutanée de la matrice extracellulaire (ECM) riche en hydrogels (par exemple, la fibrine ou collagène gels ou Matrigel - mélange de protéines d'ECM sécrétée par des cellules de sarcome Engelbreth-Holm-Swarm souris), sont largement utilisés pour explorer la mécanismes généraux de l'angiogenèse, l'angiogenèse spécifique poumon n'a pas été bien caractérisé parce que les méthodes d'implantation orthotopique de biomatériaux dans les poumons ne ont pas été bien établie. L'objectif de ce protocole est de présenter une méthode unique pour implanter gel de fibrine sur la surface du poumon de souris vivant adulte, permettant la réexposition succès de l'hôte angiogenèse pulmonaire dérivés à l'intérieur du gel. Cette approche permet aux chercheurs d'explorer les mécanismes par lesquels le microenvironnement spécifique poumon Contrôles angiogenèse et la régénération alvéolaire dans les deux conditions normales et pathologiques. Depuis biomatériaux implantés libération et fournir des signaux physiques et chimiques à l adjacentetissus ung, l'implantation de ces biomatériaux sur poumon malade peuvent potentiellement normaliser les tissus malades adjacentes, permettant aux chercheurs de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour divers types de maladies pulmonaires.

Introduction

L'objectif global de ce protocole est de présenter une méthode pour implanter gel de fibrine sur la surface du poumon de souris adultes, qui permet aux chercheurs de caractériser les mécanismes moléculaires de la vasculaire pulmonaire et le développement alvéolaire et de tirer parti de cette connaissance afin de développer les matériaux biomimétiques capables de récapituler vasculaire pulmonaire alvéolaire formation physiologique et pour traiter diverses maladies pulmonaires.

Plus de 35 millions d'Américains souffrent de maladies pulmonaires chroniques, y compris la maladie pulmonaire obstructive chronique et la fibrose pulmonaire. Ces patients ont des symptômes durables respiratoires chroniques tels que l'essoufflement, oppression thoracique, toux tenace, et la fatigue, qui limitent de façon importante leur vie quotidienne 1-3. Malgré une grande quantité d'efforts pour développer des thérapies efficaces pour ces maladies pulmonaires, il ne existe actuellement aucun remède; par conséquent, la qualité de vie de ces patients est médiocre et économique et les coûts humains sont salutgh 7.4. Actuellement, la transplantation pulmonaire est la seule façon de sauver les patients atteints de maladies pulmonaires chroniques en phase terminale. Toutefois, en raison de la pénurie de donneurs de greffe, le coût élevé, des complications graves, et le faible taux de survie 8-11, la transplantation ne est pas une approche optimale. Les récents progrès rapides des techniques d'ingénierie tissulaire a permis aux chercheurs de bioingénieur poumon implantable par repeupler tout le poumon décellularisée avec différents types de cellules progénitrices ou cellules souches pluripotentes induites (iPS) 12,13. Cependant, ces poumons transgéniques sont fonctionnels chez les animaux hôtes que pendant quelques heures après l'implantation 12,14,15. Utilisant biomatériaux pour régénérer les structures complexes et fonctions de poumons a également été assez infructueux. Cela peut être parce que les processus biologiques fondamentaux qui régissent adultes régénération du poumon ne ont pas été bien explorée. Dans le poumon, la formation du système vasculaire est l'un des événements les plus précoces et les plus importants durile développement et la régénération 16-21 ng. Nouvellement formé vascularisations dans le poumon non seulement fournir de l'oxygène, de nutriments et divers composants cellulaires nécessaires à la formation d'organes, mais aussi fournir des signaux réglementaires instructifs aux cellules environnantes 22-25. Ainsi, l'angiogenèse joue un rôle clé dans alvéolarisation régénérative dans les poumons adultes 24,26,27. En outre, l'angiogenèse contribue à déréglementé maladies pulmonaires chroniques telles que la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) 28, la dysplasie bronchopulmonaire (DBP) 21-23, et la fibrose pulmonaire 29. Ainsi, pour élaborer des stratégies plus efficaces pour l'ingénierie poumons ou traiter les maladies pulmonaires chroniques, il est nécessaire de comprendre les mécanismes fondamentaux de l'angiogenèse spécifique poumon.

Chaque organe présente des propriétés mécaniques et chimiques uniques, qui peuvent différer entre les conditions physiologiques et pathologiques 30-33. Ces microenviron spécifique d'organements régulent les comportements des cellules endotheliales et orchestrent la formation du réseau vasculaire d'une manière spécifique d'un organe 24,34-36. Ainsi, pour élaborer des stratégies plus efficaces pour la régénération du poumon, le mécanisme sous-jacent angiogenèse spécifique poumon doit être compris. Bien que des dosages classiques de l'angiogenèse in vivo telles que sous-cutanée hydrogel implantation ont été largement utilisés pour la recherche de l'angiogenèse 37 à 39, ces méthodes ne récapitulent angiogenèse spécifique d'un organe. Récemment, un nouveau procédé pour implanter Matrigel dans un moule élastique sur le poumon de la souris a été développé et montré avec succès à recruter des vaisseaux sanguins et des cellules epitheliales pulmonaires dans les 22 gels. Cette approche unique permet aux chercheurs d'explorer le mécanisme spécifique de l'angiogenèse-poumon ainsi que les interactions entre les vaisseaux sanguins et des cellules pulmonaires non-vasculaires dans des conditions physiologiques et pathologiques. Depuis 1) Matrigel ne est pas adapté pour une application clinique; 2) l'emoule lastic utilisé pour couler le gel peut affecter les interactions entre les hydrogels et les tissus pulmonaires d'accueil et 3) le moule élastique sur le poumon provoque potentiellement altération de la fonction pulmonaire et des douleurs lors de la respiration, comme une approche plus cliniquement pertinente, une matrice de fibrine 3D contenant des facteurs angiogéniques (facteur de croissance vasculaire endothélial (VEGF) / facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF)) a été implanté dans le poumon de souris sans coulée dans le moule élastique, et a récapitulé avec succès hôte angiogenèse dérivé du poumon. gel de fibrine, les fibrilles de polymère provenant de la thrombine du fibrinogène clivé, est connu pour piéger une variété de facteurs angiogéniques tels que le VEGF et le bFGF à accélérer l'angiogenèse in vivo 40,41. En raison de sa capacité de régénération et de la nature biodégradable 42, le gel de fibrine est largement utilisé dans le domaine de l'ingénierie tissulaire.

Cet article présente une approche nouvelle et unique d'implanter gel de fibrine sur la surface du poumon des adul vivret souris et démontre que l'hôte angiogenèse pulmonaire dérivé est récapitulé à l'intérieur des gels in vivo. Cette méthode, qui permet aux chercheurs d'étudier l'angiogenèse spécifique poumon, sera probablement conduire au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour divers types de maladies pulmonaires et de faire progresser de manière significative les efforts pour régénérer avec succès poumon adulte.

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Protocole

NOTE: L'étude in vivo chez des animaux a été réalisée en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Le protocole a été examiné et approuvé par le soin et l'utilisation des animaux du Comité Hôpital pour enfants de Boston (numéros de protocole: 13-10-2526R, 14-02-2568R). Tous les médicaments utilisés dans ce protocole sont de qualité pharmaceutique et ces médicaments sont préparés dans des conditions stériles.

1. Préparation de gel de fibrine

  1. Préparer un gel de fibrine contenant le VEGF et le bFGF.
    1. Décongeler les solutions mères de fibrinogène et de thrombine qui sont stockés à -80 ° C jusqu'à la température ambiante (25 ° C).
    2. Ajouter thrombine (concentration finale: 2,5 U / ml), CaCl2 (concentration finale: 45 mM), le VEGF (concentration finale: 0 à 100 ng / ml) et bFGF (concentration finale: 0 à 100 ng / ml) au fibrinogène solution (concentration finale: 12,5 mg / ml dans 0,9% sodium d'une solution de chlorure de 43 à 45) dans un tube de 1,5 ml.
    3. Mélanger doucement par pipetage.
    4. Pipette doucement 200 pi du mélange sur un plat de plastique stérile dans un mode goutte à goutte en utilisant la pointe de la pipette p200.
    5. Incuber les gouttes à 37 ° C pendant 30-60 min jusqu'à ce qu'elles se solidifient.
      REMARQUE: le gel solidifié peut être maintenu dans la boîte en plastique scellé à la température ambiante (25 ° C) pendant plusieurs heures avant l'implantation (figure 1a).
  2. Couper le gel de fibrine dans environ 3 x 3 x 3 mm en utilisant des cubes de petits ciseaux chirurgicaux avant l'implantation.

2. Préparation de la souris

  1. Anesthetize souris adulte (8-12 semaines) par voie intraperitoneale (IP) injection de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg) et confirmer que la souris est correctement anesthésiés par pincement de l'orteil souris.
    1. Utilisez vétérinaire pommade sur les yeux de la souris pour prévenir la sécheresse pendant l'expérience.
  2. Shave fur sur le côté gauche de la cage thoracique de la souris.
  3. Effectuer intubation endotrachéale de la souris.
  4. Placez la souris sur l'intubation tenir inclinée à 70 ° et maintenez la souris en place en accrochant ses incisives supérieures sur une petite bande de caoutchouc situé en haut de la tribune.
  5. Rétracter doucement la langue d'un côté en utilisant le forceps émoussé.
  6. Visualiser le larynx à l'aide d'un col de cygne microscope illuminateur à fibre optique.
  7. Insérez cathéter endotracheal élastique (21 G) dans la trachée.
  8. Assurez-vous que la souris est spontanément respire de manière lisse (100-150 régulière respirations / min, aucune respiration paradoxale ou peu profonde).
  9. Passer la souris en position couchée sous le microscope de dissection.
  10. Ventiler mécaniquement la souris en utilisant un ventilateur de rongeurs (150 respirations / min et 7 ml / kg volume courant).
  11. Comptez côtes pour localiser espace intercostal entre 4 ème et 5 ème côtes.
  12. Créer un champ stérile sur la zone by essuyer soigneusement avec de l'alcool et de Povidone-iode. Couvrir le champ opératoire de manière adéquate avec un champ opératoire stérile.

3. Chirurgie souris

  1. Après injection locale de bupivacaïne 0,25% (200 pi) dans la peau, faire une incision de la peau transversale (environ 1 cm de longueur) sur l'espace intercostal l'aide de ciseaux de dissection.
  2. Après l'injection de bupivacaïne 0,25% (200 pi) dans le muscle intercostal, faire une incision musculaire entre le 4 ème et 5 ème côtes fines à l'aide de petits ciseaux.
  3. Insérer une dissection écarteur entre les nervures de visualiser parfaitement le poumon gauche.
    1. Grattez une petite zone (1 x 1 mm carré) de la plèvre viscérale du centre du poumon gauche en utilisant une pince fine.
    2. Appliquez une légère pression sur la zone à l'aide d'un coton-tige stérile jusqu'à saignements et les fuites d'air sont complètement contrôlés.
    3. Mettez petite quantité de mélange frais de fibrinogène / thrombine (colle de fibrine) (étape 1.1.2. 20 & #181; l) sur la zone en utilisant la pointe de la pipette p200.
  4. Placez délicatement une gel de fibrine (étape 1.2) en utilisant une petite pince sur la zone (figure 1b).
    1. Vérifiez que le gel est bien fixé sur la zone lors des mouvements respiratoires du poumon.
  5. Assurez-vous qu'il n'y ait ni fuite aérienne massive, ni saignement du poumon.
  6. Fermer incisions (muscle et la peau couches) avec suture absorbable, qui ne ont pas à être enlevés.
  7. Aspirer la cavité thoracique en utilisant 27 aiguille G et seringue de 1 ml pour empêcher un pneumothorax.
  8. Terminer ventilation mécanique.

4. Récupération souris

  1. Assurez-vous que la souris est spontanément respire de manière lisse (100-150 régulière respirations / min, aucune respiration paradoxale ou peu profonde).
  2. IP injecter 1 ml de pré-chauffé NaCl à 0,9% pour éviter la déshydratation.
  3. Laisser la souris pour récupérer sur le pavé de l'eau chaude en circulation.
  4. Retirez le endotracheal tube après confirmant que la souris a une respiration stable.
  5. Injecter Meloxicam (5 mg / kg, injection sous-cutanée (SC), pour les trois jours que analgésique postopératoire.
  6. Surveiller les mouvements de la souris attentivement à un minimum de 15 minutes d'intervalle jusqu'à ce qu'il soit sternale (capable de rouler sur son estomac et rester debout) et conscient.
  7. Après la récupération, retourner la souris pour une nouvelle cage isolé de souris sans chirurgie.
  8. Surveillez le site chirurgical pour des signes d'infection (rougeur, enflure, écoulement), les fonctions biologiques fondamentaux de l'animal (apport alimentaire et hydrique, la miction, la défécation, le gain de poids corporel) ainsi que des signes cliniques de détresse (horripilation, la locomotion réduite) jour après la intervention chirurgicale.

5. récolte du poumon

  1. 7 à 30 jours après l'implantation, la souris en utilisant euthanasie CO 2 sous forme de source de gaz comprimé.
  2. Faire une incision entre la pointe du processus xiphoïde et l'sternaleencoche (de sternotomie médiane) et toute la récolte du poumon avec le gel implanté pour l'analyse histologique et biochimique en coupant la trachée et disséquer toutes les connexions vers le cœur, les poumons et la trachée.
  3. Fixer gel implanté avec poumon avec une solution de paraformaldéhyde 4% pendant une nuit à 4 ° C, incorporer dans le composé octobre, et de prendre sections étape série de 30 um d'épaisseur.
  4. Effectuer histologique (hématoxyline et éosine) et les analyses immunohistochimiques (de marqueur endothélial: CD31, un marqueur épithélial: aquaporine (AQP) 5 et la protéine tensioactif (SP) -B) en utilisant microscope confocal 22,37,40.
  5. Compiler des piles de sections optiques (30 pm d'épaisseur) pour former des images en trois dimensions de endotheliales du poumon et les cellules épithéliales image 3D en utilisant le logiciel d'analyse 37.
  6. Quantifier surfaces projetées des vaisseaux sanguins nouvellement formés en utilisant un logiciel d'analyse d'image 46.

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Résultats

Afin de déterminer si la formation vasculaire pulmonaire dérivées hôte est récapitulée à l'intérieur des biomatériaux implantés sur le poumon, des gels de fibrine complétées avec majeur facteurs angiogéniques VEGF et bFGF (0, 10 et 100 ng / ml chacun) ont été implantés sur la surface du poumon de souris vivant que ont déclaré utiliser Matrigel 22. des gels de fibrine 47 qui contiennent ces facteurs de croissance angiogéniques ont été fabriquées conformément à la figure 1a. Après th...

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Discussion

Cet article présente une nouvelle méthode pour implanter biomatériaux sur la surface du poumon de souris adulte vivant. Avec ce système, l'angiogenèse hôte poumon dérivé est récapitulé avec succès à l'intérieur du matériau. Ce système permet aux chercheurs d'explorer la diaphonie entre les cellules endotheliales, d'autres cellules (par exemple, des cellules épithéliales, des cellules mésenchymateuses, des cellules immunitaires) et divers composants de l'ECM qui sont nécessaires à l'angio...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des fonds de l'American Heart Association (AM), US Department of Defense (BC074986), et de l'hôpital Faculté Career Development Fellowship pour enfants de Boston (TM, AM). Les auteurs remercient Amanda Jiang Jiang et Elisabeth pour l'assistance technique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Fibrinogène du placenta humainSigmaF4883Pour la fabrication de gel de fibrine
Thrombine à partir de plasma bovinSigmaT9549Pour la fabrication de gel de fibrine
Souris recombinante VEGF 164R& D493-MVPour supplémentation en gel de fibrine
Souris recombinante bFGFR& D3139-FBPour supplémentation au gel de fibrine Support d’intubation
rongeursBraintree Scientific INCRIS 100Pour l’intubation
Source lumineuse à fibre optiqueFisher Scientific12-565-35Pour l’intubation
21 G Cathéter élastiqueB.Braun4251652-02Pour l’intubation
MiniVent VentilatorHarvard ApparatusCGS-8009Pour ventilation
Stemi DV4 StéromicroscopeFisher Scientific12-070-515Pour la chirurgie
Suture absobableEthiconPDP304Suture chirurgicale
Anticorps contre CD31BD Biosciences553370Immunohistochimie
Anticorps contre AQP5AbcamAB78486Immunohistochimie
Anticorps contre SP-BAbcamAB40876Immunohistochimie
pour

Références

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