Détection et analyse de l'ADN dommages souris muscle squelettique In Situ Utilisation de la méthode TUNEL

Résumé

Cette vidéo décrit la dissection, le traitement des tissus, le sectionnement et le marquage TUNEL par fluorescence du muscle squelettique de la souris. Il décrit également une méthode d’analyse semi-automatisée de l’étiquetage TUNEL.

Résumé

Le marquage final de la désoxynucléotidyl transférase (TdT) et de la désoxyuridine triphosphate (dUTP) (TUNEL) est la méthode d’utilisation de l’enzyme TdT pour attacher de manière covalente une forme marquée de dUTP aux extrémités 3' des cassures d’ADN double et simple brin dans les cellules. Il s’agit d’une méthode fiable et utile pour détecter les dommages à l’ADN et la mort cellulaire in situ. Cette vidéo décrit la dissection, le traitement des tissus, le sectionnement et le marquage TUNEL basé sur la fluorescence du muscle squelettique de la souris. Il décrit également une méthode de quantification semi-automatisée du signal TUNEL. Les caractéristiques normales inhérentes des tissus et les conditions de traitement des tissus affectent la capacité de l’enzyme TdT à marquer efficacement l’ADN. Le traitement des tissus peut également ajouter une autofluorescence indésirable qui interférera avec la détection du signal TUNEL. Par conséquent, il est important de déterminer empiriquement les méthodes de traitement des tissus et de marquage TUNEL qui permettront d’obtenir le rapport signal/bruit optimal pour la quantification ultérieure. Le test basé sur la fluorescence décrit ici fournit un moyen d’exclure le signal autofluorescent par soustraction de canal numérique. Le test TUNEL, utilisé avec des techniques et des contrôles appropriés de traitement des tissus, est une méthode quantitative relativement rapide et reproductible pour détecter l’apoptose dans les tissus. Il peut être utilisé pour confirmer les dommages à l’ADN et l’apoptose en tant que mécanismes pathologiques, pour identifier les types de cellules affectées et pour évaluer l’efficacité des traitements thérapeutiques in vivo.

Introduction

Désoxynucléotidyl transférase (TdT) dUTP nick Terminal étiquetage final (TUNEL) est le processus d'utilisation de l'enzyme TdT pour fixer dUTP à 3 'extrémités de double et l'ADN simple brin casse ^12,23. La méthode TUNEL pour la détection de l'apoptose et dommages à l'ADN a été signalée il ya plus de 20 ans par Gavrieli et al. ^1,12,24. Depuis, il a été évalué et optimisé dans les différentes préparations de tissu ^7,23,27,40. TUNEL a été utilisée pour étudier la mort cellulaire induite par l'ischémie des neurones et des cardiomyocytes ^{43,44 6,14,29,} excitotoxique mort des cellules neuronales ^30,31, et en tant que biomarqueur pour le traitement de l'arthrite ^39. Il a également été utilisé en tant que facteur de pronostic et le marqueur de cellules tumorales dans divers cancers humains ^{2,3,15,32,37,38,42.}

Des méthodes alternatives existent pour dommages à l'ADN et la détection de la mort cellulaire, mais ils ont des défis techniques et mises en garde. Southern blot peut être utilisée pour QUANTIFdommages à l'ADN dans les lysats y tissus entiers ^7,9-11, mais cette méthode ne fournit pas la résolution au niveau cellulaire et est difficile à quantifier. Le dosage comète est une méthode à base de cellules de remplacement qui nécessite l'extraction des noyaux de cellules conservées ^4,20,28,36. Bien que le test des comètes fonctionne bien sur des cellules isolées en culture, il est beaucoup plus difficile de préparer des noyaux intacts à partir de tissu musculaire squelettique ^8,21. Comme Southern blot, le dosage comète ne fournit pas d'informations de type cellule-spécifique de tout un homogénat du tissu musculaire. Une autre alternative à la méthode TUNEL est immunohistochimie utilisant des anticorps contre l'ADN simple brin ^25,33,41 ou contre des protéines qui participent dans les voies dommages à l'ADN d'intervention et de mort cellulaire (par exemple p53, H2AX et caspases) ^13,17,22,40. De telles méthodes à base d'anticorps nécessite la caractérisation d'anticorps complète et une excellente spécificité de l'anticorps pour donner un rapport signal à bruit de fond. Même lorsque specific anticorps existent, ils peuvent nécessiter une dénaturation de la protéine cible par des procédures de récupération de l'antigène ^34,35. Comme nous le verrons ici, la récupération d'antigène dans les résultats de tissu musculaire dans inacceptablement élevé autofluorescence. Contrairement aux autres méthodes, TUNEL atteint dommages détection de l'ADN avec un signal élevé et faible bruit de fond, une excellente spécificité qui peut être testée avec des contrôles simples positifs et négatifs, une bonne pénétration de tissu qui ne nécessitent pas de récupération d'antigène, et la résolution de niveau cellulaire. En outre, la méthode TUNEL faut environ quatre heures pour terminer, alors que les méthodes alternatives nécessitent généralement incubations nuit.

Nous étudions squelettique mort des cellules musculaires dans un modèle murin de l'atrophie musculaire spinale (SMA) ¹⁰ qui a été généré par Hsieh-Li et ses collègues ^16. Pour quantifier les cellules apoptotiques dans le muscle, nous avons développé une méthode de préparation des tissus, la coloration, et la quantification robuste qui fonctionne à travers skele différenteTal groupes musculaires à différents points de temps de développement chez la souris. Nous utilisons un kit TUNEL d'étiquetage disponible dans le commerce et commercialisés logiciel d'analyse d'image. Nous avons également utilisé avec succès l'essai TUNEL en combinaison avec coloration immunofluorescente dans la ¹⁰ moelle épinière.

Les méthodes décrites ici sont utiles pour les enquêteurs qui veulent évaluer la pathologie des tissus, des mécanismes de la maladie, les mécanismes du vieillissement et de développement (pré et post-natal) la mort cellulaire dans le muscle squelettique. La technique TUNEL est particulièrement utile pour l'étude des lésions de l'ADN et la réparation et la mort cellulaire dans des systèmes modèles où seul un sous-ensemble de cellules est affecté résolution au niveau cellulaire et ne est nécessaire.

Cette vidéo décrit la dissection, le traitement des tissus, le sectionnement, et basé sur la fluorescence étiquetage TUNEL du muscle squelettique de souris. Il décrit également un procédé de semi-automatisé TUNEL signal de quantification.

Protocole

NOTE: Toutes les procédures d'animaux décrits dans le présent protocole ont été réalisées en conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health ^26. Le protocole (MO13M391) a été approuvé par le Comité Université soin et l'utilisation des animaux Johns Hopkins.

Sacrifice 1. néonatale souris, Dissection, et fixation

1. Sacrifiez une souris néonatale par inhalation de CO _2.
2. Immédiatement couper la patte arrière au-dessus du genou. Jusqu'au jour environ 7 postnatale, les os de la jambe sont assez doux pour couper à travers avec des ciseaux de laboratoire grandes ou lame tranchante et de l'article par la suite sur un cryostat.
3. Placer la patte arrière dans 10 ml de glace froide 4% de paraformaldehyde dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans un tube de 15 ml.
4. Immersion fixer le membre postérieur au paraformaldéhyde pendant 4-24 heures à 4 ° C. Tissus embryonnaires nécessite seulement plusieurs heuress de la fixation.
   1. Évitez la fixation de plus de 24 heures, car cela peut réduire l'efficacité de l'essai TUNEL.
5. Cryoprotect la patte arrière en l'immergeant dans une solution de saccharose.
   1. Changer paraformaldehyde à 10% de saccharose dans du STP dans le même tube de 15 ml, incuber une nuit à 4 ° C.
   2. Changement de saccharose à 30% dans du PBS, incuber une nuit à 4 ° C ou jusqu'à ce que les puits des membres postérieurs au fond du tube. Tissu peut être laissé dans 30% de saccharose pendant une période plus longue, à condition que le saccharose a été stérilisée par filtration.

2. Enrobage des tissus

1. Remplir un moule intégration à mi-chemin marqué avec milieu d'inclusion.
2. Passer membre postérieur sur le dessus du milieu d'inclusion, avec la face de coupe la plus proche possible à une paroi du moule. Marquer l'orientation de la patte arrière à l'extérieur du moule.
   1. Incluez plusieurs membres postérieurs et couper dans le même bloc. Cependant, il est important de se assurer que tous hindlimbs dans le bloc sont orientés parallèlement les uns aux autres pour obtenir des sections correspondant à des niveaux le long de l'axe du membre.
3. Couvrir avec les membres postérieurs milieu d'inclusion. Si hindlimbs Maj enfoncée tout en versant le milieu, les réorienter avec une pince à bout mousse ou un cure-dent.
4. Autoriser milieu d'inclusion pour infiltrer le tissu à la température ambiante pendant au moins 15 min.
5. La place moules directement sur la glace sèche ou en isopentane sur glace sèche de geler milieu d'inclusion. Assurez-vous de maintenir le niveau des moules en tout temps et éviter tout déplacement du tissu intégré.
6. Gardez moules congelées à -80 ° C jusqu'au moment de couper, pendant plusieurs mois.

3. Cryosectioning embarqué Limbs

1. Régler la température de la chambre cryostat à -20 ° C, température de l'objet à -18 ° C; régler la température de l'objet de la manière nécessaire.
2. Équilibrer le bloc de tissu à l'intérieur de la chambre de cryostat pendant au moins 30 min. Bloc correcte températurerature est crucial pour la section qualité.
3. Couper des sections transversales d'une épaisseur de 10 um ou moins. Sections plus épaisses ne seront pas entièrement pénétré par les réactifs TUNEL. Utilisez la plaque anti-roulis, lames, et l'angle de la lame (typiquement 5 °) recommandé pour le cryostat.
4. Recueillir sections SUR DES gelatin- ou lames de verre vectabond revêtus à la température ambiante. Placez immédiatement dans une boîte de diapositives sur glace sèche. Gardez la boîte de diapositive dans un récipient séparé avec de la glace sèche est placé près du cryostat à portée de bras.
   1. Couper sections transversale série à travers le grand axe de la branche, en sautant 100-200 um. Collectez au moins 3 sections adjacentes à chaque niveau de série.

4. TUNEL Essai sur les articles des membres postérieurs en utilisant un kit disponible dans le commerce (toutes les étapes à la température ambiante, sauf indication contraire)

1. Décongeler diapositives avec des sections à température ambiante et sécher pendant la nuit ou le week-end.
2. Réhydrater sections par immersing lames dans du PBS pour 2 x 10 min dans une jarre de Coplin. Sécher avec un laboratoire lingette, retirer autant de liquide autour de la section que possible.
3. Sections perméabilisent
   1. Utilisez soit un non-protéolytique, basée saponine-réactif commercial ou 0,5% de Tween 20 et 0,05% de Triton X100 dans du PBS.
   2. Placer la lame dans une chambre humide. Une chambre d'humidité est simple: une boîte de pointe de la pipette vide avec un couvercle étanche, avec juste assez d'eau ajoutée pour couvrir le fond de la boîte.
   3. Pipette assez réactif sur la diapositive pour couvrir la section (50 pi est suffisante pour les membres de la souris néonatales). Ne pas pipette directement sur la section, que l'agitation répétée peut provoquer la section de soulever hors de la diapositive.
   4. En utilisant une pince à bout mousse, placez un petit rectangle de parafilm sur le dessus de la section d'étaler la goutte de réactif et couvrir complètement la section. Si des bulles se forment sous la parafilm, soulevez doucement le tout, sec, et réappliquer.
   5. Incuber les lames avec permeabiliréactif tion pendant 1 heure dans une chambre d'humidité couverte. Si sections commencent à décoller de la diapositive, le temps de perméabilisation peut être réduite à 30 min.
   6. Laver les lames dans du PBS dans une jarre de Coplin 2 x 5 min. Les rectangles de parafilm devraient flotter à la surface et peuvent ensuite être enlevé et jeté.
   7. Utiliser un laboratoire lingette, sécher autant de liquide autour des sections que possible.
4. TdT médiation étiquetage de cassure de l'ADN
   1. Suivez les instructions du kit pour faire 1x tampon de l'étiquetage TdT, tampon d'étiquetage suffisamment de pipette sur la lame pour couvrir coupe de tissu (50 pi est suffisante pour les membres de la souris néonatales). Incuber dans la chambre humide pendant 5 min. Alternativement, immerger la lame dans du tampon de l'étiquetage TdT dans un bocal de Coplin.
   2. Suivez les instructions du kit pour faire TdT étiquetage mélange. Le kit comprend le cobalt, le magnésium, le manganèse et des cations; le cation manganèse fonctionne bien sur une variété de tissus, y compris le muscle squelettique, le système nerveux tissUES, le foie, la peau et les os.
   3. Pour un contrôle positif, ajouter DNase (étiqueté «nucléase" dans le kit) à l'étiquetage mélange TdT. Alternativement, pré-traiter une section de contrôle positif à la DNase dans un tampon de nucléase pendant 1 heure à 37 ° C, selon les instructions du kit. Conserver la solution de DNase et les articles de DNase traité loin des autres sections expérimentales pour prévenir la contamination croisée.
   4. Pour un contrôle négatif, omettre TdT enzyme de la composition de l'étiquetage.
   5. Utiliser un laboratoire pour effacer d'un tampon d'étiquetage autant TdT de la diapositive que possible. Pipette TdT étiquetage mélange sur la lame (50 pi par section), couvrir avec un nouveau rectangle de parafilm et incuber dans la chambre d'humidité à 37 ° C pendant 1 heure.
   6. Suivez les instructions du kit pour faire tampon d'arrêt 1x. Utilisez un laboratoire pour effacer d'TdT étiquetage mélange de la diapositive, et ajouter 200-300 tampon d'arrêt ul pour couvrir la section de tissu et incuber dans la chambre de l'humidité pendant 5 min. Al variante, immerger la lame dans du tampon d'arrêt dans une jarre de Coplin.
   7. Laver la glissière 2 x 2 min dans du PBS. Utiliser un laboratoire pour effacer d'autant PBS de la diapositive que possible.
5. Le marquage fluorescent
   1. Suivez les instructions du kit pour préparer une solution d'étiquetage pour étiqueter fluorescéine dNTP au cassures de l'ADN. solution de pipette sur la lame (50 ul par section), couvrir avec un nouveau rectangle de parafilm, et incuber dans la chambre humide pendant 20 minutes.
   2. Laver la lame pendant 2 min dans du PBS dans une jarre de Coplin. Utiliser un laboratoire pour effacer d'autant PBS que possible de la diapositive.
   3. Diluer Hoechst 33258 colorant nucléaire à 1 pg / ml dans PBS et la pipette sur la lame (100-200 pi est suffisant pour couvrir la section). Incuber dans la chambre humide pendant 5 min.
   4. Laver 3x pendant 5 min dans du PBS.
   5. Lamelle avec Antifade milieux de montage de fluorescence et de sceller les bords avec du vernis à ongles.

jove_title "> 5 Acquisition d'images numériques.

1. Acquérir des images en utilisant un microscope à fluorescence conventionnelle avec DAPI, FITC, et des filtres rouge Texas (ou équivalent). Utilisation d'un objectif de grossissement supérieur (20X ou 40X) pour vérifier que l'étiquette a été un succès et noyaux (intacts ou fragmentées) ont été marquées. Un objectif 10X est suffisante pour la quantification des points lacrymaux TUNEL positif.
2. Recueillir des images de la coloration Hoechst, coloration TUNEL, et le signal de autofluorescente que trois canaux en fausses couleurs distinctes combinées en une seule image. Si l'étiquette de fluorophore TUNEL est vert, le signal image autofluorescente dans le filtre rouge, et vice versa.
   1. Conservez tous les paramètres d'imagerie équivalent entre les diapositives pour seuil et la quantification ultérieure. Pour chaque filtre, des heures prédéfinies et d'exposition d'enregistrement, le gain et binning (pas binning est le meilleur); ne pas utiliser les réglages d'exposition ou de gain automatique.
   2. Utilisez essais et erreurs pour trouver exposition et de gain paramètres qui répondra le mieux capturer la gamme de intensités dans toutes les lames colorées. Assurez-vous qu'il n'y a pas pixels saturés dans les images acquises, que cette volonté biais quantification.
3. Prenez des photos du groupe d'intérêt musculaire entière. Cela peut nécessiter plusieurs images à "cousu" ensemble.

Analyse 6. Image

1. Utilisez disponibles dans le commerce des programmes d'analyse d'images pour analyser les images numériques de coloration TUNEL. Analyse utilisant un logiciel commercial est montré ici. Alternativement, le ImageJ du logiciel libre du NIH peut être utilisé pour analyser la coloration TUNEL.
2. Colorer une section adjacente à la section de TUNEL-colorées à l'hématoxyline et de l'éosine (H & E) et prendre une image numérique à pleine section avec un microscope à fond clair conventionnel. Utilisez cette image H & E en combinaison avec un atlas d'anatomie ^5,18,19 pour tracer les structures anatomiques être quantifiés.
3. Avec le canal TUNEL éteint, tracer manuellement le contour de la zone à quantifier, en utilisantHoechst et canaux de autofluorescence d'orientation. Convertir la zone tracée dans un masque (un ensemble de pixel sélectionné coordonne à analyser).
4. Tournez sur le canal TUNEL. Utilisation de la fonction d'un seuil d'intensité dans le programme d'analyse d'image, réglez le seuil inférieur à exclure tous les signaux d'autofluorescence.
5. Appliquer les mêmes paramètres de seuil pour toutes les images dans l'ensemble de l'étude. Convertir sélections seuillées en masques.
6. Pour chaque image, mélanger le masque de zone du muscle et le masque TUNEL. Le nouveau masque de combinaison représentera le signal TUNEL dans la zone musculaire tracée seulement.
7. Effectuer quantification masque sur le masque de combinaison pour déterminer le nombre d'objets et de la zone du signal TUNEL dans la zone musculaire tracé opposer. Effectuez cette aide de la fonction analyseur de particules dans ImageJ.

Résultats

Avec coloration réussie, signal de TUNEL positif doit être assez brillant pour isoler autofluorescence en fixant des seuils d'intensité. Objets TUNEL-positives à faible grossissement peuvent apparaître fragments irréguliers brillants dans le muscle squelettique (Figure 1A). Toutefois, à plus fort grossissement, certains objets TUNEL positif avec la morphologie apoptotique classique doivent être respectées, si le type de mort cellulaire impliquée est l'apoptose (figure 1B). Le contrôle p...

Discussion

Une méthode pour détecter et analyser quantitativement dommages à l'ADN associée apoptose dans le muscle squelettique de souris est décrit. La procédure comprend la récolte des tissus, coloration TUNEL, l'acquisition d'image numérique, et l'analyse d'image. Fournitures et des outils histologiques communes sont nécessaires, et un kit spécial commerciale TUNEL est nécessaire. Les grands éléments essentiels de l'équipement nécessaires sont un cryostat, un microscope à épifluorescence avec une capaci...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
4 % Paraformaldéhyde dans une solution saline tamponnée au phosphate	Microscopie électronique Sciences	19202	Pour les procédures décrites ici, une solution à 4 % a été préparée fraîche à partir de poudre. Le paraformaldéhyde de n’importe quel fournisseur peut être utilisé. La solution de formaldéhyde préparée doit être conservée à 4 ° ; C et ne doit pas être utilisé après sa date de péremption (jusqu’à plusieurs mois). Le paraformaldéhyde est un cancérigène et une toxine par inhalation et par contact avec la peau. Veuillez suivre les précautions spécifiées dans la fiche signalétique lors de la manipulation du paraformaldéhyde.
Saccharose	Sigma	S0389	Utilisé pour la cryoprotection des tissus avant la congélation. Le saccharose de n’importe quel fournisseur peut être utilisé.
Composé O.C.T.	Tissue-Tek	4583	Milieu d’enrobage pour la cryosection.
Cryostat	Leica	CM 3050S	Un cryostat Leica CM3050S a été utilisé pour les préparations décrites ici. Tout cryostat capable de couper 10 &mu ; Des sections M peuvent être utilisées.
Diapositives en verre, 25 x 75 x 1 mm	Fisher	12-552-3	Des diapositives de n’importe quel fournisseur peuvent être utilisées.
Gélatine	Sigma	G-9391	La gélatine est utilisée pour favoriser l’adhérence des sections tissulaires aux lames de verre. Pour enduire les lames de verre de gélatine, dissoudre 2,75 g de gélatine et 0,275 g d’alun chromé dans 500 ml d’eau distillée, tiède à 60 °C C, trempez les lames pendant plusieurs secondes et laissez sécher. La gélatine de n’importe quel fournisseur peut être utilisée. Des lames pré-revêtues de gélatine peuvent également être achetées.
Sulfate de potassium de chrome (III) dodécahydrate (alun de chrome)	Sigma	243361	L’alun de chrome est ajouté à une solution de gélatine pour favoriser l’adhérence tissulaire sur les lames de verre. C’est un cancérogène possible et une toxine par inhalation et contact cutané. Veuillez suivre les précautions spécifiées dans la fiche signalétique lors de la manipulation de l’alun chromé.
Réactif d’adhérence tissulaire Vectabond	Vector Labs	SP-1800	Substrat en option pour une meilleure adhérence tissulaire aux lames de verre ; des lames recouvertes de gélatine peuvent être utilisées à la place.
Tween20	Sigma	P9416	Un détergent utilisé pour perméabiliser les tissus. Tween20 de n’importe quel fournisseur peut être utilisé.
Triton X100	Sigma	T8787	Un détergent utilisé pour perméabiliser les tissus. Triton X100 de n’importe quel fournisseur peut être utilisé.
TACS 2 TdT fluorescéine in situ kit de détection de l’apoptose	Trevigen	4812-30-K	Kit commercial pour le marquage TUNEL basé sur la fluorescence.
DNase/nucléase	Trevigen	4812-30-K	(inclus avec le kit)
DNase/nucléase	tampon Trevigen	4812-30-K	(inclus avec le kit)
10x solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4	Amresco	780	Make 1x PBS pour les lavages et les dilutions. Les PBS de n’importe quel fournisseur peuvent être utilisés.
Eau sans DNase	Qualité Produits biologiques	351-029-131	L’eau de n’importe quel fournisseur peut être utilisée.
Hoechst 33258	Sigma	94403	Colorant nucléaire. Tout colorant nucléaire fluorescent bleu peut être utilisé. En tant que colorant de liaison à l’ADN, Hoechst est un cancérogène suspecté et doit être manipulé avec un équipement de protection pour minimiser le contact avec la peau.
Parafilm M multiple		807	Tout autre film hydrophobe ou lamelle de recouvrement peut être utilisé. Disponible auprès de plusieurs fournisseurs.
Microscope fluorescent avec appareil photo numérique	;--	;--	Tout microscope fluorescent capable de capturer numériquement la fluorescence rouge, verte et bleue dans des canaux séparés peut être utilisé.
Les supports anti-fondu Vectashield	Vector Labs	H-1000	peuvent être utilisés auprès de n’importe quel fournisseur.
lamelles en verre, épaisseur n° 1	Brain Research Labs	2222-1	Des lamelles de protection de n’importe quel fournisseur peuvent être utilisées. La plus petite taille de 22 x 22 mm est suffisante pour les sections de pattes de souris néonatales.
Vernis à ongles	Ted Pella	114-8	Utilisé pour sceller les lamelles. Il est possible d’utiliser du vernis à ongles de n’importe quel fournisseur (y compris les détaillants habituels). Évitez d’utiliser du vernis à ongles avec de la couleur ou des additifs qui peuvent refléter la lumière pendant l’imagerie fluorescente.