Caractériser la composition de moteurs moléculaires sur les moyens axonale Cargo Utilisation de l&#39;analyse &quot;Cargo Mapping&quot;

Sylvia Neumann; George E. Campbell; Lukasz Szpankowski; Lawrence S.B. Goldstein; Sandra E. Encalada

doi:10.3791/52029

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Article de méthode

Caractériser la composition de moteurs moléculaires sur les moyens axonale Cargo Utilisation de l'analyse "Cargo Mapping"

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DOI :

10.3791/52029

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30 octobre 2014

Sylvia Neumann¹ , George E. Campbell^*¹ , Lukasz Szpankowski^*²^,³ , Lawrence S.B. Goldstein²^,⁴ , Sandra E. Encalada¹

¹Department of Molecular and Experimental Medicine, Dorris Neuroscience Center, The Scripps Research Institute, ²Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California San Diego, ³Department of Bioengineering, University of California San Diego, ⁴Department of Neurosciences, University of California San Diego School of Medicine

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Le transport intracellulaire des cargaisons, telles que les vésicules ou les organites, est effectué par des protéines motrices moléculaires qui suivent les microtubules polarisés. Ce protocole décrit la corrélation entre la directionnalité du transport des particules de cargaison individuelles se déplaçant à l’intérieur des neurones et la quantité relative et le type de protéines motrices associées.

Résumé

Comprendre les mécanismes par lesquels les moteurs moléculaires coordonnent leurs activités pour le transport de cargaisons vésiculaires dans les neurones nécessite l'analyse quantitative des associations moteur / de fret au niveau de la vésicule unique. Le but de ce protocole est d'utiliser la microscopie quantitative de fluorescence à corréler («carte»), la position et la directionnalité du mouvement de fret direct aux montants de composition et relatives des moteurs associés avec la même cargaison. "Cartographie Cargo» se compose de l'imagerie en direct de cargaisons marquées par fluorescence mobiles dans les axones cultivées sur des dispositifs microfluidiques, suivie par la fixation chimique lors de l'enregistrement de mouvement direct, et immunofluorescence ultérieure (IF) des mêmes régions axonales exactes avec des anticorps contre les moteurs. Colocalisation entre cargaisons et leurs moteurs est évaluée en affectant la position sous-pixel de coordonnées de canaux de moteur et de fret, par gaussiennes de montage à la diffraction-lifonctions d'étalement de point mited représentant sources ponctuelles fluorescentes individuelles. Images de fret et moteur fixe sont ensuite superposées à des parcelles de mouvement de la cargaison, à la «carte» à leurs trajectoires suivies. La force de ce protocole est la combinaison de vivre et si les données à enregistrer à la fois le transport de cargaisons vésiculaires dans des cellules vivantes et de déterminer les moteurs associés à ces mêmes vésicules exactes. Cette technique permet de surmonter les problèmes antérieurs qui utilisent des méthodes biochimiques pour déterminer la composition moyenne du moteur de populations purifiées de vésicules en vrac hétérogènes, car ces méthodes ne révèlent pas des compositions sur des cargaisons de mobiles simples. Par ailleurs, ce protocole peut être adapté à l'analyse d'autres voies de transport et / ou de traite dans d'autres types de cellules à mettre en corrélation le mouvement des structures intracellulaires individuels avec leur composition en protéines. Limitations de ce protocole sont le débit relativement faible en raison des faibles efficacités de transfection de cultureneurones primaires et un champ de vision limité disponible pour l'imagerie haute résolution. Les applications futures pourraient inclure des méthodes pour augmenter le nombre de neurones exprimant cargaisons marquées par fluorescence.

Introduction

Le transport intracellulaire est essentiel dans tous les types de cellules pour la délivrance de protéines, les membranes, les organelles et les molécules de signalisation cellulaire à divers domaines ^1. Les neurones sont des cellules spécialisées avec très longues, projections polarisés qui dépendent de façon critique sur le transport intracellulaire des cargaisons essentielles pour leur livraison sur de longues distances à différents microdomaines axonales. Ce transport est médiée par kinésines et dynéines - deux grandes familles de protéines motrices moléculaires - qui se lient à des cargaisons et de suivre le long des microtubules polarisés en antérogr....