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Article de méthode

Fluorescence-trempe d'un proche infrarouge fluorophore encapsulée dans des liposomes comme outil de In Vivo Imagerie optique

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DOI :

10.3791/52136

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5 janvier 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental Radiology, Institute of Diagnostic and Interventional Radiology I, Jena University Hospital, 2Department of Pharmaceutical Technology, Friedrich-Schiller-University Jena, 3Center for Electron Microscopy, Jena University Hospital

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

L’utilisation des fluorophores pour l’imagerie in vivo peut être considérablement limitée par l’opsonisation, la clairance rapide, la faible sensibilité de détection et les effets cytotoxiques sur l’hôte. L’encapsulation des fluorophores dans les liposomes par hydratation et extrusion du film conduit à l’extinction et à la protection de la fluorescence, ce qui permet une imagerie in vivo avec une sensibilité de détection élevée.

Résumé

L’imagerie optique offre un large éventail de modalités de diagnostic et a suscité beaucoup d’intérêt en tant qu’outil d’imagerie biomédicale. Malgré le grand nombre de techniques d’imagerie actuellement disponibles et les progrès de l’instrumentation, il reste nécessaire de disposer de sondes très sensibles adaptées à l’imagerie in vivo. L’un des problèmes typiques des sondes fluorescentes précliniques disponibles est leur clairance rapide in vivo, ce qui réduit leur sensibilité d’imagerie. Pour contourner la clairance rapide, augmenter le nombre de molécules de colorant sur le site cible, et ainsi réduire l’autofluorescence de fond, l’encapsulation du colorant fluorescent proche infrarouge, DY-676-COOH dans les liposomes et la vérification de son potentiel pour l’imagerie in vivo de l’inflammation ont été effectuées. Le DY-676 est connu pour sa capacité à s’auto-tremper à des concentrations élevées. Nous avons d’abord déterminé la concentration appropriée pour l’auto-trempe, puis encapsulé cette concentration dans l’intérieur aqueux des liposomes pégylés. Pour étayer le potentiel d’extinction et d’activation des liposomes, nous utilisons une méthode de congélation sévère qui entraîne des dommages aux membranes liposomiques sans affecter le colorant encapsulé. Les liposomes caractérisés par un niveau élevé d’extinction de la fluorescence ont été appelés Lip-Q. Nous montrons, par des expériences avec différentes lignées cellulaires, que l’absorption de Lip-Q se fait principalement par phagocytose, ce qui a permis de caractériser son potentiel en tant qu’outil d’imagerie in vivo de l’inflammation dans des modèles murins. De plus, nous utilisons un modèle d’œdème induit par le zymoran chez la souris pour étayer le potentiel de Lip-Q dans l’imagerie optique de l’inflammation in vivo. Compte tenu de l’absorption possible due à l’effet de perméabilité et de rétention accrues (EPR) induit par l’inflammation, une formulation de liposomes toujours active avec une faible concentration non éteinte de DY-676-COOH (appelée Lip-dQ) et de DY-676-COOH libre a été comparée à Lip-Q dans des essais sur des animaux.

Introduction

Les liposomes ont été intensivement étudiée et servir comme l'un des systèmes les plus biocompatibles de délivrance de médicaments pour des applications biomédicales cliniques 1,2. Ils sont principalement constitués de phospholipides et de cholestérol, qui sont tous deux composés biocompatibles imitant des parties de membranes cellulaires naturelles. Considérant que les substances hydrophiles peuvent être piégés dans l'intérieur aqueux, agents lipophiles peuvent être incorporés dans la bicouche liposomale trois phospholipides. L'encapsulation de substances dans l'intérieur aqueux des liposomes confère une protection contre la dégradation in vivo et empêche également le système hôte contre les effets toxiques des médicaments cytotoxiques utilisés pour la thérapie de maladies, par exemple des agents chimiothérapeutiques visant à détruire les cellules tumorales. La modification de la surface liposomique avec des polymères comme le polyethylene glycol (pégylation) se étend en outre le temps de circulation sanguine des liposomes in vivo en raison de la stabilisation stérique 4. Moreover, les liposomes peuvent séquestrer des concentrations élevées de plusieurs substances telles que les protéines, 5,6 substances hydrophiles 7,8 et 9 enzymes. Ils servent donc des outils thérapeutiques et diagnostiques cliniques fiables qui méritent leur approbation pour la livraison de médicaments cytotoxiques tels que la doxorubicine pour le traitement du cancer 4. En raison de leur souplesse, les liposomes peuvent également être chargées avec des fluorochromes à usage chirurgical et de diagnostic par imagerie.

imagerie de fluorescence fournit un coût-efficace et non invasive outil de diagnostic in vivo qui, cependant, exige certaines exigences de base. Il pourrait être démontré que fluorochromes qui conviennent le mieux pour l'imagerie in vivo ont absorption caractéristique et maxima d'émission dans la gamme où la dispersion de la lumière et de diffusion ainsi que autofluorescence de tissu provenant de l'eau et de l'hémoglobine est faible. Ainsi, de telles sondes ont leurs maxima abs / em entre 650 et 10 900 nm. En outre, la stabilité de fluorochromes la fois in vitro et in vivo est critique, opsonisation et le dédouanement rapide peuvent considérablement limiter leur application pour l'imagerie in vivo 11. D'autres effets tels que la mauvaise stabilité et une faible sensibilité ou des effets cytotoxiques sur les organes cibles comme on le voit avec le vert d'indocyanine (ICG) 12-16, sont indésirables et doivent être pris en considération lors de la conception des sondes pour l'imagerie in vivo. Ces observations ont conduit au développement actif de plusieurs fluorochromes NIR précliniques, des nanoparticules ainsi que de nouvelles techniques pour l'imagerie in vivo de processus inflammatoires, le cancer et pour la chirurgie guidée par l'image 17-20. En dépit de la stabilité de la plupart (fluorescence dans le proche infrarouge) NIRF colorants préclinique in vitro, leur perfusion rapide et de la clairance par le foie et les reins empêchent leur utilisation dans l'imagerie optique in vivo de maladies et de processus inflammatoires.

MÉNAGEMENT "> Nous présentons donc un protocole d'encapsulation de fluorochromes tels que le bien caractérisé proche infrarouge colorant fluorescent DY-676-COOH, connu pour sa tendance à l'auto-trempe à des concentrations relativement élevées 21 dans des liposomes. A des concentrations élevées H- la formation de dimères et / ou pi-empilement interactions entre les molécules de fluorophore situées dans la suite de rayon de Förster les uns des autres dans Förster transfert d'énergie par résonance (FRET) entre les molécules de fluorochrome. A faible concentration de l'espace entre les molécules de fluorophore augmente, empêchant de ce fait l'interaction de pi-empilement et H-formation de dimères et aboutissant à forte émission de fluorescence. Le commutateur entre la concentration haute et basse et la fluorescence trempe accompagnement et l'activation est une stratégie prometteuse qui peut être exploitée pour l'imagerie optique 22. À cet égard, l'encapsulation de fortes concentrations du colorant NIRF DY-676-COOH dans l'intérieur aqueux de liposomes est plus favorable pour l'imagerie in vivo que le colorant libre. Le défi de la méthode réside d'abord dans la bonne encapsulation et d'autre part, à la validation des avantages résultant de l'encapsulation de fortes concentrations du colorant. En comparant les propriétés de formation d'image pour traitement de liposomes avec celle du colorant libre et également avec une formulation non trempé liposome avec de faibles concentrations de colorant est indispensable. Nous montrons par un protocole simple, mais très efficace hydratation du film et extrusion combinée avec le gel et de dégel des cycles alternés que l'encapsulation des concentrations de trempe de DY-676-COOH dans des liposomes est possible. D'autres procédés utilisés pour préparer des liposomes, tels que le procédé d'evaporation en phase inverse 23 ainsi que la méthode d'injection d'éthanol 24 permettent la préparation de liposomes avec des rendements élevés d'encapsulation de nombreuses substances hydrophiles. Cependant, la nature de la substance à encapsuler peut influer sur l'efficacité d'encapsulation. En effet,l'hydratation du film et de l'extrusion protocole présenté ici a révélé la plus grande efficacité pour l'encapsulation de DY-676-COOH. Pour illustrer les avantages de l'encapsulation liposomale de DY-676-COOH, un modèle de l'oedème induit par le zymosan, ce qui permet l'étude des processus inflammatoires dans les quelques heures, a été utilisé. Ici, il est démontré que les liposomes avec des concentrations élevées de la DY-676-COOH encapsulés sont plus appropriés pour le corps entier en imagerie optique in vivo de processus inflammatoires que le colorant libre ou la formulation liposomale non trempé avec de faibles concentrations de colorant. Ainsi, le protocole sous-jacent fournit un procédé simple et rapide pour produire des liposomes fluorescents pour traitement et la validation de l'activation et leur potentiel imagerie à la fois in vitro et in vivo.

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Protocole

NOTE: Toutes les procédures sont approuvées par le comité régional et des animaux conformément aux lignes directrices internationales sur l'utilisation éthique des animaux.

1. Préparation des matériaux et instruments

  1. Préparation d'une dispersion de vésicules formées spontanément (SFV)
    1. Dissoudre et préparer des solutions d'achat d'actions des phospholipides suivants: 214 mg / ml phosphatidylcholine d'oeuf (EPC), 134 mg / ml de cholestérol, 122 mg / ml de 1,2-distearoyl- sn-glycéro-3-phosphoethanolamine- N - [méthoxy (polyéthylène glycol) -2000] (sel d'ammonium) (mPEG 2000 -DSPE) et 2 mg / ml de 1,2-dioleoyl- sn-glycéro-3-phosphoethanolamine- N - (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4 yl) (sel d'ammonium) (NBD-DOPE) dans le chloroforme et stocker dans des flacons de verre.
    2. Fournir environ 3 ml de chloroforme dans un ballon à fond rond et de transférer le volume approprié de la solution mère de phospholipides dans le ballon à fond rond pour préparer des liposomes composés de EPC: Chol: mPEG 2000 -DSPE à un rapport molaire de 6,5: 3: 0,5. Pour le double marquage de fluorescence des liposomes ajouter 0,3% en moles NBD-DOPE à la solution de lipide.
    3. On évapore le chloroforme de la solution de phospholipide organique sous pression réduite (300 mbar) à 55 ° C en utilisant un évaporateur rotatif.
    4. Après un film de phospholipides homogène est formé, de réduire la pression à 10 mbar pendant 1-2 heures pour enlever le dépôt de chloroforme résiduel.
    5. Bien que le chloroforme se évapore, on dissout DY-676-COOH (6,181 uM) dans du tampon Tris 10 mM pH 7,4 et remplir un vase de Dewar d'azote liquide. Allumez un bain à ultrasons et réglé à 50 ° C.
    6. Transférer un volume approprié (0,5 à 1 ml) de DY-676-COOH (6,181 uM) solution dans le ballon à fond rond pour hydrater le film de phospholipide sec et vortexer vigoureusement jusqu'à une vésicule formée spontanément (SFV) forme de dispersion. Assurez-vous que tous les phospholipides sont dispersés pour éviter la perte de lipides.
    7. Tra soigneusementnsfer le ballon à fond rond contenant la dispersion SFV dans l'azote liquide et congeler la dispersion de 3-5 min. Placez le ballon dans un bain à ultrasons à 50 ° C pour dégeler la dispersion puis la dispersion vortex vigoureusement pendant 1-2 min. Répétez cette procédure six fois, soit un total de sept cycles gel et de dégel.
  2. Extrusion du sFv de former des vésicules de liposomes homogènes
    1. Transférer la dispersion SFV dans une seringue de 1 ml (seringue-a) et extruder la dispersion à travers une membrane de polycarbonate de 100 nm en utilisant une extrudeuse à LiposoFast-base-b dans la seringue.
    2. Extruder la dispersion de la seringue-b, de retour dans la seringue-a, puis répéter le cycle dix fois. Du fait de l'extrusion, la solution dans la seringue passe d'un aspect trouble à une dispersion limpide avec le temps. Après dix cycles (vingt étapes simples d'extrusion) retirer la seringue-b de l'appareil et extruder la dispersion pour la dernière fois de la seringue-un directement dans un stérile1,5 ml du tube de réaction.
  3. Purification des liposomes encapsulés DY-676-COOH à partir de colorant libre
    1. Préparer une colonne de Chromatographie sur gel G25 en utilisant des perles trempées dans du Tris 10 mM de tampon pH 7,4 (colonne de longueur 28 cm, diamètre 0,8 cm).
    2. Transférer 0,5 ml de dispersion de vésicules extrudé sur le lit de gel et de laisser l'évacuation de l'échantillon dans la matrice de gel.
    3. Éluer les liposomes avec Tris 10 mM pH 7,4 (figure 1A) et laver la colonne jusqu'à ce que les drains de colorant libre complètement hors de la colonne. Si besoin est, collecter et recycler le colorant libre par dessalage et de déshydratation selon les instructions du fabricant.
    4. Concentrer les liposomes éluées par ultracentrifugation (200 000 x g, 2 heures à 8 ° C) puis de les disperser dans un volume adéquat de tampon stérile 10 mM de Tris pH 7,4.
  4. Quantification de la concentration encapsulé DY-676-COOH
    1. Préparer une courbe d'étalonnage en dissolvant DY-676-COOH (0, 82, 124,247, 494, 988 nM) dans du tampon Tris 10 mM, pH 7,4 contenant 0,1% de Triton X100.
    2. Dissoudre 2 pi (100 nmol de lipide finale de 50 mmol / L stock) des liposomes pendant 5 min à température ambiante dans du tampon Tris 100 pi contenant 1% de Triton X100 pour détruire les vésicules et la libération du colorant encapsulé. Puis diluer les échantillons avec du tampon Tris 10 mM, pH 7,4 jusqu'à une concentration finale de Triton-X100 à 0,1% (v / v) faire un volume total de 1 ml. Préparer tous les échantillons en double.
    3. Mesurer l'absorption et l'émission de tous les échantillons (libre DY-676-COOH et le Triton-X100 traitée liposomes) à une excitation λ = 645 nm et une émission λ = 700 nm. Établir et utiliser une courbe d'étalonnage du colorant libre de déterminer la concentration de colorant encapsulé.
  5. Liposome caractérisation
    1. Déterminer la taille et le potentiel zêta de liposomes par diffusion dynamique de la lumière. Diluer les échantillons de liposomes avec filtre stérilisé (0,2 um) Tris 10 mM pH 7,4 à aconcentration de 100 à 300 pM (lipide). Transférer les échantillons dilués dans une cuvette jetable de faible volume et de mesurer l'échantillon selon les instructions du fabricant.
    2. Caractériser les liposomes par microscopie électronique à étayer la taille, l'intégrité et l'homogénéité des vésicules liposomiques selon des protocoles standards.

2. Validation de la fluorescence-trempe et activation des liposomes préparés

  1. L'analyse physico-chimique de la fluorescence et l'activation
    1. Préparer deux tubes de 1,5 ml pour le Lip-Q et deux tubes pour la libre DY-676-COOH. Transfert 100 nmol lipides totaux (2,38 de pi d'un / L Lip-Q solution stock de 42 mmol, contenant 138 pg / ml de la encapsulé DY-676-COOH) dans les tubes correspondants. Transfert Gratuit équivalent DY-676-COOH à la teneur en colorant de Lip-Q (0,38 pg qui résulte par exemple de 138 ug / 1000 pi x 2,38 pi Lip-Q utilisé). Incuber une baignoiree de chaque sonde à 4 ° C et congeler le second tube à -80 ° C pendant une nuit (16 h).
    2. Chauffer un bloc chauffant à 30 ° C. Remplir une boîte de refroidissement avec de la glace pilée et équilibrer une aliquote de tampon Tris 10 mM pH 7,4 à température ambiante.
    3. Retirer sondes de 4 ° C et équilibrer à température ambiante (enveloppé dans une feuille d'aluminium pour le protéger de la lumière) et rapidement dégeler sondes de -80 ° C à 30 ° C pendant 5 min. Refroidir les sondes décongelés sur de la glace pendant 1 min avant de les transférer à la température ambiante (également enveloppé dans une feuille d'aluminium pour le protéger de la lumière).
    4. Ajouter tampon Tris 10 mM (pH 7,4) à chacune des sondes à 100 ul volume final et équilibrer toutes les sondes à la température ambiante pendant 10 min.
    5. Pipette 80 ul de chaque sonde dans une cuvette de verre à faible volume et mesurer l'absorption de chaque sonde de 400 à 900 nm sur un spectromètre. Retour à la sonde de leurs tubes correspondants.
    6. Transférer 80 pi de chaque sonde dans une cuvette en verre appropriéet mesurer l'émission de fluorescence sur un spectrofluorimètre en excitant les sondes à 674 nm et en mesurant la fluorescence de 694 à 800 nm.
  2. L'absorption cellulaire et l'activation de fluorescence
    1. Obtenez et la culture les lignées cellulaires suivantes dans leurs milieux de culture correspondante en fonction des conditions standard (37 ° C, 5% de CO 2 et 95% atmosphère humidifiée). Ici, en utilisant ce J774A.1 de la lignée cellulaire de macrophage murin (modifié par Dulbecco du milieu de Eagle additionné de 10% (en volume) de sérum / fœtal de veau), la lignée cellulaire de glioblastome humain U-118 mg (MEM contenant des vitamines essentielles et 10% (v / v) de sérum de veau foetal) et la lignée de cellules de fibrosarcome humain HT-1080 (RPMI avec 5% de FCS).
    2. Manteau de 8 puits diapositives de chambre avec poly-L-lysine (ajouter 100 ul 0,001% de poly-L-lysine dans chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 10 min. Solution Aspirer et laisser les diapositives de la chambre à sécher pendant au moins quatre heure à température ambiante sur un établi stérile. Rincer les lames de la chambre 3fois avec la solution saline tamponnée 200 pi de Hank puis les sceller avec de la paraffine et de feuille d'aluminium et conserver à 4 ° C jusqu'à l'emploi.
    3. Alors que les diapositives de la chambre se tarissent, filtre stériliser les liposomes et solution de colorant et conserver à 4 ° C jusqu'à l'emploi.
    4. Pour l'analyse d'absorption de sonde avec l'ensemble du corps in vivo NIR Système d'imagerie par fluorescence, 5 préparer de petits flacons de culture de chacun des trois lignées de cellules de test (15 flacons au total). Graine 2 x 10 6 J774A.1, U-118 mg et des cellules HT-1080 par flacon de culture avec 5 ml de milieu de culture respectif (dans quintuples) et poussent de 16 à 24 heures. Parallèlement aux flacons de culture, ensemencer 30 000 cellules de chaque lignée cellulaire (J774A.1 et HT-1080) ou 20 000 cellules (U-118 mg) à 2 puits de la glissière de la chambre respectivement, et croître dans un milieu de culture de 500 ul pendant 16 à 24 h .
    5. Le lendemain, ajouter 100 nmol (montant de finale en lipides) de Lip-Q pour deux flacons par lignée cellulaire et à un puits de chaque ligne de cellules sur la lame de la chambre.Immédiatement transférer 1 flacon par ligne cellulaire à 4 ° C et le second flacon revenir à l'incubateur.
      REMARQUE: Le volume des sondes ajouté dans les flacons et les diapositives de la chambre sont les mêmes, ce qui rend la concentration sur des lames de la chambre 10 fois plus élevé (5 ml est de 500 pi de milieu de culture). Cela est nécessaire parce que la détection microscopique est moins sensible que le système d'imagerie par fluorescence NIR où culots cellulaires dans les fioles sont imagés.
    6. Ajouter la libre DY-676-COOH à une concentration équivalente à la teneur en colorant de Lip-Q pour les cellules dans deux flacons par lignée cellulaire et à un puits de chaque ligne de cellules sur la lame de la chambre, puis transférer immédiatement 1 flacon par ligne cellulaire à 4 ° C (d'épuisement de l'énergie) et l'autre ballon avec le coulisseau de la chambre arrière à l'incubateur. Incuber les cellules pendant 24 heures dans les conditions correspondantes. Les cellules dans le ballon sans sonde de servir de témoin non traité.
  3. NIRF l'imagerie et l'analyse semi-quantitative
    1. Après 24 heures la durée d'incubation, récolter les cellules dans des flacons en lavant les cellules deux fois avec une solution tamponnée de Hanks de sel (HBSS), puis racler les cellules dans 500 ul de HBSS et culot par centrifugation (5 min à 200 x g) dans 500 ul de tubes.
    2. Placer les tubes avec les culots cellulaires (HBSS) et dans un imageur NIRF et image en utilisant des filtres pour excitation (615-665 nm) et d'émission (coupe à> 700 nm).
    3. Déduire autofluorescence et d'évaluer l'intensité de la cible par rapport autofluorescence selon les instructions du fabricant. Cela vous donnera les niveaux semi-quantitatives de l'intensité de fluorescence en signal moyen (compte échelle / sec), qui représente les niveaux de comptage après calibrage pour le temps de l'exposition, gain de la caméra, binning et la profondeur de bits, de sorte que les mesures sont comparables entre eux.
  4. Analyse microscopique confocale
    1. Après 24 heures d'incubation, récolter les cellules sur des lames de chambre en lavant deux fois avec 500 ul HBSS.
    2. Fixer la CElls avec 200 ul de HBSS contenant 3,7% (v / v) de formaldehyde pendant 30 min à température ambiante.
    3. Alors que la fixation se passe, diluer la tache d'ADN, Hoechst-33258 1:50 avec une solution de montage.
    4. Après fixation, laver les cellules deux fois avec du HBSS puis séparer les chambres des lames de verre. Ajouter la solution de montage de 50 ul contenant l'ADN-tache sur chaque spot correspondant aux puits des diapositives de la chambre. Couvrir les cellules avec des lamelles de verre, sceller les bords avec vernis à ongles transparent et sécher à l'air pendant 10 min à température ambiante (foncé).
    5. cellules image sur un microscope à fluorescence approprié ou microscope confocal. Utilisez les excitation et d'émission paramètres suivants pour la visualisation des composants correspondants: noyaux (Hoechst-33258: excitation 405 nm, émission 420 à 480 nm). NBD-DOPE (lipide liposomique: excitation 488 nm, émission 530 nm). DY-676-COOH (NIR de colorant fluorescent: excitation 633-645 nm, émission 650 à 700 nm).
      NOTE: Assurez-vous que le microscope à fluorescence d'unevailable est équipé de filtres appropriés qui permettent excitation et d'émission de longueurs d'onde supérieure à 630 nm.

Base-liposome 3. In Vivo imagerie par fluorescence de l'inflammation

  1. Préparation des animaux et des matériaux
    1. Maison 8-12 semaines, âgé de souris NMRI mâles pesant environ 36 g dans des conditions standard avec de la nourriture et de l'eau ad libitum.
    2. Sept jours avant le début des expériences, donner toutes les souris d'un régime alimentaire faible en phéophorbide afin de réduire l'autofluorescence des tissus.
    3. Vingt-quatre heures avant le début de chaque expérience, de se raser la souris à la zone souhaitée (par exemple, toute la zone arrière si l'imagerie de la jambe arrière de l'œdème est souhaitée).
    4. Peser les animaux et de calculer la quantité de sonde doit être injecté par souris (Lip-Q et Lip-dQ à 10 pmol (concentration de lipides) par kg de poids et sans DY-676-COOH (équivalent à teindre contenu de Lip-Q utilisé) .
    5. Image les animauxun corps de fluorescence NIR imageur avec les mêmes paramètres utilisés pour les culots cellulaires. Cette mesure fournit autofluorescence des animaux.
    6. Dissoudre 10 mg de zymosan A dans 1 ml de solution saline isotonique et de stocker toute une nuit à 4 ° C.
  2. L'induction de l'inflammation in vivo et l'imagerie NIRF
    1. Préparez 3 seringues par souris contenant les solutions suivantes. Remplir une seringue avec 50 ul de solution zymosan A (10 mg / ml) et de la seconde seringue avec 50 ul de solution saline isotonique. Remplissez la troisième seringue avec les sondes, lequel Lip-Q et Lip-DQ (10 pmol / kg de poids (lipides)) sont désignés pour les animaux d'essai et d'une connexion DY-676-COOH (concentration que dans Lip-Q) pour les animaux de contrôle. Assurez-vous que les sondes sont dilués avec HBSS stérile à 150 volume final ul.
    2. Appliquer la crème des yeux sur les yeux des animaux pour éviter la sécheresse et anesthésier les animaux avec 2% d'isoflurane jusqu'à ce qu'ils sont profondément endormis et ne réagit pas au toucher sur les pattes (cela prend environ 2 minutes).
    3. Placez la souris sur une natte chaude (toujours sous anesthésie) et injecter le zymosan A voie sous-cutanée de la solution sur la patte arrière droite et la solution saline sur la patte arrière gauche. Injectez immédiatement la sonde par voie intraveineuse et de l'image de l'animal par la suite, puis un temps record d'injection / mesure (que t = 0 h). Enregistrez les images résultantes que l'image cubes et répéter les étapes ci-dessus pour tous les autres animaux et les sondes respectives.
    4. Image les animaux tous les 2 h pour le post-injection de 10 h et post-injection puis à 24 h, en se assurant que le stade de la chambre de mesure est chaude (par exemple, en plaçant sous un tapis chaud), afin d'éviter l'hypothermie. Après chaque mesure, placer les animaux dans une cage avec de la nourriture et de l'eau ad libitum et placer la cage dans une chambre animale tempéré. Euthanasier les animaux par les premier anesthésiant avec 2% d'isoflurane jusqu'à ce que les animaux ne réagissent plus à toucher, puis euthanasier avec du dioxyde de carbone pour 5 à 10 min, ce qui rendassurer que les animaux cessent de respirer complètement et la rigidité cadavérique.
    5. Disséquer les souris selon des protocoles standards qui peuvent être évalués en ligne (http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/) et l'image des organes.
    6. Évaluer les résultats de mesure selon les instructions du fabricant d'abord déduisant la fluorescence globale des animaux (démixage) puis des régions attribution d'intérêt pour autofluorescence (de gauche patte arrière avec une solution saline) et la cible fluorescence de zone enflammée (de patte arrière droite avec zymosan-A).

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Résultats

L'encapsulation des concentrations élevées de colorants fluorescents tels que le colorant NIRF DY676-COOH utilisé ici dans l'intérieur aqueux des liposomes entraîne un niveau élevé de l'extinction de fluorescence. Extinction de la fluorescence, un phénomène observé avec de nombreux fluorophores à forte concentration, peut être exploitée dans plusieurs applications d'imagerie in vivo où une grande sensibilité et une détection fiable de la région cible sont demandés. L'utilisation de liposomes assure éga...

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Discussion

Étant donné que les liposomes peuvent également servir de systèmes de délivrance pour des colorants fluorescents, ils permettent l'imagerie des maladies cibles. L'encapsulation des concentrations élevées de colorants fluorescents tels que le colorant NIRF, DY676-COOH utilisé ici, conduit à un niveau élevé de l'extinction de fluorescence du colorant piégé. Extinction de la fluorescence, un phénomène observé avec de nombreux fluorophores à forte concentration peut être exploitée dans plusieurs applications...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par les subventions Deutsche Forschungsgemeinschaft HI-698 / 10-1 et RU-1652 / 1-1. Nous remercions Doreen mai pour une excellente assistance technique et la société Dyomics GmbH, Jena pour leur soutien en nature.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Matériaux et équipements pour la préparation des liposomes
egg phospahtidylcholineAvanti Polar Lipids840051PDissoudre dans du chloroforme et stocker dans des flacons en verre (214 mg/ml)
cholestérolSigmaC8667Dissoudre dans du chloroforme et stocker dans des flacons en verre (134 mg/ml)
1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-2000] (sel d’ammonium)AvantiPolar Lipids880120PDissoudre dans du chloroforme et stocker dans des flacons en verre (122 mg/ml)
1,2-dioleoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-(7-nitro-2-1, 3-benzoxadiazol-4-yl) (sel d’ammonium)Avanti Polar Lipids810145PDissoudre dans le chloroforme et stocker dans des flacons en verre (2 mg/ml)
Sartorius MC1 (d = 0,01 mg)Sartorius AGResearch RC 210 Putilisé pour peser les phospholipides
RotavaporBü ; chi Labortechnik AGR-114utilisé pour l’hydratation du film phospholipidique
Baind’eau Bü ; chi Labortechnik AGR-481utilisé pour l’hydratation du film phospholipidique
Contrôleur de videBü ; chi Labortechnik AGB-720utilisé pour l’hydratation du film phospholipidique
VacoboxBü ; chi Labortechnik AGB-177utilisé pour l’hydratation du film phospholipidique
Refroidisseur à circulationLAUDA DR. R. WOBSER
GMBH & CO. KG		WKL 230utilisé pour l’hydratation du film phospholipidique
DY-676-COOHDyomics GmbH676-00Dissoudre dans 10 mM Tris et stocker le stock à -20° ; C
Tris-(Hydroxyméthyl)-aminomethanApplichemA1086tampon 10 mM, pH 7,4
TrichlorméthaneCarl Roth GmbH + Co. KGY015.2utilisé pour la préparation des liposomes
SonicatorMerck Eurolab GmbHUSR 170 Hutilisé pour la préparation des liposomes
Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, n° 146-3011-00)Scientific Industries Inc.SI-0256utilisé pour la préparation des liposomes
Sephadex G25 medium  ;GE Healthcare Europe GmbH17-0033-01utilisé pour la purification des liposomes
Triton X100Ferak Berlin GmbH505002utilisé pour la destruction des liposomes pour la quantification des colorants
LiposoFast-BasicAvestin Inc.utilisé pour l’extrusion de liposomes
Membrane filtrante en polycarbonate, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U)VWRutilisé pour l’extrusion de liposomes via LiposoFast-Basic
Fluostar OptimaBMG Labtechutilisé pour la quantification des colorants
Zetasizer Nano ZSMalvernutilisé pour la détermination de la taille des liposomes et du zêtapotentiel
Ultracentrifugeuse  ;Beckmann Coulter GmbHXL 80utilisé pour la concentration des échantillons
RotorBeckmann Coulter GmbHSW 55 TIutilisé pour la concentration des échantillons
Matériaux et équipements pour l’évaluation des liposomes et de l’imagerie optique
Zymosan-A de Saccharomyces cereviciaeSigmaZ4250-250MGutilisé pour l’induction de l’inflammation
Solution saline isotonique (0,9 %)Fresenius GmbHPZN-2159621utilisé pour la dilution de Zymosan-A
Vaporisateur IsofluraneOhmeda Isotec 4utilisé pour l’anesthésie des animaux
IsofluraneActavis GmbH  ;PZN-7253744anesthésie
Thermo Mat Pro 20 WLucky Reptile61202-HTP-20utilisé pour garder les animaux au chaud pendant l’anesthésie
Omnican-F (1 ml d’injection)  ;BraunPZN-3115465utilisé pour l’application sous-cutanée et intraveineuse de sondes
Crème pour les yeux au panthénolJenapharmPZN-3524531utilisée pour prévenir la sécheresse oculaire des animaux pendant l’anesthésie Solution
saline tamponnée de HanksPAA Laboratories /Biochrom AGL2045sans Mg2+, Ca2+ et rouge de phénol. Pour la dilution des sondes et pour le lavage des cellules Les lames de
chambre à 8 puitsBD Biosciences354108utilisées pour la culture cellulaire suivie de la microscopie.
Fioles de culture cellulaireGreiner BioOne
Milieux de culture cellulaireGibco (life technologies GmbH)
Sérum de veau fœtal  ;Invitrogen
(0,01 %, 50 % ml)SigmaP4832utilisé pour revêtir les lames de chambre de culture cellulaire
Mountant PermafluorThermoScientific  ;S21022-3Solution de montage pour la microscopie
Hoechst-33258AppliChemColoration d’ADN pour la microscopie
Hera-Safe HeraeusInstrumentsBanc de travail stérile utilisé pour la culture cellulaire
HERA cellHeraeus InstrumentsIncubateur utilisé pour la culture cellulaire
LSM510-MetaZeissmicroscopie
confocaleSystème d’imagerie par fluorescence in vivo Maestro-TMCRi, Woburnutilisé pour l’imagerie par fluorescence du corps entier de petits animaux
Spectrophotomètre (Ultrospec 4300 pro UV)GE Healthcareutilisé pour la mesure de l’absorption
Spectrofluorimètre (Jasco FP-6200)Jascoutilisé pour la mesure de l’émission
Animaux
Souris NMRI (8-12 semaines, mâle)Elevage Janvier, Franceutilisé pour des essais sur l’inflammation
Solution de poly-L-lysine utilisé pour la de fluorescence

Références

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