Pour analyser les profils cardiaques de l'expression des gènes au cours du développement cardiaque du poisson zèbre, l'ARN total doit être extrait à partir des coeurs isolés. Ici, nous présentons un protocole de collecte coeurs fonctionnels / battant par la dissection manuelle rapide des embryons de poisson zèbre pour obtenir ARNm spécifique cardiaque.
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Article de méthode
À grande échelle de poisson zèbre embryonnaire Coeur Dissection d'analyse transcriptionnelle
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le cœur embryonnaire du poisson zèbre est composé de seulement quelques centaines de cellules, qui ne représente qu'une petite fraction de l'ensemble de l'embryon. Par conséquent, afin d'empêcher le transcriptome cardiaque d'être masqué par le transcriptome embryonnaire mondiale, il est nécessaire de collecter un nombre suffisant de coeurs pour d'autres analyses. En outre, comme le développement cardiaque poisson zèbre se déroule rapidement, collection de coeur et des méthodes d'extraction d'ARN ont besoin d'être rapide afin d'assurer l'homogénéité des échantillons. Ici, nous présentons un protocole de dissection manuelle rapide pour la collecte coeurs fonctionnels / battant à partir d'embryons de poisson zèbre. Ce est une condition essentielle pour l'extraction de l'ARN spécifiquement cardiaque ultérieure pour déterminer les niveaux d'expression de gènes spécifiques cardiaque par analyse du transcriptome, comme quantitative en temps réel la réaction en chaîne par polymérase (RT-qPCR). Le procédé est basé sur les propriétés adhésives différentielles du poisson zèbre embryonnaire cœur par rapport à d'autres tissus; ce qui permet pour la PHY rapidela séparation des sique du tissu cardiaque extracardiaque par une combinaison de la perturbation de la force de cisaillement fluidique, la filtration par étapes et la collecte manuelle des transgéniques coeurs marqués par fluorescence.
Introduction
Poisson zèbre (Danio rerio) est largement utilisé en biologie du développement à étudier l'organogenèse in vivo en raison de son développement embryonnaire rapide, transparente et extra-utérine, combinée avec la petite taille et de la disponibilité de lignes de journaliste transgéniques avec expression tissu-spécifique de protéines fluorescentes. Ce petit vertébré est particulièrement bien adapté pour étudier le développement de coeur parce que l'oxygénation de l'embryon de poisson zèbre début ne repose pas sur du rythme cardiaque et la circulation sanguine; ces caractéristiques ont permis la caractérisation d'un grand nombre de mutants cardiovasculaires 1,2 et le poisson zèbre est maintenant un organisme modèle largement reconnu pour étudier les maladies cardiaques 3.
Pour étudier l'expression des gènes au cours du développement embryonnaire, les transcriptions sont généralement analysées par l'ensemble du montage hybridation in situ (WISH) 4, RT-qPCR 5, 6, ou microarrays séquençage de prochaine génération (ARN-Seq) 7. Tandis queWISH permet une analyse spatio-temporelle de l'expression des gènes dans l'ensemble embryon, les niveaux de transcription sont habituellement évaluée par RT-PCR quantitative, des puces ou des approches d'ARN-Seq. Cependant, ces procédés nécessitent un enrichissement spécifique de tissu pour le profilage de l'expression génique.
Étant donné que le cœur embryonnaire du poisson zèbre ne représente qu'une petite fraction de l'ensemble de l'embryon, les études du transcriptome au cours du développement cardiaque nécessitent un protocole de dissection et l'enrichissement des cœurs. En outre, pour obtenir des données physiologiquement pertinentes, il est important de maintenir le tissu cardiaque entièrement fonctionnel jusqu'à l'extraction d'ARN. Ici, nous décrivons un protocole pour isoler rapidement physiologiquement normal et le cœur battant de centaines d'embryons de poisson zèbre pour obtenir efficacement des échantillons d'ARN de haute qualité pour des analyses ultérieures. La présente méthode est basée sur le protocole rapporté par Burns et MacRae, 2006 8. Pour l'enrichissement du tissu cardiaque, les deux méthodes utilisent une ligne rapporteur infarctus transgéniqueet de profiter des propriétés d'adhérence différentielle de cœurs embryonnaires de poisson zèbre par rapport aux autres tissus. En bref, par pipetage de nombreux embryons monter et descendre dans une pipette étroite, coeurs sont diffusés simultanément des organismes embryonnaires et ensuite séparés des débris embryonnaire en deux étapes rapides de filtration; coeurs marqués par fluorescence sont ensuite triées manuellement à partir de débris restants et recueillies pour un traitement ultérieur.
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Protocole
Ce protocole suit les directives de protection des animaux de la loi allemande et de l'État de Berlin; la manipulation du poisson zèbre a été contrôlée par l'autorité locale pour la protection des animaux (LaGeSo, Berlin-Brandebourg).
1. Obtenir embryons de poissons zèbres pour l'extraction de coeur
- Croix journaliste poisson zèbre cardiaque tels que la Tg (myl7: EGFP) twu34 lignée transgénique neuf afin d'obtenir des embryons avec la GFP expression spécifique cardiaque.
- Maintenir les embryons dans l'eau d'œuf à 28,5 ° C jusqu'à ce que le stade embryonnaire souhaité 10,11. Assurez-vous que la population d'embryons collectés est homogène génétiquement et par stade de développement pour limiter les variations dans l'expression des gènes.
- Dechorionate les embryons manuellement.
2. dissection de poisson-zèbre coeurs embryonnaires
NOTE: Gardez toutes les solutions sur la glace. Si possible, faire le travail d'équipe: une personne dissèque les cœurs de l'embryô tandis qu'une autre personne trie les âmes sous le stéréomicroscope de fluorescence. Ceci permet le traitement de plusieurs centaines d'embryons en quelques heures.
- Transférer environ 100 embryons dans un tube de 1,5 ml de centrifugation. Anesthésier les embryons avec de tricaïne (0,16 mg / ml dans du milieu E3). Procéder une fois que les embryons sont clairement anesthésiés (ils ne savent pas nager et les sédiments au fond du tube, mais leurs cœurs sont encore battre).
- Retirer la solution / E3 de tricaïne et laver les embryons une fois avec 1 ml de L-15/10% de milieu de FBS et de maintenir sur la glace.
NOTE: Le milieu FBS L-15/10% est important de garder les organes et les cellules vivantes pendant la procédure de dissection ensemble jusqu'à ce que les cœurs ont été transférés dans RNAlater ou Trizol. - Ajouter 1 ml de L-15/10% de milieu de FBS aux embryons et la pipette de haut en bas 5-8 fois avec un chargement de gel pointe ronde jusqu'à ce que le jaune est complètement perturbé. Pipette les embryons goutte à goutte sur la surface de la solution, de sorte que la baisse va éclater etles embryons sont doucement perturbés.
NOTE: Comment vigoureusement et à quelle fréquence les embryons doivent être pipette de haut en bas dépend du stade de développement des embryons, soit plus pipetage est nécessaire à un stade avancé (par exemple à 56 HPF). - Pour le premier lot d'embryons disséqués, évaluer l'intégrité des embryons et la proportion des cœurs disséqués sous un stéréomicroscope, puisque certains coeurs peuvent rester attachées aux embryons si trop délicatement la pipette. Réglez le mode de pipetage pour les prochains tours de dissection en conséquence.
REMARQUE: Utiliser des embouts de pipette rétention bas et microtubes de minimiser coeurs coller au plastique. - Appliquer l'échantillon sur un filtre de 100 um placé sur un tube de 50 ml de centrifugation; rincer le tube de 1,5 ml avec 1 ml de milieu L-15/10% de FBS, puis d'appliquer ce filtre dans le but de minimiser la perte de l'échantillon (quelques cœurs peuvent adhérer aux parois du tube). Laver le filtre deux fois avec 1 ml de L-15 / 10% de FBS. Dans cette étape les coeurs passent à travers le filtre et sont recueillis dans le tube de 50 ml.
- Appliquer l'écoulement sur un filtre 30 um placé sur un tube de 15 ml de centrifugation et rincer le filtre une fois avec 1 ml de L-15/10% de milieu de FBS. Dans cette deuxième étape de filtration, les coeurs sont retenues dans le filtre et les débris plus petits est éliminé par lavage.
- Tournez le filtre à l'envers et rincer les coeurs sur le filtre dans un plat de 1% d'agarose revêtues de Pétri en appliquant trois lavages consécutifs avec 1 ml de L-15/10% de FBS.
- De séparer manuellement les cœurs GFP-positives de débris embryonnaires non fluorescent (par exemple des lentilles oculaires) avec une paire de pinces sous un stéréomicroscope à fluorescence et les concentrer dans le centre de l'assiette. Collectionnez-les selon l'étape 3.
NOTE: Si les embryons sont plus âgés que 24 HPF, les cœurs doivent être battent, ce qui indique que les tissus sont encore physiologiquement normal.
3. Isolement de l'ARNm de dissectionCoeurs TED
- Recueillir les coeurs dans le plus petit volume possible (par exemple 10 pi) et la pipette dans un tube de 1,5 ml contenant 0,75 ml RNAlater (sur la glace). Vérifiez qu'aucune coeurs restent dans la pointe de la pipette en la considérant sous un stéréomicroscope à fluorescence.
- En variante, si une hotte chimique est disponible dans le voisinage immédiat du microscope à fluorescence, le transfert dans les cœurs recueillies Trizol (ATTENTION) sous le capot chimique. Cela évite la perte possible de coeurs collage dans la pointe de pipette et également pendant la centrifugation des coeurs (étapes 3.4, 3.5 et 3.7). Mutualiser les cœurs de plusieurs séries d'isolement dans le même tube avec Trizol et aller directement à l'étape 3.8; le volume final ne doit pas dépasser 10% du volume initial Trizol.
REMARQUE: Lire le Trizol Fiche de données de sécurité (FDS) avant utilisation. Poignée réactif Trizol sous une hotte et l'usure sur l'équipement de protection individuelle. Eviter le contact avec la peau, les yeux et Clothing. Retirer toutes les sources d'ignition. - Réunir les cœurs de plusieurs cycles d'isolation dans le même tube avec le RNAlater (sur glace), que l'efficacité de l'isolement de l'ARN se améliore avec la quantité de tissu recueilli. Si le volume de l'échantillon total dépasse 10% du volume de RNAlater origine, utilisez un tube supplémentaire avec 0,75 ml RNAlater pour le stockage (sur la glace).
- Centrifuger les échantillons à 15 700 g pendant 20 min à 4 ° C pour sédimenter les cœurs.
- Sous un microscope stéréoscopique à fluorescence, recueillir soigneusement autant de surnageant que possible dans une boîte de Pétri d'agarose revêtues 1% contenant 3 ml de L-15/10% de milieu FBS, mais ne pas déranger les cœurs sédimentées au fond du tube de centrifugation. Depuis jusqu'à 15% des coeurs peut rester dans le surnageant en raison de la viscosité élevée de RNAlater, les récupérer comme décrit dans l'étape 3.7.
- Sous une hotte chimique, ajouter 0,5 ml Trizol au tube contenant les cœurs sédimentées et garder sur la glace.
- Sous la microsco fluorescentepe, transférer le cœur (de l'étape 3.5) de la coupelle d'agarose revêtues 1% contenant la solution de FBS RNAlater / L-15/10% dans un autre plat d'agarose revêtues 1% avec 3 ml de L-15/10% de FBS à diluer le RNAlater. Recueillir les coeurs dans le centre de la boîte de Pétri et les transférer dans un petit volume dans le tube de coeurs sédimentées dans Trizol sous une hotte chimique.
- Vortex le tube de 1,5 ml contenant les cœurs Trizol perturber les cœurs et incuber pendant 5 min à température ambiante.
- Sous une hotte chimique, ajouter 100 pi de chloroforme (ATTENTION), mélanger soigneusement et transférer la solution / chloroforme Trizol dans un tube de 1,5 ml pré-filé PLG (centrifugeuse 30 secondes à la vitesse maximale avant utilisation). Incuber pendant 3 min à la température ambiante.
REMARQUE: Lire la FS de chloroforme avant utilisation. Poignée réactif de chloroforme sous une hotte et l'usure sur l'équipement de protection individuelle. Eviter le contact avec la peau, les yeux et les vêtements. Tenir à l'écart des matières incompatibles telles que les métaux, les alcalis. - Centrifuge de l'échantillon à 15 700 xg pendant 15 min à 4 ° C et transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube de 1,5 ml.
- Ajouter 5-10 ug glycogène et 250 pi préalablement refroidis (à -20 ° C) isopropanol; bien mélanger et incuber pendant la nuit à -20 ° C.
- Centrifuger l'échantillon à 15 700 g pendant 30 min à 4 ° C et jeter le surnageant.
- Laver le culot avec 1 ml 75% d'éthanol, centrifuger à 15 700 g pendant 15 min à 4 ° C et jeter le surnageant.
- Laisser évaporer l'éthanol par séchage de la pastille à la température ambiante jusqu'à ce qu'il devienne blanc (par exemple, pour 10 à 15 min).
- Ajouter 20 ul de RNase-free ddH 2 O au culot et incuber pendant 10-15 min à 55 ° C pour dissoudre l'ARN; puis garder sur la glace.
- Évaluer la concentration d'ARN et la pureté par mesure d'absorbance. Évaluer l'intégrité de l'ARN par l'exécution de l'échantillon sur un gel d'agarose à 1%.
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Résultats
Ici, nous décrivons une expérience coeur de dissection représentant utilisant le poisson zèbre Tg (myl7: GFP) twu34 lignée transgénique neuf, qui exprime la protéine fluorescente verte (GFP) exclusivement dans le myocarde (Fig 1.). Nous avons recueilli les deux les cœurs disséqués et les embryons à partir de laquelle ils ont été dérivés pour évaluer la pureté de l'échantillon de coeur. Brièvement, homozygote Tg (myl7: GFP) twu34 poisson zèbre 9 ont été par cr...
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Discussion
Ce protocole permet l'enrichissement rapide de poisson zèbre tissu cardiaque embryonnaire pour l'expression génique analyse. La quantité et la qualité de l'échantillon d'ARN spécifiquement cardiaque dépend grandement sur quelques étapes cruciales: d'abord, la quantité de l'échantillon est grandement améliorée si la perte de coeurs est empêché à chaque étape du protocole, car la purification de l'ARN ne fonctionnera qu'avec suffisante matière de départ. D'autre part, la pureté de l'...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous tenons à remercier C. Burns, C. McRae pour avoir décrit le principe de base de ce protocole de purification, et F. Priller pour la mise en œuvre initiale de cette méthode dans notre laboratoire. S.A.-S. est soutenu par une chaire Heisenberg de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Ce travail a été soutenu par la subvention DFG SE2016/7-1.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Matériel pour l’élevage des poissons et la collecte des œufs ; | voir le livre Zebrafish Book11 pour plus de détails | ||
| Stéréomicroscope | |||
| Microcentrifuge | |||
| Spectrophotomètre | UVe.g. Thermo Scientific Nanodrop 2000 | ||
| Chambre | |||
| d’électrophorèse d’acide nucléiqueBoîtes de Pétri 4 cm Ø ;, enrobées d’agarose à 1 % en milieu | |||
| Micropipettes et pointes (P20, P100, P1000) | |||
| Tubes de centrifugation de 1,5 ml Tubes | |||
| centrifugation de 15 ml et 50 ml | |||
| Paire de pinces | |||
| Dumont #5ExactaCruz&commerce ; Embouts de chargement de gel ronds dans un rack stérile, 1-200&mu ; l ; | Santa Cruz | sc-201732 | |
| 100 &mu ; m filtre (BD Falcon 100 mm Cell Strainer) | BD Biosciences | 352360 | |
| 30 &mu ; m filtre (filtres de pré-séparation-30 µ ; m) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Gel à verrouillage de phase, lourd, tubes de 1,5 ml ; | Prime | 2302810 | |
| Oeuf eau moyenne | 60 &mu ; g/ml Sels de mer instantanés de l’océan en ddH2O, 0,00001 % (p/v) Bleu de méthylène | ||
| E3 moyen ; | 5 mM de NaCl, 0,17 mM de KCl, 0,33 mM de CaCl2, 0,33 mM de MgSO4 | ||
| Tricaïne (3-amino benzoïque) | Sigma-Aldrich | A-5040 | 4 mg/ml Solution mère de tricaïne, pH 7 |
| 1 % d’agarose (en milieu E3) | |||
| Gel d’agarose à 1 % (en tampon TBE) | |||
| Leibovitz´ ; s L-15 moyen ; | Gibco | 21083-027 | |
| FBS (Sérum de Bovin Fœtal) | Sigma | F4135 | |
| ARNAlater | Ambion | AM7020 | |
| Trizol | Ambion | 1559606 | |
| Glycogène ; | Invitrogen | 10814-010 | 20 & micro ; g/µ ; l dans de l’eau sans RNase |
| chloroforme | |||
| isopropanol | |||
| 75 % éthanol (dans DEPC-ddH2O) | |||
| Eau sans nucléase ou stérilisée traitée DEPC ddH2O | |||
| charge d’acide nucléique | |||
| Tampon TBE (Tris/Borate/EDTA) pour électrophorèse |
Références
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Réimpressions et autorisations
