Souris Transplantation rénale: Les modèles de rejet des allogreffes

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour étudier l’immunologie du rejet. Le modèle chirurgical présenté fait état d’une durée opératoire courte et d’une technique concise. Selon la combinaison de souche donneur-receveur, le rein transplanté peut développer un rejet cellulaire aigu ou des lésions chroniques de l’allogreffe, définies par une fibrose interstitielle et une atrophie tubulaire.

Résumé

Le rejet du rein transplanté chez l’homme reste une cause majeure de morbidité et de mortalité. Le modèle murin de la transplantation rénale reproduit fidèlement les processus techniques et pathologiques qui se produisent dans la transplantation rénale humaine. Bien qu’il existe des modèles murins de rejet allogénique dans des organes autres que le rein et qu’ils soient plus réalisables sur le plan technique, il existe des preuves que différents organes suscitent des modes et des dynamiques de rejet disparates, par exemple l’évolution temporelle du rejet dans l’allogreffe cardiaque et rénale diffère considérablement dans certaines combinaisons de souches. Ce modèle est un outil attrayant pour de nombreuses raisons malgré ses défis techniques. Comme les haplotypes de souches de souris consanguines sont bien caractérisés, il est possible de choisir des combinaisons de donneurs et de receveurs pour modéliser le rejet aigu de l’allogreffe par transplantation à travers les loci I et II du CMH. À l’inverse, la transplantation entre souches ayant des haplotypes similaires peut provoquer un processus chronique où le rein allogreffé développe une fibrose interstitielle et une atrophie tubulaire. Nous avons modifié la technique chirurgicale pour réduire le temps d’opération et améliorer la facilité de la chirurgie, mais une courbe d’apprentissage doit encore être surmontée afin de reproduire fidèlement le modèle. Cette étude fournira des points clés dans la procédure chirurgicale et aidera le processus d’établissement de cette technique.

Introduction

Transplantation rénale réussie pour le traitement de l'insuffisance rénale a été décrite pour la première en 1955 entre jumeaux monozygotes ^1, depuis lors, il est devenu un traitement révolutionnaire destiné aux patients en phase terminale d'insuffisance rénale à travers le monde, offrant à la fois une amélioration de la longueur et de la qualité de la vie ^2. Cependant la survie du greffon à long terme a été entravée par une multitude de processus pathologiques entraînant des dommages de l'allogreffe chronique ^3.

Rejet du rein transplanté chez l'homme reste une cause majeure de morbidité, en dépit des améliorations significatives dans les régimes immunosupporessive. Le but de l'élaboration d'un modèle de souris de la transplantation rénale est de répliquer au plus près le processus et la pathologie trouvé dans la transplantation rénale humaine ^4. Skoskiewicz et al. Décrit d'abord le modèle de souris de la transplantation rénale en 1973 ^5. Bien compétences de microchirurgie de pointe sont nécessaires, il est un objet de valeur tool pour plusieurs raisons: le génome de la souris a été bien caractérisé et il ya une grande variété de méthodes et de techniques disponibles pour les études de souris expérimentales.

De nombreux groupes en utilisant le modèle de souris de la transplantation rénale ont utilisé le rein transplanté comme un organe qui soutient la vie, mais dans d'autres études et dans notre méthodologie décrite une des reins natif de la souris receveuse est laissé en place pendant la durée de l'expérience ^4. L'avantage est que la souris soumise à une anesthésie et opération unique en réduisant ainsi la morbidité de la souris et le risque de décès d'une deuxième procédure. En outre, la souris ne présente pas les effets négatifs de l'insuffisance rénale progressive.

Bien que les modèles de rejet allogénique existent dans d'autres organes tels que le cœur et la peau, ce ne sont pas toujours directement applicables à la transplantation rénale. Il existe des preuves que ces modèles suscitent différents modes et dynamique de rejet, par exemple au cours du temps de rejet dans l'allogreffe cardiaque et allogreffe rénale diffère de manière significative dans certaines combinaisons de contrainte ^6. Nous avons décrit les modèles de rejet d'allogreffe rénale aiguë chez les BALB / c donateurs dans des souris FVB / nj non-transgéniques, ce modèle a montré une blessure à médiation cellulaire avec accumulation de macrophages et les cellules T ^7. Sinon, nous avons décrit un modèle d'endommagement chronique de l'allogreffe qui présente une fibrose interstitielle et atrophie tubulaire, cela résulte de la transplantation d'un rein de souris C57BL / 6 ^BM12 donneurs dans des souris C57BL / 6 destinataires, que ces souris sont caractérisées par une seule CMH de classe II mis loci -match ^8.

Plusieurs aspects de la transplantation ont été étudiés en utilisant un modèle de souris de la transplantation rénale, y compris le rejet aigu, le rejet humoral et cellulaire, une lésion de reperfusion de l'ischémie, et trialing nouveaux agents thérapeutiques. Nous avons modifié la t chirurgicaleechnique pour réduire le temps de fonctionnement et d'améliorer la facilité de la chirurgie. En particulier, nous avons décrit la préparation simultanée et donneur de destinataire et une anastomose vasculaire simplifié par l'utilisation d'un patch anastomose aortique continu. Cette vidéo et manuscrit fourniront des points clés pour aider à la mise en place de cette technique.

Protocole

Éthique institutionnels appropriés nationales et locales devraient être en place avant de procéder à des expérimentations animales. En particulier au Royaume-Uni, les expériences suivantes ont été réalisées dans le cadre des Animaux (Scientific Procedures) Act 1986 Lorsque deux microchirurgiens sont disponibles pour faire fonctionner simultanément le chirurgien des bailleurs de fonds doit exécuter les étapes 1.1 à 1.16 puis 3.1 à 3.5, tandis que le chirurgien bénéficiaire effectue de 2,1 à 2,8 . Pour un seul opérateur les étapes peuvent être suivies successivement.

1. donateurs Préparation

Remarque: La procédure présentée ici est un donneur C57BL / 6 ^BM12 et le destinataire souris C57BL / 6 mâles âgés de 8 à 16 semaines avec un poids supérieur à 20 g. Toutefois, cette procédure peut être effectuée de manière reproductible sur une variété de souches de souris. Les données présentées dans la section des résultats représentatifs ont été obtenues à partir de souris C57BL / 6, souris C57BL / 6 / c ^BM12 et BALB.

1. procédures de conduite using instruments chirurgicaux stériles et consommables (autoclave), avec s'efforce de maintenir la zone d'exploitation aussi stérile que possible. Effectuer la préparation des bailleurs de fonds en même temps que la préparation du destinataire si deux chirurgiens sont disponibles.
2. Anesthésier les souris avec une injection intrapéritonéale (aiguille 31G) de médétomidine (0,5 mg / kg) et du chlorhydrate de kétamine (200 mg / kg). Il en résulte un plan anesthésique qui est maintenue pendant 4 h fournissant suffisamment de temps pour l'ensemble de la procédure à exécuter. Anesthésie supplémentaire n'est pas nécessaire.
3. Assurez-vous que la souris est anesthésiée (pas de réponse à pincement de l'orteil).
4. Raser l'abdomen de la souris et de supprimer toute cheveux dénoués avec du ruban adhésif.
5. Placez la souris sur le dos sur un tapis chauffant stérile et drapé lâche immobiliser les membres avec du ruban de masquage stérile.
6. Surveiller la souris tout au long de la procédure pour des brûlures thermiques. Si possible utiliser une source de chaleur non-électrique.
7. Appliquer un lubrifiant oculaire et sanitize la paroi abdominale avec une solution diluée d'iode.
8. Faire une incision médiane dans l'abdomen pour pénétrer dans la cavité péritonéale et insérer un 3 cm Calibri écarteur abdominal.
9. Appliquer une solution saline chauffée à garder les intestins et zone chirurgicale humide et éviter le dessèchement inutile des viscères.
10. Couvrir la souris avec des champs stériles et déplacer les intestins à la gauche de l'opérateur (droit de la souris) pour exposer l'aorte, la veine cave et rein gauche.
11. Appliquer une pince à cliquet à l'estomac et tirez supérieurement à exposer les principaux vaisseaux et rein gauche complètement. Emballage humide écouvillons stériles (2 mm x 2 mm) dans l'abdomen pour rétracter les tissus de la zone chirurgicale, comme les lobes du foie, des vésicules séminales et des intestins.
12. Isoler le rein gauche de adventia environnante, la graisse et la glande surrénale gauche dans la cavité péritonéale par crûment la dissection du tissu conjonctif à l'aide de fines pinces de pointe. Placez les pointes fermées de la pince entre les zones NEed à séparer et laisser lentement les conseils de pince pour ouvrir à disséquer l'espace.
13. Isoler la veine rénale gauche par ligature, puis en divisant la veine surrénale gauche et gauche veine gonadique avec 9 / O nylon. Placez la suture près de la veine rénale.
14. Ligaturer et diviser l'uretère avec 7 / O soie suture près de la vessie laissant la suture se termine longue. Ces longues extrémités de suture seront utilisés lorsque le rein est récoltée et qui sont nécessaires pour l'anastomose urétérale.
15. À mobiliser et à disséquer complètement l'aorte et la veine cave inférieure en haut et à l'artère et la veine rénales utiliser pince fine pointe de disséquer carrément vaisseaux lymphatiques et de la graisse de l'avant et les côtés des navires.
16. Trouver le plan du tissu entre l'aorte et la veine cave et répartis lentement la pince. Ouvrir lentement les conseils de la pince à pointe fine pour répandre le tissu avec un traumatisme minime.
17. Faire un lâche 7 / O soie autour de l'aorte supérieur et inférieur de l'artère rénale en passant une amende anglepince pointe dans le dos des navires et de dessin une suture à travers. Ces sutures seront resserrées avant le prélèvement de rein pour permettre la perfusion rétrograde de l'Université du Wisconsin solution.

2. bénéficiaire Préparation

Comme par le suivi de la préparation des bailleurs de fonds les étapes 1.2 à 1.8.

1. Déplacez les intestins à la droite de l'opérateur (la gauche de la souris) pour exposer l'aorte, la veine cave. Couvrir les intestins avec une solution saline stérile tige imbibé.
2. Effectuer une néphrectomie droite par ligature de l'artère rénale droite et la veine avec 7/0 suture de soie, puis diviser.
3. Ligaturer l'uretère droit avec 7 / O suture de soie et de partage.
4. Mobiliser et disséquer complètement l'aorte et la veine cave inférieure à l'artère et la veine rénales comme décrit à l'étape 1.14 et 1.15. Veiller à dissection complète entre l'aorte et la veine cave. Prenez soin de préserver l'artère spermatique interne qui fonctionne antérieure à la veine cave et Aortavec un faisceau lymphatique.
5. Identifier les vaisseaux lombaires s'étendant dans le rétropéritoine de la veine cave et la veine de la colonne vertébrale, ligaturer avec 9 / O soie dans la continuité, il n'est pas nécessaire de diviser les navires.
6. Identifier suffisamment d'espace pour placer des pinces microvasculaires avec un espace entre des anastomoses vasculaires.
7. Administrer par voie intraveineuse d'héparine (5 unités) par pénienne dorsale veine.

3. rein de donneur de récupération

Resserrer les liens 7 / S de soie qui ont été placées autour de l'aorte inférieur et supérieur pour isoler les reins de la circulation artérielle.

1. Infuser rétrogrades froid 0,2 à 0,5 ml de solution de l'Université du Wisconsin avec une aiguille (31G) dans l'aorte.
2. Diviser l'aorte dans les sutures et diviser la veine rénale à sa jonction avec la veine cave pour retirer le l'artère rénale avec une longueur de l'aorte et des reins. Diviser les vaisseaux lombaires résultant de l'aorte, s'ils sont présents, en poidsithout ligature.
3. Placez le rein dans une solution saline froide sur un écouvillon stérile dans une boîte de culture.
4. Euthanasier la souris donneuse par dislocation cervicale.

4. transplantation rénale - Kidney Préparation

1. Créer une pièce aortique en divisant la paroi de l'aorte longitudinalement en face de l'artère rénale. Identifier toutes les lumières des navires dans le patch qui doivent être ligaturé ou évités lors de la réalisation de l'anastomose artérielle.
2. Placer une suture 10 / S de l'extérieur vers l'intérieur de la lumière de la veine rénales en haut et un second fil de suture séparé le bas. Les sutures utilisées pour diviser la veine surrénale et la veine gonadique peuvent être utilisés pour orienter le récipient.
3. Placez le rein dans le flanc droit du bénéficiaire (Figure 1.1) et s'assurer que les sutures sont bien placés pour assurer anastomoses vasculaires peuvent être menées à bien sans les sutures devenir enlacés dans les écouvillons ou d'autres instruments.

5. rein Transplanmise - vasculaire anastomose

Appliquer pinces microvasculaires abord le bas puis englobant supérieurement la veine cave et l'aorte.

1. Ajouter un ventomy avec une aiguille (31G) en perforant la paroi antérieure de la veine cave. Rincer le sang de la veine cave par injection d'environ 50 pi de NaCl à 0,9%.
2. Élargir la Phlebotomie en utilisant de fines pinces d'extrémité en les ouvrant à l'intérieur de la Phlebotomie de sorte que la longueur est équivalente au diamètre de la veine rénale du donneur.
3. Placer la suture supérieure 10 d'E / S (qui est déjà dans la lumière de la veine rénale) d'abord au niveau du sommet de la Phlebotomie (figure 1.2) et de rejoindre la paroi arrière de l'anastomose en un fil de suture en cours d'exécution jusqu'à ce que le sommet inférieur est atteint (figure 1.3).
4. Placez le 10 / O suture inférieure et attachez d'abord avec un seul nœud (Figure 1.4), puis attacher à la suture allant de la paroi arrière.
5. Utilisation de la suture inférieure créer l'avant wall de l'anastomose (Figure 1.5) par un surjet et attacher à la fin de suture supérieure au sommet supérieur (Figure 1.6).
6. Créer un aortotomie en décrochant le paroi de l'aorte avec une pince et couper une pièce elliptique avec des ciseaux (environ la aortotomie devrait être un cinquième de la circonférence de l'aorte et trois fois la lumière de l'artère rénale en longueur).
7. Placez un fil de suture 10 / O au point supérieur du patch aortique de l'extérieur vers l'intérieur (Figure 1.7) et passer à travers l'aorte pour attacher à l'extérieur des bâtiments au sommet supérieur de la aortotomie.
8. Créer l'anastomose artérielle par un surjet à partir supérieurement (Figure 1.8) anastomose le patch des bailleurs de fonds à l'aorte bénéficiaire, prendre soin de ne pas resserrer l'anastomose en liant la suture trop serré (Figure 1.9).
9. Retirer les pinces vasculaires inférieures d'abord, puis la pince supérieure à la reperfusion du rein (Figure 1.10 et 1.11). Péristaltisme visible de l'uretère peut-être vu si l'approvisionnement en sang adéquat à l'uretère est atteint.

6. transplantation rénale - anastomose urétérale

1. Diviser les pièces jointes de la vessie à partir de la paroi abdominale.
2. Passer une aiguille (21G) de gauche à droite de la vessie par deux murs.
3. Placez conseils de pince droite dans la lumière d'aiguilles et de passer à la fois à travers la vessie tels que les pinces passent maintenant de droite à gauche sur le côté gauche de la vessie.
4. Dessiner la suture sur l'uretère des donateurs à travers la vessie tels que l'uretère passe dans le défaut de la vessie gauche, puis sur le côté droit.
5. Suturer l'adventice de l'uretère à l'adventice de la vessie avec trois points séparés simples autour du point d'entrée avec 9 / O nylon suture sur une aiguille ronde valides.
6. Couper l'extrémité proximale de l'uretère à la ligature, e ouvrant ainsie uretère pour permettre à l'urine de s'écouler et permettre à l'extrémité de l'uretère à se rétracter dans le corps de la vessie. Production visible de l'urine peut être observé avec des saignements de péri-uretère navires.
7. Fermez le droit défaut de la vessie de côté avec une seule interruption de 9 / O soie suture.

7. Récupération et soins post-opératoires

Remplacer les viscères gastro-intestinal dans l'abdomen dans leur orientation d'origine et fermer la paroi abdominale en rapprochant les muscles droits avec 6 / O fil résorbable.

1. Se rapprocher de la peau avec des clips de la peau de métal.
2. Inverser partiellement l'anesthésie par une injection sous-cutanée de chlorhydrate atipamazole (10 ul / g).
3. Administrer analgésie par le chlorhydrate de buprénorphine sous-cutanée (0,05 mg / kg) et de l'injection du fluide de support sous-cutanée de 1 ml de NaCl à 0,9%.
4. Récupérer la souris dans une armoire chauffante à 28 ° C pendant 24 à 48 heures. Observez la souris pour maladie jusqu'à lafin de l'expérience.
5. Retirer les clips de la peau de métal 7 - 10 jours après l'opération.
6. Une fois l'expérience terminée euthanasier la souris par dislocation cervicale.
7. Retirer et recueillir les controlatéral rein et allogreffe pour l'analyse histologique.

Résultats

Le rejet d'allogreffe rénale peut être évaluée par une analyse histologique de coupes de tissus fixés Methacarn paraffine du rein transplanté (figure 2). Transplantation de reins isogreffe entre les résultats des souris syngéniques dans les lésions de reperfusion ischémique rénale, mais de 4 semaines, les tubules ont récupéré et sont histologiquement comparable à reins natifs. Le rejet aigu peut être modélisé par les souris C57BL / 6 dans des receveurs de transplantation rénale de souris BALB / c, penda...

Discussion

La manière la plus bien décrites pour effectuer l'anastomose artérielle est d'utiliser l'aorte distale du donneur, à l'artère rénale dans le prolongement, d'une manière bout à l'autre de l'aorte destinataire. Nous décrivons l'utilisation d'un correctif de l'aorte, similaire à la mise en miroir 'Carrell patch' qui a effectué la transplantation de rein humain que nous croyons être plus pratique. Bien que les rapports de la littérature du donneur et du receveur opératoire tem...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Instruments chirurgicaux
Ciseaux de dissection émoussés	Outils scientifiques fins	; 14072-10	Pour la coupe de la peau
Ciseaux Castoviejo incurvés	Outils de science fine	15017-10	Pour la coupe de tissus
Ciseaux à ressort &ndash ; droits	Outils de science fine	15000-08	Pour la coupe de suture
Pince dentée 1x2 dents	Outils de science fine	11021-12
2 x Pince à pointe fine (Dumont No.5)	Outils de science fine	11251-20
Pince coudée à pointe fine (Dumont n° 5/45)	Fine Science Tools	11253-25	Pour la dissection émoussée
Pince à pointe fine incurvée (Dumont n° 7)	Fine Science Tools	11273-22	Utile pour faire circuler les récipients
Crile Haemostat incurvé	Fine Science Tools	1300-04
Micro clip applicateur avec serrure	Fine Science Tools	18056-14
2 x Micro serrefines largeur de ressort 2mm, longueur de la mâchoire 4mm	Fine Science Tools	18055-04	Pinces microvasculaires
2 x Colibri 3cm écarteur de fil	Fine Science Tools	17000-03
Porte-aiguille Castroviejo avec serrure	Fine Science Tools	120660-01
Applicateur de clip de bobine	Fine Science Tools	12031-07
Clips de bobinage de 7mm	Fine Science Outils	12032-07	Retirer 7 à 10 jours après l’opération
Équipement
OPMI pico microscope	Carl Zeiss	S100
Unité de cautérisation thermique à pointe fine	Geiger	150A
Heat Tampon électronique	Cozee Cumfort	n/a
Euroklav 23-S	Melag	n/a	Autoclave
Jetable équipement
7/O Suture tressée en soie	Pearsall	30514
10/O Suture Dafilon (polyamide)	B-Braun	;
6/O Vicryl (plygalectine)	Ethicon	W9537
Aiguille à biseau régulier, 1 pouce, 21G	Bection, Dickinson and Company	305175	Pour l’anastamose urétérale
Aiguille à biseau régulier, 5/8 pouce, 25G	Bection, Dickinson and Company	305122
Aiguille à biseau régulière, 1/2 pouce, 30G	Bection, Dickinson and Company	304000
Aiguille à insuline 1ml, 29G	Bection, Dickinson and Company	324827
Aiguille à insuline 0.3ml, 30G	Bection, Dickinson and Company	324826
1 ml seringue slip tip	Bection, Dickinson and Company	300184
5 ml seringue slip	Bection, Dickinson and Company	302187
Wypall paper écouvillons	Kimberley-Clark	L40	stérilisé en autoclave
Cotons-tiges	Johnson and Johnson n	/a	stérilisé en autoclave
Champs unis	Guardian	CB03	stérilisé en autoclave
Boîte de culture cellulaire 60mm x 15mm	Corning Incorporated
Goupille de distribution	B-Braun	DP3500L / 413501	Utilisé avec NaCl 0,9 %
Réactifs et médicaments
(Lacri-Lube) Paraffine molle blanche 57,3 %, huile minérale 42,5 % et alcools de lanoline 0,2 %	Allergan Ltd	21956GB10X
(Videne) Povidone iodée 10 %	Ecolab Ltd	PL 04509/0041
(Vetalar V) Chlorhydrate de kétamine	Pfizer Animal Health	Vm 42058/4165	solution 100mg/ml (dose 200mg/kg)
(Domitor) Chlorhydrate de médétomidine  ;	Orion Pharma	VM 06043/4003	1mg/ml (dose 0,5mg/kg)
(Vetergesic) Chlorhydrate de bupernorphine  ;	Alsto Animal Health	Vm 00063/4002	0,3 mg/ml (dose 0,05 mg/kg)
(antisédan) Atipamezole hydrochoride	Orion Pharma	Vm 06043/4004	5 mg/ml (dose 2 mg/kg)
Université du Wisconsin Solution	Belzer Bridge to Life	n/a	dose environ 500 microlitres/souris
NaCl 0,9 %	Baxter	FKE1323
sulfate d’héparine	non exclusif	n/a	5000 unités/ml (dose 5 unités/souris)

G1118099 tip 430166