Article de méthode

Utilisation plusTipTracker Software mesurer microtubules Dynamics Xenopus laevis Cônes de croissance

DOI :

10.3791/52138

⸱

7 septembre 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Boston College

Dans cet article

Résumé

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L', logiciel basé sur MATLAB open source, plusTipTracker, peut être utilisé pour analyser une série d'images de fluorescence marqué + conseils pour quantifier la dynamique des microtubules.

Résumé

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Microtubules (MT) plus-fin-suivi protéines (+ TIP) se localisent à la plus-extrémités croissantes de MT et régulent la dynamique MT 1,2. Un des conseils les plus connus et largement utilisés-+ pour analyser la dynamique de MT est la Fin-binding protein, EB1, qui lie tous les MT ainsi que les fins de croissance, et donc, c'est un marqueur de MT polymérisation 1. De nombreuses études sur le comportement des EB1 dans les cônes de croissance ont utilisé beaucoup de temps et, les méthodes de suivi de la main assistée par ordinateur biaisées pour analyser individu MT 1-3. Notre approche consiste à quantifier les paramètres globaux de la dynamique MT en utilisant le logiciel, plusTipTracker 4, suite à l'acquisition de haute résolution, les images en direct de EB1 marqué dans les cônes de croissance embryonnaires cultivées 5. Ce logiciel est un open-source package convivial basé sur MATLAB, qui allie la détection automatique, le suivi, la visualisation et l'analyse des films de + TIP marquées par fluorescence. Ici, nous présentons le protocole d'utilisation plusTipTRâtelier pour l'analyse des comètes marquées par fluorescence TIP + en culture de Xenopus cônes de croissance laevis. Toutefois, ce logiciel peut également être utilisée pour caractériser la dynamique de MT dans divers types de cellules 8.6.

Introduction

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Le but de cette méthode est d'obtenir des informations quantitatives sur les microtubules (MT) plus fin de suivi dynamique dans la vie des cônes de croissance protéines (+ TIP). MT + TIP sont un groupe de protéines qui localisent les plus-extrémités de MT 9,10. Ils effectuent une vaste gamme de fonctions pour régler les paramètres de MT instabilité dynamique 11, y compris les taux de polymérisation, catastrophe, et de sauvetage. Une méthode très utilisée pour l'analyse de la dynamique de la MT est de suivre le comportement du TIP EB1 +, qui se lie spécifiquement à la croissance de MT plus-ends 1,12. EB1 est connu pour recruter plusieurs autres protéines à la croissance de MT plus-ends 13,14, et a récemment été mis en place comme un facteur de maturation MT 15, la promotion de la croissance MT et la fréquence des catastrophes 15,16.

De nombreuses études de la dynamique MT dans les cônes de croissance ont utilisé des méthodes de suivi de la main pour mesurer les changements dans la dynamique EB1-GFP au fil du temps 1-3, comme EB1 localizatià MT ainsi que les fins peuvent être utilisés en tant que marqueur pour la polymérisation MT. Un avantage clé de l'examen de comètes EB1-GFP comme une approximation de la croissance MT est que la dynamique MT peuvent être mesurés même dans les régions de chevauchement significatif de MT. Bien que la méthode des comètes EB1-GFP suivi à la main a fourni des indications utiles sur les comportements MT 1-3, il est temps et peut être biaisée. En outre, la croissance aberrante comportements coniques sont probablement le résultat de changements minute à la dynamique du cytosquelette, en analysant seulement un petit sous-ensemble de MT (généralement nécessaire lorsque la main-tracking) peut manquer des informations importantes.

Ainsi, nous mesurons la dynamique de MT mondiaux paramètres à l'aide du logiciel, plusTipTracker 4, après l'acquisition de haute résolution, les images en direct de EB1 marqué dans les cônes de croissance embryonnaires cultivées 5. Ce logiciel, développé dans le Danuser Lab, a été utilisé dans plusieurs études qui caractérisent la dynamique MT dans divers types de cellules 6-8. Il s'agit d'un open-source, nouser-amical, emballage à base de MATLAB qui inclut la détection automatique, le suivi, la visualisation et l'analyse des films de + TIP marquées par fluorescence. Une longue liste de paramètres spécifiques de la dynamique MT sont calculées par ce logiciel (voir référence 4 pour plus de détails), mais pour l'analyse de la dynamique MT dans les cônes de croissance, les paramètres les plus utiles sont MT vitesse de voie de la croissance (en microns / minute), chemin de la croissance durée de vie (en secondes), et la longueur de la piste de croissance (en microns). Le logiciel peut être téléchargé directement depuis le site Danuser Lab (sous «Logiciel»). Alors que le Danuser Lab prend actuellement en charge une interface nouvelle pour + analyse de suivi de TIP, qui est intégré dans un logiciel appelé u-piste 2.0, le logiciel d'origine, autonome restera disponible. Les algorithmes sous-jacents entre les deux programmes sont les mêmes (au moins à partir de 2014), avec seulement une différence de l'interface et d'analyse des sorties. Pour l'utilisateur novice avec peu de MATLAB et / ou l'analyse computationnelle expérence, plusTipTracker a plus de fonctionnalités conviviales, y compris les sorties de paramètres statistiques automatisés.

Ici, nous décrivons les étapes d'analyse d'images de la dynamique EB1-GFP en culture de Xenopus cônes de croissance laevis. Ce protocole a été utilisé dans une étude récente examinant la dynamique MT 17. Voir aussi Lowery et al. 2012 5 pour obtenir des instructions détaillées sur les cônes de croissance de la culture exprimant EB1-GFP. Bien que ce papier essentiellement porté sur l'examen dynamique EB1-GFP dans les cônes de croissance, le même protocole peut être utilisé pour d'autres types de cellules 17. Pour tous les types de cellules, l'intervalle de temps entre les images doit être comprise entre 0,5-2 sec pour optimiser le suivi + TIP. Un intervalle d'au plus 4 secondes de temps entre les images est possible, mais cette augmentation des résultats en temps d'intervalle dans les erreurs de suivi supplémentaires.

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Protocole

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Ce protocole et vidéo sont destinés à servir de compagnon à l'article original décrivant le logiciel plus en détail 4, ainsi que le rapport technique qui vient avec le téléchargement de logiciels sur le site Web Danuser Lab. Les lecteurs sont encouragés à examiner attentivement ces documents s'il ya des questions supplémentaires concernant l'utilisation du logiciel.

1 Avant l'analyse d'image

  1. Convertir chaque film en time-lapse en une séquence de TIFF (Tagged Image File Format) Les fichiers d'image. S'il ya plusieurs cônes de croissance / cellules dans un film donné, première récolte chaque cône de croissance / cellule pour créer sa propre séquence d'image.
    Remarque: Ce n'est pas nécessaire, à titre individuel régions-de-intérêt (ROI) peuvent être sélectionnés dans plusTipTracker. Cependant, l'utilisation de plus petites dimensions de l'image augmente la vitesse du traitement de calcul, de sorte que cette étape est recommandée si l'espace blanc significatif dans l'image.
  2. Enregistrez chaque série TIFF dans son propredossier "images" dans un chemin que MATLAB est réglé sur l'accès (à noter que "images" est sensible à la casse). Pour ajouter un nouveau chemin, accédez au répertoire du fichier concerné dans la fenêtre "Current Folder", faites un clic droit sur l'icône du répertoire, et sélectionnez "Ajouter à Chemin - Dossiers sélectionnés et sous-dossiers". Il est important que le dossier du logiciel plusTipTracker être ajoutée à la voie, ainsi.

2. plusTipGetTracks

Note: La première étape de l'analyse d'image est de détecter les comètes EB1-GFP, le lien entre les comètes en pistes, et de déterminer les paramètres de la dynamique des microtubules. Ceci est obtenu avec la commande "plusTipGetTracks" 4.

  1. Pour commencer l'analyse, l'application de MATLAB ouvert et tapez "plusTipGetTracks" dans la fenêtre de commande. Cela entraînera une nouvelle boîte de dialogue apparaît.
  2. Cliquez sur "créer de nouveaux projets" et choisir un (ou more) de l'image TIFF série précédente en sélectionnant les "images" appropriées dossier (ou répertoires contenant des "images" dossiers). À l'issue de cette étape, un répertoire de fichiers (roi_1) sera créé (dans le même dossier qui contient des "images") qui contiendra les futurs fichiers de données. Remarque: l'étape "Installer de nouveaux projets» peut être complété à l'avance, au cours d'une session distincte.
  3. Une nouvelle fenêtre apparaît: "Sélectionner un polygone, faites un clic droit sur ce dernier point, et cliquez sur« Créer un masque ". Cliquez sur "OK". La première image de la série d'images sélectionnée sera alors affiché. Utilisez la souris pour cliquer et de créer un polygone qui englobe l'ensemble du cône de croissance. Double-cliquez sur la souris pour fermer le polygone.
  4. Une fois le polygone a été fermé, une boîte de dialogue apparaît: «Voulez-vous sélectionner un autre retour sur investissement?" Si l'image a un autre cône de croissance à analyser, sélectionnez «Oui»; s autrementélu «Non».
  5. Sélectionnez les projets qui seront immédiatement analysés. Cliquez sur "Sélectionner projets" et sélectionnez le dossier (roi_X) à analyser.
  6. Un écran de listSelectGUI apparaît. Sélectionnez le projet (s) sur le côté gauche de l'écran et de les déplacer sur le côté droit de l'écran. Cliquez sur "OK". Choisissez un emplacement pour enregistrer la liste de projets et cliquez sur "Enregistrer".
  7. Sélectionnez "détection", "Suivi", et "post-traitement". Une fois ces sélections ont été effectuées, le côté droit de la boîte de dialogue sera configurable. Configurez chaque option.
    1. Ces paramètres sont utilisés pour relier les comètes détectées en pistes de MT. Détails pour le choix de ces paramètres de contrôle pour le suivi sont inclus sur les pages 9-10 du rapport technique PDF qui accompagne le téléchargement du logiciel; lire attentivement ce rapport en cas de problèmes. Aux fins de suivi des comètes EB1-GFP dans Xenopnous laevis cônes de croissance, utilisez les paramètres de suivi suivantes: un rayon de recherche Range (pixels) 5-12, la longueur minimale Sous-Track (frames) 3; Max Gap Longueur (cadres) 8; Max Factor retrait de 0,8, angle maximum avant 50, angle arrière Max 10, Fluctuation Rayon 2,5. Ces paramètres sont représentés sur la figure 1.

    Remarque: Facteur de retrait maximum est fixé à réduire le nombre de «lacunes détectées en retard», comme des «lacunes en arrière" ne sont pas utiles à analyser dans le cadre de cônes de croissance, compte tenu des conditions de surpeuplement et des erreurs probables dans les liens de la piste. En outre, les deux angle Max Forward, ainsi que la fluctuation rayon sont définis relativement élevé, comme MT cône de croissance présentent de petites translocations fréquentes dans plus de croissances et des retraits, et l'augmentation de ces paramètres de contrôle permet à ce mouvement augmenté au cours de l'étape de liaison.
    1. Remplissez les paramètres de post-traitement en fonction des paramètres d'acquisition d'image spécifiques souhaitées.
  8. Une fois que les paramètres ont été configurés, cliquez sur "Démarrer". Le logiciel fonctionne selon les paramètres ont été sélectionnés. Cela peut prendre quelques minutes à quelques heures, en fonction du nombre de projets sélectionnés et de leurs tailles. La fenêtre de commande affiche le temps restant estimé pour chaque fonction. Lorsque l'étape de plusTipGetTracks est terminée, la fenêtre de commande affiche "Terminé!"
    Remarque: Une longue liste de paramètres spécifiques de la dynamique MT ont été calculés par ce logiciel (voir référence 4 pour plus de détails), mais pour l'analyse de la dynamique MT dans les cônes de croissance, les paramètres les plus utiles à examiner sont MT vitesse de voie de la croissance (en microns / minute), la voie de la croissance de vie (en secondes), et la longueur de la piste de croissance (en microns).

3. plusTipSeeTracks

Note: Maintenant que les pistes de microtubules ont été définis, la fonction "plustipSeeTracks» est utilisé pour la piste visualisation 4. Cette fonctionpeuvent fournir des multiples sorties pour la visualisation, y compris la dynamique de MT spatiales des cartes et des films de vitesse, mais ici, l'accent est mis uniquement sur l'utilisation «Track Films" pour afficher les pistes MT superposées sur les images de cône de croissance. Alors que plusTipGetTracks peuvent analyser plusieurs films à la fois, plusTipSeeTracks ne peuvent analyser un film à la fois.

  1. Tapez "plusTipSeeTracks" dans la fenêtre de commande.
  2. Après le chargement de la boîte de dialogue, cliquez sur "Select Project". Sélectionnez le répertoire parent contenant le projet de visualiser et cliquez sur "Sélectionner un dossier". Une nouvelle fenêtre apparaît: "Sélectionnez le projet que vous souhaitez visualiser". Choisissez le fichier à visualiser et cliquez sur "OK".
  3. Ensuite, cliquez sur "Select Saved ROI". Naviguez dans le même dossier roi_X que celle sélectionnée à l'étape précédente et sélectionnez le fichier nommé "roiYX".
  4. Cliquez sur "Sélectionner le répertoire de sortie" pour désigner wici MATLAB enregistrer les fichiers de visualisation de la piste. Note: Nous vous recommandons d'utiliser le même dossier qui contient le reste des données.
  5. Sélectionnez "Faire piste Movie" et un écran apparaît affichant toutes les pistes plusTipGetTracks calculées à partir des comètes TIP +. Cette étape permet d'économiser la série de temps suivis dans un format film, dans le fichier "allTracks_X_X_X". Il ya une option pour enregistrer le film au format AVI, sinon le format par défaut est le fichier Quicktime.mov.

4. plusTipGroupAnalysis

Remarque: Cette fonction finale est utilisée pour créer des groupes de films pour l'analyse et la comparaison de leurs paramètres de piste de MT.

  1. Tapez "plusTipGroupAnalysis" dans la fenêtre de commande. Pour sélectionner manuellement les groupes à comparer, d'abord de-sélectionner "groupe Auto de la hiérarchie". Ensuite, cliquez sur "Sélectionner des projets". Accédez aux répertoires parents contenant tous les dossiers roi_Xà analyser.
  2. Un écran de listSelectGUI apparaît. Sélectionnez tous les projets à inclure dans les groupes à partir du côté gauche de l'écran et de les déplacer sur le côté droit de l'écran. Cliquez sur "OK". Choisissez un emplacement pour enregistrer la liste de projets et cliquez sur "Enregistrer".
  3. Une fenêtre s'affiche: "S'il vous plaît sélectionner premier groupe de la liste". Cliquez sur "OK". La fenêtre listSelectGUI s'affiche à nouveau. Cette fois-ci, sélectionner uniquement les fichiers qui correspondent au premier groupe qui devrait être mis en commun. Cliquez sur "OK".
  4. Ensuite, entrez le nom du groupe, puis cliquez sur "OK". Une fenêtre s'affiche: "Choisissez un autre groupe?" Réponse en conséquence et continuer à sélectionner des groupes. Une fenêtre s'affiche: "Choisissez un emplacement pour enregistrer votre liste de groupe". Accédez à l'emplacement et cliquez sur "Enregistrer".
  5. Cliquez sur "Sélectionner le répertoire de sortie" pour choisir l'endroit où les dossiers de sortie serontstocké.
  6. Sélectionnez le type de l'analyse du groupe de mener - si les pistes de MT devraient être mises en commun pour chaque groupe ou par l'analyse cellulaire doit être effectuée. Les tests statistiques recommandées sont déjà désignés. Pour inclure toutes les pistes dans l'analyse, dé-sélectionnez «Supprimer les pistes au début / fin de film". Sinon, ayant cette case sélectionnée supprime toutes les pistes de croissance de MT qui sont en processus que le film commence ou se termine.
  7. Après la sélection Groupe d'analyse est faite, sélectionnez «Comparer les groupes".

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Résultats

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Grâce à ce logiciel, comme décrit ici fournira plusieurs fichiers d'informations qui permettent de quantifier la dynamique + TIP dans les cellules vivantes.

La fonction plusTipGetTracks identifie les pistes (en utilisant par exemple les paramètres présentés dans la figure 1), puis fournit des paramètres concernant les pistes TIP +. Pour afficher les informations que le logiciel a obtenu, allez dans le répertoire roi_X qui a été créé à l'étape 2.2. Le dossier "feat" contient ...

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Discussion

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PlusTipTracker fournit une interface utilisateur simple, graphique pour détecter rapidement et automatiquement la quasi-totalité visibles comètes EB1-GFP dans un cône de croissance cellulaire ou, le lien entre les comètes en pistes, et calculer les paramètres MT. Autres publications ont rapporté la conception de types de logiciels similaires (par exemple, Marx et al. Analyse quantitative a également utilisé des dynamiques EB1 marqués dans les cônes de croissance 18). Mais, ce logiciel semble être uni...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

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Nous remercions le Dr Gaudenz Danuser et les membres de son laboratoire pour avoir créé le logiciel plusTipTracker et pour la discussion utile concernant l’utilisation du logiciel, en particulier Maria Bagonis et Sébastien Besson. Nous remercions tout particulièrement le Boston College Media Center pour son aide et son soutien dans la création et le montage de la vidéo. Nous remercions également les membres du Lowery Lab pour les discussions utiles et les critiques constructives, ainsi qu’Abigail Antoine pour la relecture du manuscrit. Ce travail a été financé par une bourse NIH R00 MH095768 à LAL.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
plusTipTracker softwareDanuser Labhttp://lccb.hms.harvard.edu/software.htmlCe logiciel pourrait être hébergé par un autre site web à l’avenir.  ; Si le site répertorié n’existe pas, recherchez « Danuser Lab Software » sur un moteur de recherche Web pour trouver le site.
Logiciel MATLABMathworkshttp://www.mathworks.com/products/matlab/

Références

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Mots-clés

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