Analyse en temps réel de profil métabolique dans Ex Vivo Cultures souris intestinale Crypte organoïde

Résumé

Les petits organites des cryptes intestinales en culture ex vivo de fournir un système de culture de tissu qui récapitule croissance des cryptes charge sur les cellules souches et leur niche. Nous avons établi une méthode pour analyser le profil métabolique en temps réel organites de la crypte de la souris primaire. Nous avons trouvé organites maintenir les propriétés physiologiques définis par leur source.

Résumé

La muqueuse intestinale présente une architecture répétitive organisée en deux structures fondamentales: villosités, faisant saillie dans la lumière intestinale et composées d'entérocytes matures, des cellules caliciformes et des cellules entéro-endocrines; et cryptes, résidant à proximité de la sous-muqueuse et la musculeuse, l'hébergement souches adultes et des cellules progénitrices et des cellules matures de Paneth, ainsi que du stroma et les cellules immunitaires du microenvironnement de la crypte. Jusqu'à ces dernières années, des études in vitro de l'intestin grêle a été limité à des lignées cellulaires dérivées de tumeurs bénignes ou malignes, et ne pas représenter la physiologie de l'épithélium intestinale normale et l'influence du microenvironnement dans lequel ils résident. Ici, nous démontrons une méthode adaptée de Sato et al. (2009) pour la mise en culture primaire organites des cryptes intestinales de souris dérivées de souris C57BL / 6. En outre, nous présentons l'utilisation de cultures organoïdes crypte de doser le profil métabolique crypte en temps réel par mesurement de la consommation de base d'oxygène, le taux de la glycolyse, la production d'ATP et de la capacité respiratoire. Organites conservent les propriétés définies par leur source et conservent les aspects de leur adaptation métabolique réfléchie par la consommation d'oxygène et les taux d'acidification extracellulaire. Études métaboliques en temps réel dans cette crypte organoïde de système de culture sont un outil puissant pour étudier le métabolisme de l'énergie organoïde crypte, et comment elle peut être modulée par des facteurs nutritionnels et pharmacologiques.

Introduction

Le cancer colorectal (CCR) est la troisième cause de décès liés au cancer aux États-Unis. Cancer du côlon sporadique --à-dire celle qui résulte plus tard dans la vie (> 50 ans) et sans facteurs génétiques prédisposant claires - représentent environ 80% de tous les cas, avec une incidence fortement influencée par les habitudes alimentaires à long terme ^1,2. Ces tumeurs présentent un changement métabolique à la dépendance de la glycolyse oxydatif, connu comme l'effet Warburg, qui peut en partie faire des concentrations plus élevées de blocs de construction cellulaires et de l'énergie disponibles (par glutaminolysis) pour permettre et peut-êt....

Protocole

Cette étude a été réalisée en conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Le protocole a été approuvé par le Comité d'éthique de l'expérimentation animale de l'Albert Einstein College of Medicine.

1. Crypte Isolement et culture

1. Isolation des cryptes de l'intestin grêle:
   1. Isoler cryptes intestinales de tout modèle de souris d'intérêt. Euthanasier les souris avec du CO ₂ suivie d'une dislocation cervicale.
   2. Ouvrez l'abdomen longitudinalement et remplir l'intestin grêle (SI) a....

Résultats

Organites crypte ont été établies à partir de 8 mois C57BL / 6 Fed purifié alimentation des rongeurs American Institute of Nutrition 76A (AIN76A). Organites des cryptes intestinales peuvent être mises en culture pendant des périodes prolongées d'un seul crypte (figure 1A, seule flèche rouge). Organites poussent hors des structures de la crypte comme dans 18-20 jours de culture (figure 1B, flèches rouges). Cryptes ont été passées toutes les 3 semaines et organites efficacement récupérés .......

Discussion

Nous avons testé le taux de consommation d'oxygène (OCR) et le taux d'acidification extracellulaire (ECAR) de cryptes isolées à partir de souris âgées de 8 mois et cultivées en organites ex vivo. Après la mesure du taux de base, le métabolisme crypte a été évaluée en ajoutant oligomycine, cyanure de carbonyle -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) et la roténone, séquentiellement.

Basal OCR et ECAR base ont été enregistrées 0-29 min (figure 2A et .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Matrice membranaire basale BD Matrigel, DFR, sans rouge de phénol, sans LDEV	BD Biosciences	356231
PBS (solution saline tamponnée au phosphate), sans magnésium, sans calcium, pH 7,2	Life Technologies	20012-027
Advanced DMEM/F-12 (1x)	Life Technologies	12634-028
Dulbecco&prime ; s Aigle modifié&prime ; s Moyen sans glucose, L-glutamine, rouge de phénol, pyruvate de sodium et bicarbonate	de sodium Sigma-Aldrich	D5030
Sel de sodium rouge de phénol	Sigma-Aldrich	P4758	Concentration finale 15 mg/l dans le DMEM (D5030) - step 2.2.2
Antibio-Antimycosique, 100x, 100 ml	Life Technologies	15240-062	Concentration finale 1x ou 2x
péniciline-streptomycine, liquid	Life Technologies	15140-122	Concentration finale 1x
Gibco® ; GlutaMAX&commerce ; supplément	Life Technologies	35050061	Concentration finale 1x
Gibco® ; HEPES (acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N-2-éthane sulfonique), 1 M Life	Technologies	15630-080	Concentration finale 10 mM
N-acétyl-L-cystéine, 25 g	Sigma-Aldrich	A9165-25G	Concentration finale 1 mM
100x N-2 supplément, liquide	Invitrogen	17502-048	Concentration finale 1x
50x B-27® ; supplément moins Vitamine A,	Invitrogen	liquide12587-010	Concentration finale 1x
souris recombinante R-Spondin 1, CF, 50 &mu ; g	R& D Systems	3474-RS-050	Concentration finale 500 ng/ml
Recombinant Murin EGF, 100 &mu ; g	Peprotech	315-09	Concentration finale 50 ng/ml
Tête murine recombinante, 20 &mu ; g	Peprotech	250-38	Concentration finale 100 ng/ml
Gibco® ; L-glutamine, 200 mM	Life Technologies	25030-081	Concentration finale 2 mM
Gibco® ; glucose en poudre	Life Technologies	15023-021	Concentration finale 5 mM
Ambion® ; 0,5 M EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique), pH 8,0	Life Technologies	AM9260G	Concentration finale 3 mM pour pas 1.1.5 ; 2 mM pour pas 1.1.8
[en-tête]
DTT (dithiothréitol), 1M	Life Technologies	P2325	Concentration finale 3 mM
d’albumine de sérum de bovin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2058	0,1 % dans PBS
Sérum de veau fœtal (FBS)	Life Technologies	16000-044	1 % dans PBS
Recovery&trade ; Culture cellulaire Congélation Medium Life	Technologies	12648-010
Inhibiteur de ROCK (Y-27632)	Sigma-Aldrich	Y0503	Concentration finale 10 &mu ; M
Oligomycine	Sigma-Aldrich	O4876	Concentration finale 1 &mu ; M
Cyanure de carbonyle-p-trifluoro-méthoxy-phényl-hydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920	Concentration finale 1 &mu ; M
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	Concentration finale 1 &mu ; M
Hydroxyde de sodium	Sigma-Aldrich	221465	Concentration finale 0,1 N dans l’analyseur
flux extracellulaire PBS XF24 (analyseur XF)	Seahorse Bioscience

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