Analyse en temps réel de profil métabolique dans Ex Vivo Cultures souris intestinale Crypte organoïde

Résumé

Les petits organites des cryptes intestinales en culture ex vivo de fournir un système de culture de tissu qui récapitule croissance des cryptes charge sur les cellules souches et leur niche. Nous avons établi une méthode pour analyser le profil métabolique en temps réel organites de la crypte de la souris primaire. Nous avons trouvé organites maintenir les propriétés physiologiques définis par leur source.

Résumé

La muqueuse intestinale présente une architecture répétitive organisée en deux structures fondamentales: villosités, faisant saillie dans la lumière intestinale et composées d'entérocytes matures, des cellules caliciformes et des cellules entéro-endocrines; et cryptes, résidant à proximité de la sous-muqueuse et la musculeuse, l'hébergement souches adultes et des cellules progénitrices et des cellules matures de Paneth, ainsi que du stroma et les cellules immunitaires du microenvironnement de la crypte. Jusqu'à ces dernières années, des études in vitro de l'intestin grêle a été limité à des lignées cellulaires dérivées de tumeurs bénignes ou malignes, et ne pas représenter la physiologie de l'épithélium intestinale normale et l'influence du microenvironnement dans lequel ils résident. Ici, nous démontrons une méthode adaptée de Sato et al. (2009) pour la mise en culture primaire organites des cryptes intestinales de souris dérivées de souris C57BL / 6. En outre, nous présentons l'utilisation de cultures organoïdes crypte de doser le profil métabolique crypte en temps réel par mesurement de la consommation de base d'oxygène, le taux de la glycolyse, la production d'ATP et de la capacité respiratoire. Organites conservent les propriétés définies par leur source et conservent les aspects de leur adaptation métabolique réfléchie par la consommation d'oxygène et les taux d'acidification extracellulaire. Études métaboliques en temps réel dans cette crypte organoïde de système de culture sont un outil puissant pour étudier le métabolisme de l'énergie organoïde crypte, et comment elle peut être modulée par des facteurs nutritionnels et pharmacologiques.

Introduction

Le cancer colorectal (CCR) est la troisième cause de décès liés au cancer aux États-Unis. Cancer du côlon sporadique --à-dire celle qui résulte plus tard dans la vie (> 50 ans) et sans facteurs génétiques prédisposant claires - représentent environ 80% de tous les cas, avec une incidence fortement influencée par les habitudes alimentaires à long terme ^1,2. Ces tumeurs présentent un changement métabolique à la dépendance de la glycolyse oxydatif, connu comme l'effet Warburg, qui peut en partie faire des concentrations plus élevées de blocs de construction cellulaires et de l'énergie disponibles (par glutaminolysis) pour permettre et peut-être d'atteindre des taux élevés de prolifération des cellules tumorales ^3-5 . Études sur le cancer du côlon ainsi que d'autres cancers gastro-intestinaux, y compris les petits cancers de l'intestin fournissent des indications importantes sur la cause de la formation de tumeurs. Étudier les différences métaboliques entre les états normaux, pro-tumorigènes et tumorigènes de systèmes d'organes gastro-intestinaux peuvent aider detESILIATION de risque relatif pour le développement de la tumeur ainsi que la détection précoce des néoplasies. De plus, la compréhension de métabolisme bioénergétique impliquant la respiration mitochondriale et la glycolyse donnera un aperçu fondamental dans la façon dont la physiologie cellulaire, le vieillissement et la maladie perturbe l'homéostasie intestinale état. L'utilisation de la technologie bioénergétique de dosage pour l'analyse de flux extracellulaire peut évaluer le taux de respiration mitochondriale et de la glycolyse en même temps dans les cellules en croissance en culture en temps réel ^{de 6,7.}

Jusqu'à récemment, les études in vitro de l'intestin grêle ont été limités à des lignées cellulaires dérivées de tumeurs bénignes ou malignes ^8,9 et ne représentent pas la physiologie de l'épithélium intestinale normale et l'influence du micro-environnement dans lequel elles résident. En 2009, Sato et al. ¹⁰ ex vivo introduit un système de culture à croissance tridimensionnelle (3D) de souris organites épithéliales de l'intestin, ou epithElial «mini-tripes", adapté à des recherches expérimentales, diagnostiques et thérapeutiques ^10,11. En outre, cryptes isolées de souris soumis à restriction calorique maintenir leurs propriétés de croissance modifiées que organites dans ces cultures ^12. Par rapport à des lignées cellulaires transformées, cultures organoïdes crypte peuvent être utilisés pour générer des données physiologiquement pertinents présentant une bien meilleure modèle pour comprendre l'état in vivo.

Nous avons adapté la technologie d'analyse bioénergétique pour doser le métabolisme énergétique des organites des cryptes intestinales. Souris organites de la crypte intestinale ont été cultivées ex vivo de développer les études sur le métabolisme de l'énergie organoïdes crypte présentés. Le taux de consommation d'oxygène (OCR) et le taux d'acidification extracellulaire (ECAR) des organites cryptes ont été mesurées en l'absence et en présence de deux inhibiteurs différents métaboliques (oligomycine, la roténone) et un transporteur d'ions (carbonyl cyanure p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). L'orga crypteréponse métabolique solénoïde à ces composés chimiques ont été traduit avec succès en changeant ECAR et valeurs OCR.

Études bioénergétiques cellulaires permettent d'élucider les interactions réciproques entre l'état métabolique et le risque de maladie et le phénotype dans le cancer, l'obésité, le diabète, les maladies métaboliques et les maladies mitochondriales et aider méthodes de dépistage à l'avance avec des implications directes pour la médecine translationnelle. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour isoler petites cryptes intestinales et à la culture organites de la crypte. En outre, nous introduisons une nouvelle méthode pour utiliser des cultures organoïdes crypte pour les essais métaboliques.

Protocole

Cette étude a été réalisée en conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Le protocole a été approuvé par le Comité d'éthique de l'expérimentation animale de l'Albert Einstein College of Medicine.

1. Crypte Isolement et culture

1. Isolation des cryptes de l'intestin grêle:
   1. Isoler cryptes intestinales de tout modèle de souris d'intérêt. Euthanasier les souris avec du CO ₂ suivie d'une dislocation cervicale.
   2. Ouvrez l'abdomen longitudinalement et remplir l'intestin grêle (SI) avec une solution saline tamponnée froid glace phosphate, PBS (-Ca ^2+; -Mg ²⁺⁾ avec 2x antibiotique antifongique (anti-anti). Rapidement isoler l'intestin grêle.
   3. Bien disséquer sans graisse mésentérique aide d'un scalpel. Veillez à ne pas perforer le tissu - en tout temps garder le tissu humide avec PBS glacé. Ouvrez inteStine longitudinalement et laver soigneusement avec du PBS glacé.
   4. Couper l'intestin grêle en deux sections et aplatir à l'aide d'un coton-tige humide, doucement gratter les villosités en utilisant une lame de pré-refroidissement. Laver vigoureusement dans PBS glacé plusieurs fois.
   5. Incuber 3 min dans 20 ml de PBS 1X par 3 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) /0.5 mM de dithiothréitol (DTT) pour la dissociation non enzymatique du tissu.
   6. Couper le tissu en petits morceaux (2-4 mm) en utilisant une lame de rasoir sur une lame de pré-refroidi. Transférer les morceaux dans un tube de 50 ml contenant 20 ml de PBS refroidi à la glace.
   7. Pipette et doucement 10x en utilisant une pipette de 10 ml stérile à usage unique. Laissez fragments de tissus sédimentent par gravité. Retirer le surnageant avec une pipette. Répétez trois fois de plus; assurez-vous surnageant est clair.
   8. Ajouter 20 ml de PBS par 2 mM EDTA. Swirl et incuber à 4 ° C pendant 30 min sous agitation légère.
   9. Laissez sédiments de tissus et éliminer le surnageant. Ajouter 15 ml PBS glacé et pipettede haut en bas 5x avec une pipette de 10 ml. Soit les fragments de tissus et des sédiments recueillir le surnageant comme une fraction (F1). Répéter collecte F2-F5, chaque fraction maintenu séparément.
   10. Ajouter 15 ml PBS glacé et cette fois agiter vigoureusement à la main pendant 15 secondes. Recueillir F6 et F7 pour répéter, F8. Si des morceaux de tissus commencent à flotter, appuyez sur pour les aider à régler.
   11. Inspecter une partie aliquote de chaque fraction sous le microscope. Mettent en commun les fractions contenant cryptes.
   12. Faire passer les fractions combinées à travers un tamis cellulaire en nylon de 70 pm, la collecte des cryptes dans un tube de 50 ml.
   13. Centrifugeuse à 100 g pendant 5 min à 4 ° C, éliminer le surnageant et remettre le culot dans 10 ml PBS glacé avec cryptes anti-anti-transfert et 2x à un tube de 15 ml. Répétez le lavage une fois de plus.
   14. Laver les cryptes une fois avec 10 ml glacée ADF, avancée DMEM / F-12 (Dulbecco "s Modified Eagle Medium / Ham" s F-12) - 2x anti-anti.
   15. Laver les cryptes une fois avec 10 ml de ADF - 1x anti-anti.
   16. Comptez le nombre de cryptes en utilisant un hématimètre. Ajuster le volume de la solution de crypte et transférer dans un tube de 1,5 ml de sorte que la concentration finale de la crypte sera remis en suspension lors de 100-500 cryptes par 50 pi de mélange de protéines gélatineux (Matrigel). Centrifuger à 100 g pendant 5 min à 4 ° C et remettre les cryptes dans le mélange de protéine gélatineux.
   17. Plaque 50 pi de crypte - gélatineux suspension de mélange de protéines par puits dans une plaque de 24 puits (zone de croissance: 2 cm ^2), plaçant soigneusement la chute de suspension au centre de chaque puits. Maintenir la plaque dans un CO _2, à 37 ° C pendant ~ 30 incubateur min jusqu'à ce que la suspension se solidifie.
   18. Ajouter 500 ul médias glacée de culture complet (Advanced DMEM / F12 avec 1x contre - contre 10 mM 4- (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES), 1x GlutaMAX, 1x B27, supplément de 1x N2, 1 mM N-acétyl-L-cystéine (NAC), 50 ng / ml de facteur de croissance épidermique (EGF), 100 ng / mlCaboche, 500 ng / ml R-Spondin).
       1. Reconstituer les facteurs de croissance à 0,1% de sérum-albumine bovine (BSA) dans du PBS.
2. Crypte Organoid Culture et Passage:
   1. Passage organites de la crypte 14-21 jours après l'ensemencement (ou au besoin) comme suit:
      1. Changer médias chaque vendredi et lundi. Le mercredi, remplacer la moitié des médias avec les médias fraîche.
   2. Retirer le milieu de culture. Laver l'échantillon deux fois avec 500 ul de PBS à 5 min d'intervalle.
   3. Retirer du PBS et casser doucement le mélange de protéines gélatineux en utilisant une pointe de micro pipette P1000 stérile.
   4. Ajouter milieux de culture 1 ml complet à un seul puits et remettre en suspension les organites dans 1 ml médias.
   5. Perturber légèrement les organites aide d'un P1000 par aspiration et refoulement 20-30x (vérifier au microscope pour la dissociation organoïde bon avec un bon rendement de la crypte jusqu'à une technique cohérente est développé).
   6. Transférer les cryptes à un tube de 1,5 ml;centrifuger à 100 xg à 4 ° C, 5 min.
   7. Laver le culot deux fois avec 1 ml de milieu de culture complet.
   8. Split à un rapport de 1: 3 ou 1: 6 en tant que besoin, des cryptes remise en suspension dans 50 ul de Matrigel par puits. Procédez comme décrit ci-dessus (section 1.1.16-18).
3. Crypte de congélation Organoid:
   1. Retirer le milieu de culture. Laver l'échantillon avec 500 ul de PBS.
   2. Disperser le mélange de protéines gélatineux en utilisant une pointe de pipette P1000.
   3. Ajouter 1 ml de milieu à un seul puits et remettre en suspension les organites dans 1 ml médias.
   4. Casser délicatement les organites aide d'un P1000 par aspiration et refoulement 20-30x.
   5. Transférer les organites à un tube de 1,5 ml. Centrifugeuse à 100 g à 4 ° C, 5 min.
   6. Laver le culot deux fois avec 1 ml de milieu de culture complet.
   7. cryptes de remettre en suspension dans 500 ul de gel médias.
   8. cryptes de transfert à un cryotube, placer le tube dans un récipient de congélation et de stocker dans un congélateur à -80 ° C overniGHT.
   9. Transfert des cryptes de l'azote liquide ₂ réservoir.
      1. Récupérer organites de la crypte gelés par la fonte rapidement dans un bain d'eau à 37 C °. Laver avec 500 ul de milieu de culture complet une fois, centrifuger à 100 x g, 5 min et remettre en suspension dans le mélange de protéine gélatineuse, et la culture comme décrit ci-dessus. Pour une meilleure récupération, ajouter un inhibiteur de ROCK (Y-27632) au milieu de congélation.

2. Crypte Organoid métabolisme Assay

1. Plaque de 24 puits Préparation:
   1. Isoler et compter cryptes selon le protocole (voir la section 1.1 pour l'isolement de la crypte et la section 1.2 pour le passage de la crypte).
   2. cryptes de remettre en suspension dans le mélange de protéines gélatineux (100-200 cryptes par 20 pi).
   3. Plate crypte gélatineuse mélange de protéines en suspension dans une plaque de 24 puits essai (assurez-vous qu'il ya au moins trois exemplaires pour chaque échantillon) et permet la suspension se solidifier à 37 ° C en CO ₂incubateur; puis ajouter 500 ul de milieu de culture complet.
   4. cryptes de culture (comme décrit dans la section 1.1) et d'observer au microscope jusqu'à cryptes deviennent des organites pleinement développés.
2. Extracellulaire Flux test:
   1. Hydrate cartouche pendant une nuit dans un non-CO ₂ (0% de CO _2), 37 ° C incubateur.
   2. Retirez le milieu de culture et laver deux fois avec 500 organoïdes DMEM ul (sans: glucose, L-glutamine, du pyruvate de sodium et de bicarbonate de sodium et avec: rouge phénol). Attendez 5 min.
   3. Ajouter 675 ul par puits milieu analytique (DMEM avec 2 mM de L-glutamine et 5 mM de D-glucose) dans chaque puits.
   4. Vérifier morphologie microscopique de crypte de sorte que organites et le mélange de protéines gélatineux sont intactes après les lavages. Incuber 1 heure à une non-CO _2, 37 ° C incubateur.
   5. Préparation des composés 10 uM injectables (oligomycine, le carbonyl cyanide p-trifluoro-méthoxy-phényl-hydrazone (FCCP), rotenone) en milieu de dosage.
   6. Mise en place de la cartouche en chargeant 75 pi de 10 um composés injectables dans les ports de la cartouche de façon séquentielle: Port A - oligomycine; Port B - FCCP; Port et C - roténone (Les concentrations finales au cours de l'essai sera de 1 M).
   7. Incuber cartouche 30 min - 1 heure à 37 ° C dans un incubateur à CO ₂ non.
   8. En même temps, activez l'Analyzer XF et créer le modèle de protocole d'essai.
   9. Insérer la cartouche et la plaque d'utilité dans Analyzer XF et exécuter "calibrer" cartouche.
   10. Vérifiez organites de la crypte au microscope afin de s'assurer qu'ils sont attachés au mélange de protéines gélatineux.
   11. cellule de charge plaque de culture dans le protocole d'essai de l'appareil et l'exécution.

Résultats

Organites crypte ont été établies à partir de 8 mois C57BL / 6 Fed purifié alimentation des rongeurs American Institute of Nutrition 76A (AIN76A). Organites des cryptes intestinales peuvent être mises en culture pendant des périodes prolongées d'un seul crypte (figure 1A, seule flèche rouge). Organites poussent hors des structures de la crypte comme dans 18-20 jours de culture (figure 1B, flèches rouges). Cryptes ont été passées toutes les 3 semaines et organites efficacement récupérés ...

Discussion

Nous avons testé le taux de consommation d'oxygène (OCR) et le taux d'acidification extracellulaire (ECAR) de cryptes isolées à partir de souris âgées de 8 mois et cultivées en organites ex vivo. Après la mesure du taux de base, le métabolisme crypte a été évaluée en ajoutant oligomycine, cyanure de carbonyle -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) et la roténone, séquentiellement.

Basal OCR et ECAR base ont été enregistrées 0-29 min (figure 2A et ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Matrice membranaire basale BD Matrigel, DFR, sans rouge de phénol, sans LDEV	BD Biosciences	356231
PBS (solution saline tamponnée au phosphate), sans magnésium, sans calcium, pH 7,2	Life Technologies	20012-027
Advanced DMEM/F-12 (1x)	Life Technologies	12634-028
Dulbecco&prime ; s Aigle modifié&prime ; s Moyen sans glucose, L-glutamine, rouge de phénol, pyruvate de sodium et bicarbonate	de sodium Sigma-Aldrich	D5030
Sel de sodium rouge de phénol	Sigma-Aldrich	P4758	Concentration finale 15 mg/l dans le DMEM (D5030) - step 2.2.2
Antibio-Antimycosique, 100x, 100 ml	Life Technologies	15240-062	Concentration finale 1x ou 2x
péniciline-streptomycine, liquid	Life Technologies	15140-122	Concentration finale 1x
Gibco® ; GlutaMAX&commerce ; supplément	Life Technologies	35050061	Concentration finale 1x
Gibco® ; HEPES (acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N-2-éthane sulfonique), 1 M Life	Technologies	15630-080	Concentration finale 10 mM
N-acétyl-L-cystéine, 25 g	Sigma-Aldrich	A9165-25G	Concentration finale 1 mM
100x N-2 supplément, liquide	Invitrogen	17502-048	Concentration finale 1x
50x B-27® ; supplément moins Vitamine A,	Invitrogen	liquide12587-010	Concentration finale 1x
souris recombinante R-Spondin 1, CF, 50 &mu ; g	R& D Systems	3474-RS-050	Concentration finale 500 ng/ml
Recombinant Murin EGF, 100 &mu ; g	Peprotech	315-09	Concentration finale 50 ng/ml
Tête murine recombinante, 20 &mu ; g	Peprotech	250-38	Concentration finale 100 ng/ml
Gibco® ; L-glutamine, 200 mM	Life Technologies	25030-081	Concentration finale 2 mM
Gibco® ; glucose en poudre	Life Technologies	15023-021	Concentration finale 5 mM
Ambion® ; 0,5 M EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique), pH 8,0	Life Technologies	AM9260G	Concentration finale 3 mM pour pas 1.1.5 ; 2 mM pour pas 1.1.8
[en-tête]
DTT (dithiothréitol), 1M	Life Technologies	P2325	Concentration finale 3 mM
d’albumine de sérum de bovin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2058	0,1 % dans PBS
Sérum de veau fœtal (FBS)	Life Technologies	16000-044	1 % dans PBS
Recovery&trade ; Culture cellulaire Congélation Medium Life	Technologies	12648-010
Inhibiteur de ROCK (Y-27632)	Sigma-Aldrich	Y0503	Concentration finale 10 &mu ; M
Oligomycine	Sigma-Aldrich	O4876	Concentration finale 1 &mu ; M
Cyanure de carbonyle-p-trifluoro-méthoxy-phényl-hydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920	Concentration finale 1 &mu ; M
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	Concentration finale 1 &mu ; M
Hydroxyde de sodium	Sigma-Aldrich	221465	Concentration finale 0,1 N dans l’analyseur
flux extracellulaire PBS XF24 (analyseur XF)	Seahorse Bioscience

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