Caractériser la composition de moteurs moléculaires sur les moyens axonale Cargo Utilisation de l'analyse "Cargo Mapping"

Résumé

Le transport intracellulaire des cargaisons, telles que les vésicules ou les organites, est effectué par des protéines motrices moléculaires qui suivent les microtubules polarisés. Ce protocole décrit la corrélation entre la directionnalité du transport des particules de cargaison individuelles se déplaçant à l’intérieur des neurones et la quantité relative et le type de protéines motrices associées.

Résumé

Comprendre les mécanismes par lesquels les moteurs moléculaires coordonnent leurs activités pour le transport de cargaisons vésiculaires dans les neurones nécessite l'analyse quantitative des associations moteur / de fret au niveau de la vésicule unique. Le but de ce protocole est d'utiliser la microscopie quantitative de fluorescence à corréler («carte»), la position et la directionnalité du mouvement de fret direct aux montants de composition et relatives des moteurs associés avec la même cargaison. "Cartographie Cargo» se compose de l'imagerie en direct de cargaisons marquées par fluorescence mobiles dans les axones cultivées sur des dispositifs microfluidiques, suivie par la fixation chimique lors de l'enregistrement de mouvement direct, et immunofluorescence ultérieure (IF) des mêmes régions axonales exactes avec des anticorps contre les moteurs. Colocalisation entre cargaisons et leurs moteurs est évaluée en affectant la position sous-pixel de coordonnées de canaux de moteur et de fret, par gaussiennes de montage à la diffraction-lifonctions d'étalement de point mited représentant sources ponctuelles fluorescentes individuelles. Images de fret et moteur fixe sont ensuite superposées à des parcelles de mouvement de la cargaison, à la «carte» à leurs trajectoires suivies. La force de ce protocole est la combinaison de vivre et si les données à enregistrer à la fois le transport de cargaisons vésiculaires dans des cellules vivantes et de déterminer les moteurs associés à ces mêmes vésicules exactes. Cette technique permet de surmonter les problèmes antérieurs qui utilisent des méthodes biochimiques pour déterminer la composition moyenne du moteur de populations purifiées de vésicules en vrac hétérogènes, car ces méthodes ne révèlent pas des compositions sur des cargaisons de mobiles simples. Par ailleurs, ce protocole peut être adapté à l'analyse d'autres voies de transport et / ou de traite dans d'autres types de cellules à mettre en corrélation le mouvement des structures intracellulaires individuels avec leur composition en protéines. Limitations de ce protocole sont le débit relativement faible en raison des faibles efficacités de transfection de cultureneurones primaires et un champ de vision limité disponible pour l'imagerie haute résolution. Les applications futures pourraient inclure des méthodes pour augmenter le nombre de neurones exprimant cargaisons marquées par fluorescence.

Introduction

Le transport intracellulaire est essentiel dans tous les types de cellules pour la délivrance de protéines, les membranes, les organelles et les molécules de signalisation cellulaire à divers domaines ^1. Les neurones sont des cellules spécialisées avec très longues, projections polarisés qui dépendent de façon critique sur le transport intracellulaire des cargaisons essentielles pour leur livraison sur de longues distances à différents microdomaines axonales. Ce transport est médiée par kinésines et dynéines - deux grandes familles de protéines motrices moléculaires - qui se lient à des cargaisons et de suivre le long des microtubules polarisés en antérograde et rétrograde directions, respectivement. Alors que le mouvement rétrograde est principalement médiée par la dynéine, le mouvement dans le sens antérograde est facilitée par une grande famille, la diversité fonctionnelle de moteurs de kinésine. Par conséquent, le transport antérograde des cargaisons axonales pourrait être médiée par divers membres de la famille de la superfamille kinésine ^1-5. Bien que certaines cargaisons se déplacent constamment dans les deux sens, ma plupart des cargaisons se déplacent de manière bidirectionnelle et inversent souvent sur ​​leur chemin vers leurs destinations finales ^1,5-13. En outre, il a été démontré que les moteurs d'opposition à directivité associé simultanément à cargaisons, ce qui soulève la question de savoir comment le mouvement réglementé de cargaisons est coordonné par des moteurs de polarité opposée ^5-7. Ensemble, le transport de cargaisons axonales est un processus concerté qui est réglementée par la composition de moteurs et de leurs activités biochimiques spécifiques, qui sont à leur tour dépendent de divers adaptateurs et partenaires de liaison de réglementation ^14.

Pour décrire fidèlement le mécanisme de transport axonal pour une marchandise spécifique et à découvrir la réglementation sous-jacente de ce transport, il est primordial de déterminer la composition des protéines de moteur et de leurs partenaires de liaison réglementaires inhérents aux cargaisons individuelles lors de leur transport direct. D'autres méthodes, par exemple des approches biochimiques, fournissent des estimations de mot moyenneou compositions sur les populations de vésicules hétérogènes purifiés, mais ces estimations ne révèlent pas le type ou la quantité de moteurs associés à des vésicules mobiles simples. En outre, la reconstitution de transport le long des microtubules vésicule préassemblés in vitro a permis de mesurer la quantité d'un type de moteur à un niveau de ¹⁵ vésicule unique. Toutefois, ces expériences ne sont pas corrélés directement la quantité de moteurs avec des caractéristiques de transport de ces vésicules, et le transport mesurées en l'absence de facteurs de régulation cellulaire.

Un protocole est présentée ici, qui détermine la composition de moteur (type et la quantité relative des moteurs) de vésicules mobiles individuels à partir d'immunofluorescence (IF) des données de mesure de manière endogène exprimé protéines motrices, et en corrélation de ces paramètres pour le transport direct des mêmes vésicules exactes dans les neurones ^16. Cette méthode implique une cartographie précise des données SI-à-vivre mouvement de la cargaison. Ceci est accompli en growing neurones de l'hippocampe de souris dans des dispositifs microfluidiques qui suit les protocoles établis, ^17-19. Ces dispositifs permettent l'identification et la corrélation ("mapping") des axones et des cargaisons mobiles simples dans les modalités fixes et vivantes microscopie de lumière (Figure 1). Des neurones en culture sont transfectées avec des protéines par fluorescence de fret marqués dont le transport est imagée à une résolution spatiale et temporelle pour obtenir des informations détaillées mouvement qui est tracée dans kymographs. Au cours de l'imagerie, les neurones sont fixées avec du paraformaldéhyde, et ensuite colorées avec des anticorps dirigés contre des protéines endogènes à moteur. Images de fret et moteurs fixes sont superposées sur kymographs de déplacement en live à la «carte» (colocalisent) les à la cargaison vivante mouvement trajectoires ^16. Pour corréler le mouvement des cargaisons en direct avec l'association de protéines motrices, colocalisation est analysée en utilisant un logiciel MATLAB sur mesure appelé «MoTor colocalisation ^"16,20. Cargaisons et les moteurs marqués par fluorescence génèrent caractéristiques ponctuées limitée par la diffraction qui peuvent se chevaucher partiellement. Pour résoudre la position de chevauchement points lacrymaux, le logiciel adapte automatiquement la première gaussiennes pour chaque fonction d'étalement de point, représentant puncta fluorescent individu, afin de déterminer leur position précise sous-pixel de coordonnées XY et l'intensité des amplitudes de ^21-23. Les positions des moteurs et des cargaisons par la suite par rapport à l'autre afin de déterminer la colocalisation ^16,20. Par conséquent, cette méthode attribue plus précisément entre les points lacrymaux colocalisation fluorescente par rapport à d'autres méthodes ^24.

La force de cette méthode est la capacité d'évaluer la colocalisation des moteurs à cargaison individuelle dans des cellules fixées, pour qui les trajectoires de mouvement vivants (par exemple, la direction dans laquelle ils se déplaçaient au moment de la fixation) ont été recorded. Avec cette méthode, les kinésines et dynéines ont été trouvés à la fois pour associer les vésicules qui transportent la protéine prion normale ^(PrPc -cellular), une cargaison enrichi neuronale qui se déplace de façon bidirectionnelle ou reste stationnaire dans les axones ^16. Cette analyse a permis l'élaboration d'un modèle de travail pour la réglementation de la PrP ^C mouvement des vésicules dans lequel antérograde (kinésine) et (dynéine) moteurs rétrogrades coordonnent leurs activités afin de passer les vésicules dans les deux sens ou rester stationnaire pendant associée à la cargaison . Un autre point fort de cette méthode est son large potentiel d'application pour la caractérisation de colocalisation / association de nombreuses marchandises marquées par fluorescence qui se déplacent dans pratiquement n'importe quel type de cellule, avec toute autre protéine (s) d'intérêt. Ainsi, la corrélation en temps réel / fixe pourrait potentiellement permettre la détection d'interactions protéine-cargo transitoires, comme beaucoup individu marqué par fluorescence des particules en mouvement peut être analysé sur une p désiréeériode de temps. Compte tenu de la large applicabilité et le type de questions que cette méthode peut résoudre, ce protocole sera d'intérêt pour un large public de biologistes cellulaires, y compris ceux qui étudient le trafic et le transport dans les neurones ou dans d'autres types de cellules.

Protocole

Toutes les expériences ont été menées selon des protocoles approuvés et selon les directives institutionnelles pour les soins sans cruauté des animaux de recherche. Souris nouveau-nés ont été euthanasiés par décapitation.

1. Préparation de dispositifs microfluidiques pour la culture cellulaire

1. Préparer polydiméthylsiloxane (PDMS) des dispositifs microfluidiques pour la croissance des neurones de l'hippocampe comme décrit par Harris et ses collègues ^17-19. Voici quelques modifications qui ont été adaptés au protocole de mise en correspondance de la cargaison.
   REMARQUE: Les dispositifs microfluidiques sont également disponibles dans le commerce (Liste des produits), ainsi accès à un centre de fabrication est pas nécessaire.
2. Préparation n ° 1 ½ couverture lunettes (24 x 40 mm) en les lavant trois fois avec de l'acétone, suivi par trois lavages avec 100% d'éthanol et trois lavages à l'eau. des lamelles de magasins dans l'eau à 4 ° C jusqu'à utilisation. Ces traitements permettent de garantir que les lamelles sont propres de débris qui pourraient interférer avec placage de cells, la contamination et la survie.
   REMARQUE: L'acétone et l'éthanol sont inflammables et dangereux en cas de contact cutané (irritant), contact avec les yeux (irritant), d'ingestion, d'inhalation. Eliminer conformément aux prescriptions légales.
3. Lorsque vous êtes prêt à utiliser, placez un couvercle en verre dans une boîte de 60 mm de culture cellulaire par dispositif microfluidique, et laisser sécher à l'air à découvert pendant 45 min dans une enceinte de sécurité biologique pour éviter la contamination.
4. Après dispositifs sont découpées dans les maîtres et coups de poing ont été coupés pour créer des réservoirs (figure 1A, B), placez-les avec le côté des canaux microfluidiques-up à l'intérieur d'une enceinte de sécurité biologique équipé d'une lampe UV pendant 45 min pour la stérilisation.
   REMARQUE: Les périphériques sous traitement UV Laissant pendant plus de 2 heures pourrait affecter l'intégrité du PDMS.
5. Assembler les appareils en plaçant un dispositif sur chaque couvercle en verre à l'intérieur du boîte de 60 mm de culture de cellules en plastique de sorte que les canaux microfluidiques face vers le bas. Appliquez une légère pression sur le joint hautf le dispositif (éviter de toucher les microcanaux) pour assurer une étanchéité non-permanent du dispositif de la lamelle. Couvrir chaque boîte de culture cellulaire de 60 mm avec un couvercle.
6. Avec une micropipette, hydrater les dispositifs en ajoutant culture cellulaire eau de qualité pour les deux premiers réservoirs microfluidiques (1 et 2 de la figure 1A), permettant à l'eau de circuler à travers. Enlever l'eau avec une micropipette et ajouter 1 mg / ml de poly-L-lysine dans le réservoir 1 microfluidique (200 ul) et 2 (100 pi). La différence de volume pour permettre la poly-L-lysine à circuler à travers les micro-canaux (Figure 1A, B).
7. Pour veiller à ce que les dispositifs à l'intérieur des boîtes de 60 mm de culture cellulaire ne basculent dans un incubateur à 37 °, placez trois boîtes de culture cellulaire de 60 mm contenant les dispositifs dans une boîte de culture de cellules de plastique de 150 mm et couvrir le plat avec un couvercle. Incuber O / N dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO _2. Généralement plus de 90% des chaînes sont utilisables par appareil et fairepas contenir de bulles d'air ou de blocage physique.
8. Le jour suivant, remplacer la poly-L-lysine avec de l'eau et laisser dispositif dans l'incubateur pendant au moins une heure. Répéter ce lavage trois fois. Retirer de l'eau et ajouter Neurobasal-un milieu de croissance (contenant 2% de B-27 supplément et 500 um GlutaMAX) pour chaque appareil. Laisser O / N dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO _2.
9. Le jour suivant, la plaque de cellules de l'hippocampe, comme décrit ci-dessous.

2. Dépôt de neurones de l'hippocampe de souris primaire en dispositifs microfluidiques

NOTE: La préparation des neurones de l'hippocampe de rats nouveau-nés en culture a été précédemment publié dans JoVE ^25. Voici quelques modifications qui ont été adaptés aux neurones d'hippocampe de souris plaque dans des dispositifs microfluidiques, et qui étaient optimales pour les transfections.

1. Avant souris dissection du cerveau, du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) contenant du sérum pré-chaud de 10% de veau fœtal(FBS; sans antibiotiques), le mélange A (125 mg de DL-cystéine, 125 mg d'albumine de sérum bovin (BSA) et de 3,125 g de D-glucose dans 500 ml de tampon phosphate salin (PBS); stériliser par filtration à travers un filtre de 0,22 um) et la désoxyribonucléase I solution (DNase I: 50 mg de DNase I et 0,5 ml d'une ₄ solution 1,2 M de sulfate de magnésium dans 100 ml de solution saline équilibrée de Hank (HBSS) stériliser par filtration à travers un filtre de 0,22 um) dans un bain d'eau à 37 °.
   1. Neurobasal-A milieu de pré-croissance chaud à l'intérieur d'un incubateur à 37 ° avec 5% de CO ₂ pour équilibrer le pH.
2. Disséquer hippocampes de souris âgées de nouveau-né 1-3 jours selon les protocoles établis ^26. Conserver hippocampes dans un tube conique de 15 ml contenant 10 ml de tampon de dissection (HBSS contenant 10 mM d'HEPES pH 7,4, 50 mM de glucose, 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine), sur de la glace. Mettre en place à 4 hippocampes par tube de 15 ml conique.
3. Effectuer le protocole reste est dans des conditions stériless à l'intérieur d'une enceinte de sécurité biologique.
4. Diluer 45 unités de papaïne dans 5 ml de mélange A, vortex et incuber pendant 5 minutes à 37 ° C jusqu'à ce que la poudre de la papaïne est dissous. Ajouter 1 ml de solution de DNase I. Filtrer le mélange à travers une unité de filtre à seringue de 0,22 um.
5. Soigneusement aspirer HBSS »de 15 ml tube conique contenant hippocampes. Ajouter 10 ml froid (4 ° C) HBSS à hippocampes et laissez-les se déposent au fond du tube. Aspirer soigneusement HBSS de 15 ml tube conique.
6. Ajouter 1 ml de la papaïne / DNase je mélange à jusqu'à 4 hippocampes et incuber pendant 20-30 min à 37 ° C. Inclinez tube conique toutes les 5 minutes pour se baigner hippocampes avec le mélange. Vous pouvez également placer des hippocampes dans un shaker C l'eau de bain à 37 ° avec agitation douce (~ 100 rpm).
7. Aspirer la papaïne / DNase je mélange et laver deux fois avec du DMEM hippocampes préchauffé (37 ° C) contenant 10% de FBS.
8. Après second lavage, ajouter 2 ml de pré-chauffé DMEM contenant 10% de FBS à hippocampes et hippocampes triturer manuellement par pipetagede haut en bas ~ 10-12 fois à l'aide d'une pipette de 1 ml de dissocier les neurones.
9. Laissez triturer contenter de ~ 1 min ce qui permettra neurones non dissociés de se déposer au fond du tube conique. Transférer le surnageant contenant les neurones dissociés à un nouveau tube de 15 ml conique en évitant tout transfert de plus grand tissu qui est installé au fond du tube.
10. Spin cellules à 1000 g pendant 2 min et retirez soigneusement surnageant sans déranger le culot cellulaire. Remettre en suspension les cellules dans 80 ul Neurobasal-A du milieu de croissance par un léger pipetage.
11. Éliminer le milieu de réservoir microfluidique 1 et 1 '. Appliquer 20 pi de cellules (~ 275 000) à réservoir microfluidique 1, et de leur permettre de circuler à travers. Placez dispositif dans 37 ° C incubateur avec 5% de CO ₂ pendant 20 min.
12. Regardez sous microscope pour s'assurer que les cellules ont adhéré à la lamelle. Ajouter Neurobasal-un milieu de croissance pour couronner tous les réservoirs. Un dispositif de rappel avec des cellules à un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO _2.
13. Vérifier les dispositifs de chaque évaporation ~ 2-3 jours et couronner les réservoirs avec Neurobasal-A contenant 2% de B-27 supplément (sans GlutaMAX) à éviter. Les neurones commencent à étendre leurs axones à travers des canaux microfluidiques ~ 2-3 jours après placage. Sous réserve de neurones transfection généralement 7-10 jours après placage.

3. La transfection de neurones de l'hippocampe Cultivé en dispositif microfluidique

1. Par dispositif, préparer un mélange de 1,2 ul de Lipofectamine 2000 dans 30 ul Neurobasal-A, et un mélange de 0,5 ug fluorescent fusion de chargement plasmide dans 30 ul Neurobasal-A et incuber 5 minutes à température ambiante. Ajouter Lipofectamine mélange de l'ADN mélange et incuber pendant 20 min à température ambiante. Ajouter 60 ul de Neurobasal-A contenant 4% de B-27 supplément à l'ADN / Lipofectamine et mélanger à en tapotant le tube.
2. Retirez tous les supports du réservoir microfluidique 2 et 2 'et remplissez soigneusement des puits avec Neurobasal-A contenant 2% de B-27 supplément sans déborder du milieu into les autres compartiments.
3. Retirez le support du réservoir microfluidique 1 et 1 '. Ajouter 120 ul d'ADN / Lipofectamine mélanger à réservoir microfluidique 1 et laisser couler. Dispositif revenir à 37 ° C incubateur avec 5% de CO ₂ pour 3-4 heures.
4. Retirez tous les supports du réservoir microfluidique 1 et 1 'et le remplacer par Neurobasal-A 2% de B-27 supplément contenant pendant 24 heures (ou jusqu'au moment de l'image). Typiquement, 5-7 axones qui poussent à travers des microcanaux sont transfectées dans ces conditions, qui représentent environ 1-3% d'efficacité de transfection compatible avec l'efficacité publiées pour des cellules en culture de l'hippocampe ^26.

4. Analyses "Cargo cartographie"

1. Imagerie en temps réel des mouvements de marchandises
   1. Effectuer l'imagerie sur un microscope à lumière inversé à épifluorescence équipé d'un incubateur à 37 ° C et une chambre de commande de CO _2.
   2. Montez la lamelle avec des neurones d'hippocampe cultivées dans un MICRdispositif ofluidic sur la platine du microscope. Pour éviter la mort neuronale, travailler avec diligence pour maintenir les échantillons à la loupe pour plus de 1 h.
   3. L'utilisation d'un objectif à haute résolution (100X), trouver des axones des cellules transfectées qui se prolongent par des voies de chambres microfluidiques et enregistrent le nombre de canaux dans laquelle l'axone transfectées a été trouvé. Comptez le nombre de canaux à l'aide d'un compteur de pointage de la main.
      1. Pour l'enregistrement de mouvement optimale en direct et l'analyse de colocalisation ultérieure, choisir axones qui poussent relativement plat à travers les canaux de sorte que l'imagerie de la plupart des vésicules peut être effectuée au point.
   4. Éliminer la majeure partie du milieu de réservoirs 2 et 2 'avec un 1 ml de transfert pipette en plastique. Pour faciliter l'alignement ultérieur des images fixes avec des trajectoires de mouvement sur ​​kymographs, alignez le bord droit de microcanaux avec le champ de vision lors de l'imagerie (figure 1B, C).
   5. Pour faciliter Fixing des échantillons lors de l'imagerie, effectuer l'imagerie en direct avec deux personnes. Par ailleurs, si l'imagerie en direct est effectuée par une seule personne, utiliser un système de microscope équipé d'une correction de la dérive.
   6. Lancer imagerie mouvement de fret direct avec les spécifications time-lapse spécifiques à la dynamique de transport de la cargaison en cours d'analyse (spécifications de microscope et les paramètres pour l'imagerie YFP-PrP ^C sont spécifiés dans la légende de la figure 2 et Matériaux liste).
   7. Une fois les données de mouvement en direct suffisantes ont été recueillies, avoir une personne remplir les réservoirs 2 et 2 'avec du paraformaldéhyde préchauffé 4% dans du PBS contenant 0,04 g / ml de saccharose à fixer les cellules. Évitez de toucher le dispositif microfluidique, car cela perturber la mise au point de l'imagerie en temps réel. Demandez à l'autre personne de l'ajuster en le fixateur est ajouté. La fixation est réussie lorsque l'arrêt immédiat du mouvement est observé. Ajouter fixateur au réservoir 1 et 1 'par la suite.
      REMARQUE: photoblea temporaireching de la fluorescence de la cargaison pourrait également être observée, mais la fluorescence persiste après l'IF pour des protéines motrices est terminée (étape suivante).
      REMARQUE: Paraformaldéhyde est nocif par inhalation, par contact avec la peau et par ingestion. Irritant pour les yeux, les voies respiratoires et la peau. Eliminer conformément aux prescriptions légales.
2. SI coloration de protéines motrices pour l'analyse de colocalisation
   Remarque: Pour la quantification des niveaux relatifs des protéines motrices (tel que déterminé par coloration d'anticorps), associés à des cargaisons mobiles individuels, valider et titrer les anticorps de sorte que la liaison anticorps-antigène est saturé. Cela se fait par la détermination de la spécificité de l'anticorps en utilisant des neurones dans lequel la protéine d'intérêt a été soit mis hors de combat ou assommé, et en effectuant une analyse SI avec l'augmentation des concentrations d'anticorps. Pour les contrôles négatifs, les neurones sont colorés avec des anticorps secondaires, en l'absence d'anticorps primaires. Plus détailléeDescription de validation d'anticorps peut être trouvé dans Encalada et al. ^16, et Szpankowski et al., ^20.
   1. Enlever les lamelles de neurones hippocampiques cultivées en dispositif microfluidique à partir de la platine du microscope. Ne débranchez pas le dispositif microfluidique de la lamelle, comme les microcanaux doivent rester intacts pour superposer les images en direct et fixes. Effectuez les étapes suivantes dans une chambre humide.
   2. Pour assurer la circulation des solutions dans les micro-canaux, de maintenir un différentiel de volume tampon entre les réservoirs 1, 1 'et 2, 2' d'au moins 30 pi. dans toutes les étapes ultérieures. Par exemple, ajouter le volume de 100 ul à des médias réservoir microfluidique 2, 2 ', et le volume de 70 ul de milieux de réservoir microfluidique 1, 1'.
   3. Retirer fixateur de chambres du dispositif microfluidique et laver les cellules trois fois avec du PBS 10 min d'attente entre les lavages.
   4. Perméabiliser les cellules par addition de 0,1% de Triton X-100 diluted dans du PBS pendant 5 min à tous les réservoirs.
   5. Retirer solution de tous les réservoirs et laver avec du PBS. Répétez laver trois fois 10 min d'attente entre les lavages.
   6. Retirer solution de tous les réservoirs et appliquer un tampon de blocage contenant 10% de sérum normal âne et 3% de protéase libre et l'immunoglobuline G (IgG) exempt de BSA dans PBS et incuber pendant au moins 30 min à température ambiante.
   7. Spin solution anticorps boursier primaire à 20 000 g pendant 5 min pour éliminer les précipités. Diluer l'anticorps à une concentration appropriée dans du tampon de blocage. Remplacer le tampon de blocage de dispositif microfluidique avec une solution d'anticorps. Incuber les échantillons pendant 2 heures à température ambiante ou O / N à 4 ° C.
   8. Retirer solution de tous les réservoirs et laver trois fois avec du PBS, 10 min d'attente entre les lavages.
   9. Spin solution anticorps secondaire de l'action à 20 000 g pendant 5 min pour éliminer les précipités. Diluer l'anticorps à une concentration appropriée dans du tampon de blocage. Remplacer PBS avec une solution d'anticorps secondaire. Incuberles échantillons pendant 1 heure à température ambiante.
   10. Retirer solution de tous les réservoirs et laver trois fois avec du PBS, 10 min d'attente entre les lavages.
   11. Remplacer PBS avec ~ 10-20 ul de milieu de montage à la pipette directement milieu de montage dans l'ouverture des canaux reliant les réservoirs. Laisser sécher de milieu de montage pour ~ 20 min - 1 heure à température ambiante.
   12. dispositifs de conserver à 4 ° C à l'abri de la lumière pour éviter photoblanchiment, et les axones d'image dans les deux jours (maximum une semaine) de coloration.
   13. Après coloration est terminée, avec lamelle neurones de l'hippocampe cultivées dans le dispositif microfluidique sur la platine du microscope monter. Localisez la région de l'axone transfectées imagé à l'étape 4.1.1-4.1.7.
   14. Acquérir des images Z-stack (300 marches nm) pour chacun des trois canaux: le fret, moteur 1, moteur 2, en utilisant un objectif à haute résolution (par exemple, un objectif de l'huile ou de l'eau d'ouverture numérique élevée).
       REMARQUE: Acquisition de Z-piles est important que les axones souvent ne poussent pas parfaitement platdans des microcanaux, et donc pas tous points lacrymaux fluorescent sont dans le même plan focal.
3. Cartographie de marchandises
   1. Générer un kymographe de mouvement de marchandises en utilisant un logiciel d'analyse d'images. Le plugin ImageJ développé par Rietdorf et Seitz (EMBL) est recommandé pour générer kymographs (à télécharger voir Liste des matériaux).
      REMARQUE: ImageJ est un domaine public, basé sur Java programme de traitement d'image développé à l'Institut National de la Santé ^27,28 (à télécharger voir la liste des matériaux).
   2. Aligner les images fixes de la cargaison fluorescent (généré à l'étape 04/02/14) manuellement en les superposant sur ​​la position des trajectoires de la kymographe au niveau du point de fixation (figure 2A, B), en utilisant un programme de logiciel disponible dans le commerce (graphiquement Matériaux Liste). Aligner manuellement par superposition de l'image fixe d'abord de la cargaison sur le kymographe et en choisissant manuellement les points lacrymaux de chargement qui correspond à une trajectoire spécifique surla kymographe. Pour obtenir les meilleurs résultats de l'alignement, utiliser la tranche de Z qui est en meilleure mise au point de la cargaison mappé. Plusieurs tranches de Z peuvent être utilisés.
   3. Pour chaque image de la Z-stack (fret, moteur 1 et moteur 2; généré à l'étape 4.2.14) déterminer la coordonnées XY et amplitudes d'intensité pour chaque puncta fluorescent à l'aide d'un algorithme mis en place pour adapter 2D gaussiennes à la fonction d'étalement de point qui représente chaque source ponctuelle dans chacun des trois canaux ^16,20,21 (figure 2D).
      REMARQUE: Pour obtenir le coordonnées XY, un logiciel MATLAB construit personnalisé appelé "moteur colocalisation» a été développé ^16,20, qui intègre un algorithme d'ajustement gaussien développé par Jaqaman, Danuser et collègues ^21-23. Le logiciel et des instructions détaillées pour l'utilisation peuvent être obtenues sur demande.
   4. Pour chacun des points lacrymaux de marchandises qui ont été individuellement mis en correspondance avec les trajectoires mobiles ou fixes sur le kymographe, sélectionnez til coordonnées XY et amplitudes d'intensité à partir des résultats du programme «Motor colocalisation" (ces cargaisons sont étiquetés individuellement à la figure 2B). Utilisez plusieurs images Z-stack acquis à l'étape 4.2.14) pour cartographier plusieurs cargaisons qui se trouvent sur différents plans focaux.
   5. Comparer les coordonnées XY de l'individu pour le fret mis en correspondance avec celles obtenues pour chacun des canaux à moteur dans la tranche de Z correspondant (figure 2D). Déterminer et sélectionner les coordonnées de moteur XY qui sont dans un rayon de 300 nm de la cargaison. Pour les cargaisons et les moteurs qui ont signal dans le même plan focal, utiliser le logiciel "Moteur colocalisation" afin de déterminer les points lacrymaux qui sont situés dans un rayon de 300 nm.

Résultats

La figure 1 montre une vue d'ensemble du dispositif microfluidique utilisé pour la culture des neurones de l'hippocampe (figure 1A, B). Les neurones sont étalées dans le réservoir 1. La taille des micro-canaux empêche la diffusion de corps cellulaires (soma) dans le compartiment axonal tandis que la longueur des canaux d'éviter les projections dendritiques de traverser tout le chemin vers le compartiment axonal. Après ~ 2-3 jours de culture, les neurones commencent à étendre leurs axone...

Discussion

Le protocole présenté ici permet la corrélation de la directionnalité du mouvement des particules fluorescentes individuelles en mouvement sur ​​la base de cargaison microtubules avec le type et la quantité de protéines motrices associées par rapport à des neurones vivants. Auparavant, la composition totale du moteur de cargaisons vésiculaires axonales a été dosée sur des populations hétérogènes de vésicules et des organites ^9,15 biochimiquement purifiée. Cependant, la composition de moteur ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
poly-L-lysine	Sigma	P5899-20mg
D-MEM (Dulbecco' s Eagle Medium modifié) Glycémie élevée, avec L-Glutamine, sans Pyruvate de sodium (1x)	Life Technologies	11965092
FBS (Sérum de Bovin Fœtal)	Life Technologies	10082147
Neurobasal-A Medium (1x)	Life Technologies	10888022
B-27 Supplément Sans Sérum Life Technologies		10888022
GlutaMAX I Supplement (100x)	Life Technologies	35050061
HBSS (1x) (Hank' Life Technologies		24020117
DPBS (Dulbecco' s Solution saline tamponnée au phosphate, sans magnésium, sans calcium (1x)	Life Technologies	14190250
Pénicilline/Streptomycine (100x)	Life Technologies	15140122
Corning cellgro Eau pour la culture cellulaire  ;	Fisher Scientific	MT46000CM
Papain	USB Corporation	19925
DL-cystéine HCl	Sigma-Aldrich	C9768
BSA (albumine sérique bovine)	Sigma-Aldrich	A7906
D-glucose	Sigma-Aldrich	G6152
DNAse I grade II	Roche Applied Sciences	10104159001
Lipofectamine 2000	Life Technologies	;
Solution de formaldéhyde 16 % EM Grade	Fisher Scientific	50980487	Attention : Nocif par inhalation, par contact avec la peau et par ingestion. Irritant pour les yeux, le système respiratoire et la peau. Éliminez conformément aux réglementations officielles.
Saccharose	Fisher Scientific	S5-500
HEPES	Sigma	H-3375
Sérum d’âne normal	Jackson Immuno Research	017-000-0121
BSA sans acides gras et IgG Jackson	Immuno Research	001-000-162
Acétone	Fisher Scientific	BP2403-4
Éthanol	Fisher Scientific	BP2818-100
Réactif anti-décoloration ProLong Gold	Life Technologies	P36934
Verre de couverture 1 1/2. 24 x 40 mm	Corning	2980-244
Dispositif microfluidique d’axe, 450 µ ; m	Millipore	AX450
Adobe Photoshop	Adobe
Nikon Eclipse TE2000-U  ;	Appareil photo Nikon
Coolsnap HQ  ;	Roper Scientific
60 mm	Fisher Scientific	12-565-95
Antenne de culture cellulaire Fisher Scientific 150 mm	Fisher Scientific	12-565-100
Anticorps utilisés :
Chaîne légère anti-kinésine, V-17	Santa Cruz  ;	Spécificité sc-13362	vérifiée à l’aide de neurones KLC1-/- (Réf. 16), dilution recommandée 1:100.
Chaîne lourde anti-dynéine 1, R-325	Santa Cruz  ;	spécificité sc-9115	vérifiée à l’aide de shRNA contre DYN1HC1 (Réf. 16), dilution recommandée 1:100
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody	Life Technologies	A10042	; dilution recommandée 1:200.
Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Life Technologies	A31573	; dilution recommandée 1:200.
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Anticorps IgG Anticorps Life	Technologies	A11057	; dilution recommandée 1:200.
Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody	Life Technologies	A21447	; dilution recommandée 1:200.
Plugins et Macros
ImageJ			; http://imagej.nih.gov/ij/index.html.  ;
ImageJ Kymograph Plugin			http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html.