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Article de méthode

Une Ex vivo Modèle de T-Cell Attaque de Oligodendrocyte dirigée dans aigus tranches cérébrales

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DOI :

10.3791/52205

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5 février 2015

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1Department of Neurology, University of Münster, 2Germany and Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Münster, 3Institute of Physiology I - Neuropathophysiology I, University of Münster

Dans cet article

Résumé

Pour aborder les mécanismes de démyélinisation et d’apoptose neuronale dans les lésions corticales des troubles inflammatoires démyélinisants, différents modèles animaux sont utilisés. Nous décrivons ici une approche ex vivo en utilisant des lymphocytes T CD8+ spécifiques des oligodendrocytes sur des coupes de cerveau, entraînant la mort oligodendrogliale et neuronale. Les applications potentielles et les limites du modèle sont discutées.

Résumé

La mort des oligodendrocytes accompagnée de la destruction des neurones et des axones sont des signes histopathologiques typiques des lésions de la substance grise corticale et sous-corticale dans les troubles inflammatoires démyélinisants comme la sclérose en plaques (SEP). Dans ces troubles, on trouve principalement des lymphocytes T CD8+ de spécificité présumée pour les antigènes liés à la myéline et aux oligodendrocytes, de sorte que l’apoptose neuronale dans les lésions de la matière grise peut être un effet collatéral de ces cellules. Différents types de modèles animaux sont établis pour étudier les mécanismes sous-jacents des processus physiopathologiques mentionnés. Cependant, bien qu’ils imitent certains aspects de la SP, il est impossible de disséquer le mécanisme exact et l’évolution temporelle de la mort cellulaire neuronale « collatérale ». Pour aborder ce cours, nous montrons ici un protocole pour étudier les mécanismes et la réponse temporelle des lésions neuronales suite à une attaque de lymphocytes T CD8+ dirigée par des oligodendrocytes. Pour cibler uniquement la gaine de myéline et les oligodendrocytes, des lymphocytes T CD8+ spécifiques des oligodendrocytes activés in vitro sont transférés dans des coupes cérébrales isolées de manière aiguë. Après une période d’incubation définie, la myéline et les lésions neuronales peuvent être analysées dans différentes régions d’intérêt. Les applications potentielles et les limites de ce modèle seront discutées.

Introduction

La mort des oligodendrocytes et la destruction de la gaine de myéline accompagnées d’une perte de neurones et d’axones sont des signes pathologiques typiques des lésions de la matière grise chez les personnes atteintes de sclérose en plaques (SEP)1,2. Les lésions corticales peuvent être divisées jusqu’à présent en trois sous-types différents2 : lésions sous-piales, intracorticales et leuco-corticales. Par rapport aux plaques de substance blanche, les infiltrats sont caractérisés par une prédominance de lymphocytes T CD8+, suggérant leur possible rôle décisif dans l’inflammation de la matière grise3. De plus, des expansions oligoclonales dans le sang, le liquide céphalo-rachidien (LCR) et dans les lésions inflammatoires peuvent être observées pour les lymphocytes T CD8+ eux-mêmes 4-6.

Dans le même ordre d’idées, on suppose que les lymphocytes T CD8+ peuvent être spécifiques de différentes protéines de myéline7,8. En effet, les lymphocytes T CD8+ se trouvent à proximité des oligodendrocytes et des gaines de myéline9,10 qui montrent l’expression du CMH I11 et pourraient donc être responsables de la perte de la gaine de myéline. Ce processus est souvent associé à d’importantes lésions neuronales et axonales « collatérales » dans la matière grise du système nerveux central (SNC)1,2. En fait, la mort directe et indirecte des oligodendrocytes et des neurones est induite par les lymphocytes T CD8+ via deux mécanismes différents : (i) le gonflement et la rupture de la membrane cellulaire dus à la formation de granules cytotoxiques suite à la libération de perforines et de granzymes et (ii) la ligature des récepteurs Fas ou l’exposition de FasL à leur surface8,12,13.

Différents types de modèles animaux sont établis pour étudier le mécanisme sous-jacent des processus mentionnés. À cet égard, les lymphocytes T CD8+ amorcés spécifiques des auto-antigènes dont l’expression est induite dans les cellules gliales du SNC, comme les oligodendrocytes ou les astrocytes, peuvent être transférés adoptivement pour analyser la mort neuronale et axonale ''collatérale'' dans la matière grise par la suite14,15. La réalisation de telles expériences in vivo est d’une grande aide pour imiter certains aspects physiopathologiques de la SEP, cependant, cette approche n’est pas adaptée pour résoudre le mécanisme sous-jacent et la cinétique des lésions axonales et de l’apoptose neuronale.

Pour surmonter ces restrictions, une approche ex vivo a été mise en place pour étudier les mécanismes et l’évolution temporelle de la mort cellulaire neuronale à la suite d’une attaque de lymphocytes T CD8+ dirigée par des oligondendrocytes. Étant donné que seuls les oligodendrocytes et donc la production de gaine de myéline devraient être ciblés par les cellules immunitaires, des cellules T OT-I réactives à l’ovalbumine (OVA) restreintes au CMH (OVA) sont utilisées16. Ces cellules sont ensuite transférées dans des coupes de cerveau obtenues à partir de souris exprimant sélectivement des OVA dans des oligodendrocytes (souris ODC-OVA)17.

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Protocole

Toutes les expériences utilisant des souris doivent être effectuées en conformité avec les directives du comité de protection des animaux et l'utilisation institutionnelle respective.

1. Observations générales pour l'expérimentation de la souris

  1. Gardez les souris dans des conditions exemptes d'agents pathogènes et de leur permettre l'accès à la nourriture et de l'eau ad libitum.
    NOTE: Il est important d'utiliser des souris d'âge et le sexe dans les groupes expérimentaux parce que les habitudes immunologiques peuvent varier avec l'âge et le sexe.

2. Préparation des cellules T et l'activation de OVA-spécifiques CD8 + (OT-I)

  1. Effectuer la stimulation des cellules T OT-I comme décrit ci-dessous cinq jours avant de préparer des tranches de cerveau.
    NOTE: 5 x 10 5 effectrices CD8 + activées OT-I des cellules T CD8 + (cellules T de souris transgéniques qui reconnaissent le peptide OVA seule 257-264 dans le contexte de molécules du CMH-I) sont nécessaires par tranche la concentration 5 x 10 5 a été choisi expérienceallié comme optimale une à favoriser une bonne interaction cellule-cellule une fois que les cellules commencent à migrer dans la tranche et, en même temps, la quantité de cellules ne est pas trop élevée pour induire une réaction excessive permettant cellule unique comptant 8,18.
  2. Préparer le milieu de culture de cellules T OT-I. Supplément 500 ml de DMEM avec 5% de sérum de veau foetal (FCS), 10 mM d'HEPES, 2 mM de L-glutamine, 50 pM de 2-mercaptoéthanol, 1% acides aminés non essentiels et 25 ug / ml de gentamicine. Conserver le milieu à 4 ° C jusqu'à utilisation.
  3. Retirer la rate de souris transgéniques OT-I par référence 16. Les transférer dans le milieu préparé.
  4. Générer suspension cellulaire unique en écrasant les rates à travers une passoire et centrifuger la suspension de 70 um à 300 g pendant 5 min, 4 ° C.
  5. Incuber suspension de cellules avec 5 ml de chlorure d'ammonium-potassium (ACK) du tampon (150 mM de NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3, 0,1 mM d'EDTA, pH 7,3) pendant 5 minutes pour lyser les globules rouges.
  6. Arrêtez incubatiavec un milieu de 10 ml et on centrifuge à nouveau comme décrit ci-dessus.
  7. Diluer la suspension de cellules dans un milieu et calculer des nombres. cellules de la plaque à une densité de 3 x 10 7 cellules / puits dans une plaque à 12 puits et on les premier par incubation avec de l'OVA 257-264 (SIINFEKL; 1 nM) et de l'interleukine 2 (IL-2) (500 UI / ml) pendant 5 jours.
  8. Après 4 jours, ajouter l'IL-2 à une concentration de 500 UI / mL à nouveau.
  9. Après stimulation, les cellules T purifier OT-I de la suspension de cellules à l'aide d'une sélection négative à base de souris CD8 + kit d'isolement des cellules T suivant les instructions du fabricant. La purification est basée sur l'épuisement de toutes les cellules CD8 + non en utilisant un cocktail d'anticorps contre CD4, CD11b, CD11c, CD19, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, CMH de classe II, Ter-119, et TCRy / δ qui sont ensuite mis au rebut en utilisant des colonnes magnétiques pour l'élution des cellules T CD8 + purifiées.
    REMARQUE: Les étapes critiques dans ce procre sont indiqués par les constructeurs: il est important que la réaction ne implique que des cellules uniques, car la présence de touffes peut bloquer la colonne lors de l'étape d'élution; le comptage de la cellule avant l'addition du cocktail Byotin est important que le degré de pureté de l'échantillon et le test doit être réalisé sur de la glace pour minimiser les liaisons non spécifiques des anticorps.

3. Préparation des tranches de cerveau aiguë et co-culture avec des cellules T OT-I

  1. Avant la préparation de cerveau aiguë tranches 19, préparer une solution saline placedine glacée physiologique utilisant le saccharose 200 mM, 20 mM de PIPES, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM NaH 2 PO 4, mM MgSO 4, 10 0,5 CaCl2 et 10 mM de dextrose et le liquide céphalorachidien artificiel (ACSF) en utilisant 125 mM de NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 24 mM de NaHCO 3, 2 mM de MgSO 4, 2 mM de CaCl2, 10 mM de dextrose. Ajuster le pH de chaque solution à 7,35 par usinNaOH g. Avant d'ajuster le pH de l'ACSF, solution doit être fait barboter avec un mélange de 95% O 2 et 5% de CO 2.
  2. Pré-refroidir les solutions.
  3. Anesthésier 8 - souris âgées 10 semaines (par exemple, C57BL / 6 que le contrôle ou transgénique ODC-OVA souris 17 à l'inhalation en utilisant 5,0% d'isoflurane, 5,0% d'halothane ou injecter 100 mg / kg de kétamine et 10 mg / kg de xylazine de poids corporel par ip Attendre pour l'anesthésie et utiliser une pincée d'orteil pour évaluer le niveau de l'anesthésie et décapiter à la fois. Euthanasier la souris selon protection des animaux et utiliser des critères du comité pour l'euthanasie.
  4. Mettez la souris en position ventrale. Désinfecter et couper le cuir chevelu sagittalement. Ouvrez l'os crânien sagittal, retirez rapidement le cerveau à l'aide d'une pelle et le fixer sur la plaque d'un vibratome en utilisant de la colle.
  5. Remplir la plaque avec la solution saline préparée placedine glacée physiologique.
  6. Couper 300 um coupes coronales avec le vibratome.
    NOTE: Cette procédure est connuen pour obtenir des échantillons de tissus intacts viables appropriés pour des études fonctionnelles cellulaires dans un intervalle de temps d'au moins 8 h 19 à 21. En effet, après cette période de temps, commence déjà après 6 h, la préparation montre la qualité réduite, à savoir la modification des propriétés de base et fonctionnelles comme action potentielle génération et la propagation.
  7. Après la coupe, transférer une tranche immédiatement dans chaque puits d'une plaque de 12 puits rempli d'ACSF.
  8. Ajouter soigneusement 5 x 10 5 cellules T OT-I par tranche.
  9. Incuber tranches jusqu'à 8 heures dans un incubateur (37 ° C, 5% CO 2).
  10. Après la période d'incubation, les tranches de récolte et de les intégrer en utilisant octobre composé Tissue-Tek et les congeler dans l'azote liquide. Rangez-les à -20 ° C pour de plus amples études histologiques à par exemple, évaluer la structure neuronale (par exemple, en utilisant anti-MAPII ou des anticorps anti-synaptophysine) ou l'apoptose (par exemple, en utilisant des anti-caspase-3 et des anticorps anti-NeuN anti-corps) selon des procédures standard.

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Résultats

Après une incubation de coupes de cerveau avec des cellules T d'oligodendrocytes dirigée CD8 +, les oligodendrocytes ainsi que les neurones subissent une apoptose (figures 2A et 1C, respectivement). Signes histologiques de l'apoptose (par exemple, la caspase-3, Tunel) peuvent être détectés plus tôt après 3 heures d'incubation. La période d'incubation ne doit pas être plus long que 8 heures afin de garantir une bonne qualité de la préparation et des résultats reproductibles. Les cellu...

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Discussion

Différents modèles animaux ont été décrits au cours des dernières décennies pour répondre aux caractéristiques pathologiques de troubles inflammatoires démyélinisantes comme MS. In vivo des modèles de souris et de rat sont largement utilisés pour imiter les caractéristiques physiopathologiques de la maladie, à savoir, l'analyse des conséquences des processus de démyélinisation et de remyélinisation et des épisodes entremêlées de l'inflammation et de la neurodégénérescence. Néanmoins, seule une approche ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le Centre interdisciplinaire de recherche clinique (IZKF) de Münster (SEED 03/12, SB), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB TR128, TP B6 à S.G.M. ME3283/2-1 à S.G.M.) et par Innovative Medizinische Forschung, Münster (I-BI111316, SB et SGM).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaque 12 puitsCorning3513
2-MercaptoethanolGibco31350-010
2-MethylbutanRoth3927.1
70 µ ; m passoireFalcon352350
CaCl2Merck1.02382.0500chlorure
de calcium CD8+-isolationkit Miltenyi Biotech130-090-859
D(+)-glucoseMerck1.08337.1000
DMEMGibco31966-021chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation
EDTASigmaE5134
FCSPAA LaboratoriesA15-151sérum de veau fœtal
GentamicinGibco15750-060
HEPES 1 MGibco15630-050
IL-2Peprotech212-12
IsofluranAbbott05260-05
KClMerck1.04933.0500chlorure de potassium
KHCO3SigmaP9144hydrogénocarbonate de potassium
L-Glutamine Gibco35050-038
MgSO4Merck1.05886.0500sulfate de magnésium
NaClSigma31434chlorure
de sodiumNaH2PO4 * H2OMerck1.06346.0500hydrogénophosphate de sodium
NaHCO3Merck1.06329.0500hydrogénocarbonate de sodium
NaOHMerck1.09137.1000hydroxyde de sodium
NH4ClSigma213330chlorure d’ammonium
Acide aminé non essentielGibco11140-050
OVA (257-264)GenscriptRP10611ovalbumine
PIPESSigmaP6757
SaccharoseMerck1.07687.1000
Tissue-Tek OCTSakura4583

Références

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