L'échantillonnage du sol et isolement de nématodes entomopathogènes (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Résumé

Les nématodes entomopathogènes sont des vers ronds terricoles qui parasitent une grande variété d'insectes. Nous démontrons méthodes d'échantillonnage utilisées pour l'isolement de ces nématodes dans le sol au moyen de deux techniques: l'appâtage des insectes et le piège blanc modifié, pour la récupération des nématodes à partir d'échantillons de sol et de cadavres d'insectes infectés, respectivement.

Résumé

Les nématodes entomopathogènes (aka EPN) représentent un groupe de nématodes terricoles qui parasitent une grande variété d'insectes. Ces nématodes appartiennent à deux familles: Steinernematidae et Heterorhabditidae. Jusqu'à présent, plus de 70 espèces ont été décrites dans le Steinernematidae et il ya environ 20 espèces dans le Heterorhabditidae. Les nématodes ont un partenariat mutualiste avec des bactéries Enterobacteriaceae et ensemble, ils agissent comme un puissant complexe insecticide qui tue un grand nombre d'espèces d'insectes.

Ici, nous nous concentrons sur les techniques les plus courantes en considération pour la collecte de l'EPN du sol. La deuxième partie de cette présentation se concentre sur la technique de l'insecte-appâts, une approche largement utilisée pour l'isolement de l'EPN à partir d'échantillons de sol, et la technique de piège Blanc modifié qui est utilisé pour la récupération de ces nématodes des insectes infectés. Ces méthodes et ces techniques sont les principales étapes pour la mise en place réussie de l'EPN culteres dans le laboratoire et également former la base pour d'autres essais biologiques qui considèrent que ces nématodes comme organismes modèles pour la recherche dans d'autres disciplines biologiques. Les techniques présentées dans cette présentation correspondent à ceux exécutés et / ou conçu par les membres du SP Stock laboratoire ainsi que ceux décrits par différents auteurs.

Introduction

Beaucoup de nématodes sont associés avec des insectes, et leurs interactions hôte vont de bénéfique à préjudiciable. Ici, nous nous concentrons sur un groupe de nématodes qui sont des agents pathogènes d'insectes, aussi connu comme nématodes entomopathogènes (ou EPN). Deux familles de nématodes appartiennent à ce groupe de nematodes: Steinernematidae et Heterorhabditidae ^11,13. Leur effet pathogène est en effet conféré par leur interaction avec les bactéries entériques facultatives anaérobies (bactéries Xenorhabdus associent steinernematids et bactéries Photorhabdus associer à heterorhabditids) ^2. Les bactéries sont vectorisés d'un insecte hôte à un autre par la seule étape sans nématodes vivant, le mineur infectieux de la troisième étape (également connu sous le nom dauer juvénile, juvénile infectieux ou IJ), qui vit dans le sol. Une fois à l'intérieur de l'insecte, les nématodes libèrent les bactéries dans l'hémolymphe de l'insecte, qui tuent l'hôte de l'insecte par septicémie massif. Les bactéries aussidégrader les tissus de l'insecte et deviennent la source de nourriture des nématodes, ce qui leur permet de mûrir et de se multiplier. Habituellement, une ou deux générations de nématodes adultes sont produits dans le cadavre d'insecte. La descendance des dernières réassocie génération adulte avec quelques cellules bactériennes dans un plus spécialiser de manière que leur relation nutritionnel précédente, et de nourrir ces cellules dans leurs intestins comme ils se déplacent hors de la carcasse de l'insecte dans le sol où ils attendront un autre insecte à parasiter ^6,11,14 (Figure 1).

Depuis leur découverte en 1927, l'EPN ont été considérés comme des alternatives valables aux pesticides chimiques, car ils peuvent parasiter un large éventail d'insectes qui sont nuisibles agricoles ^3,4,5. Cependant, au cours des deux dernières décennies, ces nématodes et leurs bactéries symbiotiques ont été reconnus comme un système modèle pour l'étude malléable aspects biologiques, écologiques et évolutifs de l'hôte microbe INTERACTIONns ^14.

Le but de cette présentation est de montrer les méthodes et les techniques les plus couramment utilisées pour l'échantillonnage et l'isolement de l'EPN sol. Une variété d'outils est disponible et peut être utilisé pour prélever des échantillons de sol, y compris: carottiers du sol, truelles, pelles post-trous, tarières, des tubes d'échantillonnage, pelles à la main, entre autres (figure 2).

Selon le but de l'étude, deux stratégies d'échantillonnage peuvent être envisagées: a) stratifié, b) un échantillonnage aléatoire (Figure 3). L'échantillonnage stratifié est habituellement utilisé dans le cadre d'une étude intensive dans une zone déterminée ou démarquée sur une période de temps donnée. En général, un transect est démarquée et des échantillons de sol sont prélevés à des intervalles prévus dans le transect sur ​​une période de temps (figure 3A) ^15. L'échantillonnage aléatoire est généralement utilisé lorsqu'on se concentre sur une vaste zone. Cette stratégie d'échantillonnage a été utilisée pour étudier la diversité des EPN felon une grande surface ou d'une région géographique (figure 3B) ^12. Un certain nombre de facteurs peut être considéré en fonction de l'objet de l'étude, y compris un large éventail de hauteurs, textures de sol et des habitats (p. ex., Les champs cultivés, les forêts, les pâturages, parcs, bords de mer, les zones riveraines, etc.)

Nous montrons la technique de l'insecte-appâts, qui a été initialement décrit par Literie et Akhurst ¹ et représente une alternative simple et sélective pour la récupération de l'EPN à partir d'échantillons de sol. Il s'agit d'une procédure sélective qui est basée sur la prémisse que les nématodes (stade IJ) seront attirés par un insecte hôte et parasitent il. Cette technique peut également être envisagée pour l'isolement d'autres agents pathogènes tels que les insectes, les champignons et les bactéries ^8,10.

Nous démontrons également la technique de piège blanc modifié qui est utilisé pour récupérer la descendance des nématodes chez des hôtes d'insecte infectées ^7,14. Il s'agit d'un effort rencontréhod qui offre l'avantage de récupérer un «propre» nématode progéniture libre de débris des cadavres d'insectes dégradantes.

Enfin, les techniques décrites et présentées dans cet article correspondent à ceux conçus et / ou réalisés dans notre laboratoire ainsi que ceux décrits par divers collègues et collaborateurs.

Protocole

1. Sol de prélèvement des échantillons

1. Considérez couvrant une superficie minimale de 2 - 4 m ² pour chaque site d'échantillonnage.
2. Prélever des échantillons de sol à une profondeur d'au moins 15 cm (Figure 4).
3. Prenez au moins 5 échantillons aléatoires dans ce domaine.
4. Prendre 3 sous-échantillons par échantillon. Selon l'objectif de l'étude, soit combiner les sous-échantillons ou les garder séparés.
5. Placer chaque échantillon dans un sac en plastique. Considérez double ensachage pour éviter les fuites d'échantillons (Figure 4).
6. échantillons d'étiquettes avec un marqueur à encre indélébile. Inclure les informations suivantes pour chaque site d'échantillonnage: l'information du site (y compris localité / région / nom et coordonnées GPS site d'information), la date, l'habitat, la végétation associée, la température, l'altitude, etc
   REMARQUE: Le cas échéant, recueillir et / ou d'enregistrer la présence d'insectes ou autres invertébrés récoltés à l'échantillon pour identification ultérieure. Ils peuvent représenter natur potentielhôtes al EPN.
7. Outils de collecte propres entre les échantillons par lavage à l'eau et / ou les désinfecter avec 70% d'éthanol ou d'eau de Javel à 0,5%.
8. Conserver les échantillons dans un refroidisseur (8-15 ° C) pendant le transport vers le laboratoire.
9. Prendre une partie de l'échantillon de sol pour analyse afin d'obtenir des informations sur la composition du sol, la texture, l'humidité, la conductivité électrique ou d'autres paramètres relatifs au sol souhaitées.

. 2 nématode Isolement à partir des échantillons de sol: Technique de l'insecte-appâts

1. Enlevez tous les débris (c'est à dire., Roches, des morceaux de bois ou d'écorce, feuilles, etc.) Recueillies avec vos échantillons pour éviter la contamination par des micro-organismes saprophytes.
2. Ajouter de l'eau pour humidifier le sol et faciliter la circulation des nématodes.
   REMARQUE: Utilisez un vaporisateur d'augmenter lentement le niveau du sol de l'humidité.
3. Placer environ 200 à 250 ml d'un sol humide dans un récipient en plastique propre avec un couvercle.
4. Ajouter appâts insectes. Considérons 5 à 10 insectes à la surface du sol de chaque échantillon (figure 5).
5. Couvrir le récipient avec un couvercle et tournez récipients à l'envers.
6. Maintenir les récipients dans l'obscurité et à température ambiante (généralement 22-25 ° C).
7. Vérifiez tous les récipients 2 - 3 jours et enlever les insectes morts.
   REMARQUE: ajouter insectes sains supplémentaires pour chaque conteneur pour plus d'appâtage de l'échantillon de sol.
8. Retirer les insectes morts des conteneurs. NOTE: Les cadavres avec une brune ou ocre coloration sont généralement parasités par steinernematids, alors que la brique rouge à violet foncé cadavres sont parasités par heterorhabditids.
9. Rincer cadavres dans l'eau stérile.
10. Placez cadavres dans un piège blanc modifié pour la récupération des nématodes progéniture (voir la procédure ci-dessous).

Piège Blanc modification:. 3 nématode récupération de cadavres infectés

1. Placez le haut de 50 (ou 60) mm de diamètre. Boîte de Petri dans un plat plus grand (100 mm).
2. Définir un péchépapier filtre circulaire GLE (Whatman n ° 1) à l'intérieur du petit plat.
3. La place des cadavres sur le papier filtre du plus petit plat s'assurer que les cadavres ne se touchent pas les uns des autres pour éviter toute contamination.
4. Remplissez le extérieure (plus grande) boîte de Pétri avec ca. 20 ml d'eau distillée stérile. Ne pas ajouter de l'eau dans le plat qui contient les cadavres.
5. Couvrir la grande boîte de Pétri et son contenu avec le couvercle (Figure 6).
6. Étiqueter plats en conséquence. Ajoutez les informations suivantes: nom nématodes (espèces / isolé), la date de l'infection (infection de date a été fixée) et la date de piège (il s'agit de la date à laquelle le piège est mis en place).
7. Gardez piège à température ambiante jusqu'à la levée des stades juvéniles infectieux (JI) se produit. Ce processus peut prendre entre 10 - 25 jours selon les espèces et / ou souche considérée nématodes.
8. l'eau de récolte avec JI en enlevant le plus grand plat du piège et verser de l'eau par des nématodes dans un bécher.
9. Permettre aux nématodes à décanter au fond de la beaker. Ce processus peut prendre quelques minutes.
10. Versez de l'eau avec précaution, en s'assurant que les nématodes restent dans le fond du récipient.
11. Rincer les nématodes en ajoutant plus d'eau et permettant nématodes à décanter. Cette étape peut être répétée 2 à 3 fois jusqu'à ce que l'eau est propre.
12. Placer nématodes en suspension dans un flacon de culture tissulaire (250 ml). Maintenir la concentration de la suspension à 1000 - 3000 nématodes / ml.
13. fiole de magasin avec des nématodes en suspension dans une chambre froide ou dans l'incubateur entre: 10 - 20 ° C.
    REMARQUE: consultez flacons stockés périodiquement la durée de vie de l'EPN est variable. Habituellement steinernematids peuvent être stockés pour les 6 - 12 mois sans la nécessité de repiquage, alors que heterorhabditids peuvent nécessiter plus de contrôles périodiques.

Résultats

Sol de prélèvement des échantillons

Troisième stade juvéniles infectieux de l'EPN sont les seules étapes de vie libre dans le cycle de vie de ces nématodes qui se trouvent dans le sol (figure 1). Par conséquent, la collecte des échantillons de sol est une méthode très efficace pour récupérer de ces nématodes. Figure 4 montre un profil de sol indiquant la profondeur à laquelle les échantillons doivent être prises. La préservation de l'humidité d'un échantillo...

Discussion

Cette démonstration est le premier des deux présentations qui décrivent un certain nombre de techniques qui sont couramment utilisés pour l'étude de l'EPN et de leurs bactéries symbiotiques. Ces techniques constituent des étapes clés de la mise en place réussie des cultures de l'EPN dans le laboratoire et constituent également la base pour d'autres essais biologiques qui emploient EPN comme organismes modèles pour la recherche.

Diverses études de sol de l'EPN ont montré q...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Galleria mellonella	Timberline	http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG	Pour la technique d’appâtage des insectes
Papier filtre, 55 mm Cellulose grade 1	Whatman/VWR	28450-048	Chambre d’infection et piège blanc
60 x 15 mm Boîtes de Pétri	VWR	25384-092	Chambre d’infection et piège blanc
100 x 15 mm Boîtes de Pétri	VWR	25384-088	Chambre d’infection et piège blanc
Sacs en plastique ZIPloc	Ace Hardware ou quincaillerie		Prélèvement de sol Pipette
mécanique P1000, P200 ml	VWR	89130-562 ; 89130-566  ;	Chambre d’infection et ensemble piège blanc
Embouts Pippetor 1000ml, 200 ml	VWR	16466-004 ; 53510	Chambre d’infection et ensemble piège blanc
Bleach	Ace Quincaillerie ou quincaillerie		Prélèvement de sol , désinfection
Hypochlorite de sodium	Ace Quincaillerie ou quincaillerie		Prélèvement de sol , désinfection
70 % Ethyl alochol	AAPER	17212945	Prélèvement de sol , désinfection
Pelles	Ace Hardware ou quincaillerie locale	N/A	Échantillonnage de
sol Échantillonneur de sol tubulaire	Accuproducts		Échantillonnage de sol
Sonde de sol, manche long	Nupla  ;	PRB4T 69401 Classic	Échantillonnage de sol
Ruban à mesurer	Ace Hardware ou quincaillerie		Échantillonnage de sol
Ruban de signalisation, différentes couleurs	Ace Hardware ou quincaillerie		Échantillonnage de sol
Flacons de culture tissulaire	VWR	Falcon, 29185-304  ;	Piège blanc, collection d’EPN
Flacons de toilette, polyéthylène, col large	VWR	16650-107	Piège blanc, collection d’EPN