À grande échelle de poisson zèbre embryonnaire Coeur Dissection d'analyse transcriptionnelle

Résumé

Pour analyser les profils cardiaques de l'expression des gènes au cours du développement cardiaque du poisson zèbre, l'ARN total doit être extrait à partir des coeurs isolés. Ici, nous présentons un protocole de collecte coeurs fonctionnels / battant par la dissection manuelle rapide des embryons de poisson zèbre pour obtenir ARNm spécifique cardiaque.

Résumé

Le cœur embryonnaire du poisson zèbre est composé de seulement quelques centaines de cellules, qui ne représente qu'une petite fraction de l'ensemble de l'embryon. Par conséquent, afin d'empêcher le transcriptome cardiaque d'être masqué par le transcriptome embryonnaire mondiale, il est nécessaire de collecter un nombre suffisant de coeurs pour d'autres analyses. En outre, comme le développement cardiaque poisson zèbre se déroule rapidement, collection de coeur et des méthodes d'extraction d'ARN ont besoin d'être rapide afin d'assurer l'homogénéité des échantillons. Ici, nous présentons un protocole de dissection manuelle rapide pour la collecte coeurs fonctionnels / battant à partir d'embryons de poisson zèbre. Ce est une condition essentielle pour l'extraction de l'ARN spécifiquement cardiaque ultérieure pour déterminer les niveaux d'expression de gènes spécifiques cardiaque par analyse du transcriptome, comme quantitative en temps réel la réaction en chaîne par polymérase (RT-qPCR). Le procédé est basé sur les propriétés adhésives différentielles du poisson zèbre embryonnaire cœur par rapport à d'autres tissus; ce qui permet pour la PHY rapidela séparation des sique du tissu cardiaque extracardiaque par une combinaison de la perturbation de la force de cisaillement fluidique, la filtration par étapes et la collecte manuelle des transgéniques coeurs marqués par fluorescence.

Introduction

Poisson zèbre (Danio rerio) est largement utilisé en biologie du développement à étudier l'organogenèse in vivo en raison de son développement embryonnaire rapide, transparente et extra-utérine, combinée avec la petite taille et de la disponibilité de lignes de journaliste transgéniques avec expression tissu-spécifique de protéines fluorescentes. Ce petit vertébré est particulièrement bien adapté pour étudier le développement de coeur parce que l'oxygénation de l'embryon de poisson zèbre début ne repose pas sur du rythme cardiaque et la circulation sanguine; ces caractéristiques ont permis la caractérisation d'un grand nombre de muta....

Protocole

Ce protocole suit les directives de protection des animaux de la loi allemande et de l'État de Berlin; la manipulation du poisson zèbre a été contrôlée par l'autorité locale pour la protection des animaux (LaGeSo, Berlin-Brandebourg).

1. Obtenir embryons de poissons zèbres pour l'extraction de coeur

1. Croix journaliste poisson zèbre cardiaque tels que la Tg (myl7: EGFP) ^twu34 lignée transgénique ^neuf afin d'obtenir des embryons avec la GFP expression spécifique cardiaque.
2. Maintenir les embryons dans l'eau d'œuf à 28,5 ° C jusqu'à ce que le stade embryonnaire sou....

Résultats

Ici, nous décrivons une expérience coeur de dissection représentant utilisant le poisson zèbre Tg (myl7: GFP) ^twu34 lignée transgénique ^neuf, qui exprime la protéine fluorescente verte (GFP) exclusivement dans le myocarde (Fig 1.). Nous avons recueilli les deux les cœurs disséqués et les embryons à partir de laquelle ils ont été dérivés pour évaluer la pureté de l'échantillon de coeur. Brièvement, homozygote Tg (myl7: GFP) ^twu34 poisson zèbre ⁹ ont été par cr.......

Discussion

Ce protocole permet l'enrichissement rapide de poisson zèbre tissu cardiaque embryonnaire pour l'expression génique analyse. La quantité et la qualité de l'échantillon d'ARN spécifiquement cardiaque dépend grandement sur quelques étapes cruciales: d'abord, la quantité de l'échantillon est grandement améliorée si la perte de coeurs est empêché à chaque étape du protocole, car la purification de l'ARN ne fonctionnera qu'avec suffisante matière de départ. D'autre part, la pureté de l'.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Matériel pour l’élevage des poissons et la collecte des œufs  ;			voir le livre Zebrafish Book11 pour plus de détails
Stéréomicroscope
Microcentrifuge
Spectrophotomètre			UVe.g. Thermo Scientific Nanodrop 2000
Chambre
d’électrophorèse d’acide nucléiqueBoîtes de Pétri 4 cm Ø ;, enrobées d’agarose à 1 % en milieu
Micropipettes et pointes (P20, P100, P1000)
Tubes de centrifugation de 1,5 ml Tubes
			centrifugation de 15 ml et 50 ml
Paire de pinces
Dumont #5ExactaCruz&commerce ; Embouts de chargement de gel ronds dans un rack stérile, 1-200&mu ; l  ;	Santa Cruz	sc-201732
100 &mu ; m filtre (BD Falcon 100 mm Cell Strainer)	BD Biosciences	352360
30 &mu ; m filtre (filtres de pré-séparation-30 µ ; m)	Miltenyi Biotec	130-041-407
Gel à verrouillage de phase, lourd, tubes de 1,5 ml  ;	Prime	2302810
Oeuf eau moyenne			60 &mu ; g/ml Sels de mer instantanés de l’océan en ddH2O, 0,00001 % (p/v) Bleu de méthylène
E3 moyen  ;			5 mM de NaCl, 0,17 mM de KCl, 0,33 mM de CaCl2, 0,33 mM de MgSO4
Tricaïne (3-amino benzoïque)	Sigma-Aldrich	A-5040	4 mg/ml Solution mère de tricaïne, pH 7
1 % d’agarose (en milieu E3)
Gel d’agarose à 1 % (en tampon TBE)
Leibovitz´ ; s L-15 moyen  ;	Gibco	21083-027
FBS (Sérum de Bovin Fœtal)	Sigma	F4135
ARNAlater	Ambion	AM7020
Trizol	Ambion	1559606
Glycogène  ;	Invitrogen	10814-010	20 & micro ; g/µ ; l dans de l’eau sans RNase
chloroforme
isopropanol
75 % éthanol (dans DEPC-ddH2O)
Eau sans nucléase ou stérilisée traitée DEPC ddH2O
			charge d’acide nucléique
Tampon TBE (Tris/Borate/EDTA) pour électrophorèse

à fluorescenceréfrigéréE3deTampon de