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Article de méthode

Évaluation de la viabilité de la graisse humaine injection dans des souris nude avec Micro-tomodensitométrie

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DOI :

10.3791/52217

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7 janvier 2015

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1Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine, Department of Surgery, Plastic and Reconstructive Surgery Division, Stanford University School of Medicine, 2Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

La greffe de graisse est une technique essentielle pour reconstruire les déficits des tissus mous. Cependant, il s’agit d’une procédure imprévisible caractérisée par une survie variable du greffon. Notre objectif était de concevoir un modèle de souris qui utilise une nouvelle méthode d’imagerie pour comparer la rétention de volume entre différentes techniques de préparation et d’administration de greffes de graisse.

Résumé

Lipotransfer est un outil essentiel dans l'arsenal du chirurgien pour le traitement des déficits de tissu mou dans le corps. La graisse est la charge idéale des tissus mous car il est facilement disponible, facile à obtenir, peu coûteux, et intrinsèquement biocompatible. 1 Toutefois, malgré sa popularité en plein essor, la greffe de graisse est entravée par des résultats imprévisibles et la survie du greffon variable, taux de rétention publiés variant entre 10 -80%. 3/1

Pour faciliter les enquêtes sur la greffe de graisse, nous avons donc mis au point un modèle animal qui permet une analyse en temps réel de la rétention de volume graisse injectée. En bref, une petite incision est faite dans le cuir chevelu d'une souris CD-1 nu et 200 à 400 ul de lipoaspirat traité est placé sur le crâne. Le cuir chevelu est choisi comme site receveur en raison de son absence de graisse sous-cutanée d'origine, et en raison de l'excellent contraste de fond fourni par le calvarium, qui aide àle processus d'analyse. Tomographie micro-ordinateur (micro-CT) est utilisé pour balayer la greffe au départ et toutes les deux semaines par la suite. Les images TDM sont reconstruits, et un logiciel d'imagerie est utilisé pour quantifier les volumes greffés.

Traditionnellement, les techniques pour évaluer le volume de greffe de graisse ont nécessité euthanasier l'animal d'étude pour fournir simplement une évaluation unique de poids de greffe et le volume par mesure physique ex vivo. Comparaisons biochimiques et histologiques ont également requis l'animal d'étude pour être euthanasié. Cette technique d'imagerie décrit offre l'avantage de visualiser et de quantifier objectivement volume à de multiples points de temps après la greffe initiale sans avoir à sacrifier l'animal de l'étude. Cette technique est limitée par la taille de la greffe pouvant être injecté comme les greffes de peau plus grands risques et nécrose de graisse. Cette méthode a une utilité pour toutes les études évaluant la viabilité de la greffe de graisse et la rétention de volume. Il est particulièrement bien adapté à providing une représentation visuelle de greffe de graisse et à la suite des changements de volume au fil du temps.

Introduction

Les défauts des tissus mous résultent de diverses causes, notamment les traumatismes, la résection tumorale, le vieillissement et l’anomalie congénitale. Ils peuvent être débilitants pour les patients et représentent l’un des problèmes les plus courants, mais aussi les plus difficiles pour les chirurgiens reconstructeurs. De nombreuses méthodes existent pour traiter les carences des tissus mous, telles que les lambeaux locaux et libres, les injections de collagène et les charges synthétiques. 4-8 Cependant, depuis sa première utilisation documentée par Neuber en 18931, le transfert de graisse autologue reste l’étalon-or pour la réparation des déficits des tissus mous, car il est prêt à l’emploi, facile et sûr à récolter, et naturellement compatible. 1,2

Malgré ces avantages, les greffes de graisse autologues souffrent d’une survie imprévisible et variable, avec des taux de rétention variant de 10 à 80 % au fil du temps. 1-3,9 Afin de tenir compte de cette perte de volume et de symétrie attendue, les chirurgiens doivent souvent surcorriger lors du remplissage des défauts des tissus mous ou effectuer plusieurs procédures de suivi.

Les lits de greffe mal vascularisés sont en partie responsables de cette résorption tissulaire. De plus, l’absence d’une méthode d’analyse comparative pour comparer la survie des greffons peut également contribuer à l’incohérence des résultats rapportés. Une méthode précise de mesure du volume du greffon réduirait l’erreur de mesure lors de l’évaluation des taux de rétention. Cela aiderait les chercheurs à identifier plus précisément les facteurs causaux qui affectent la survie des greffons. Bien que de nombreux modèles animaux de laboratoire aient facilité l’évaluation quantitative et qualitative de la survie des greffes de graisse humaines, la plupart sont basés sur des moyens histologiques et biochimiques et nécessitent le sacrifice de l’animal à l’étude pour obtenir une seule mesure. 3,10-12 Peu de choses ont été rapportées sur l’utilisation de techniques d’imagerie pour dénombrer la rétention du volume du greffon graisseux in vivo.

Une poignée d’études cliniques ont montré des techniques de mesure plus efficaces utilisant l’imagerie. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) a été utilisée par Hörl et al. pour mesurer la survie des greffes de graisse13, et la TDM a été utilisée par Har-Shai et al. et Fontdevila et al. dans leurs analyses de la rétention de volume après greffe chez les patients atteints du VIH. 14,15 À l’aide d’un logiciel d’imagerie tridimensionnelle (3D), Meier et al. Rétention de volume mesurée chez l’homme après greffe de graisse autologue en comparant les images de la période préopératoire et postopératoire. 16

Pourtant, une méthode standardisée utilisant l’imagerie pour mesurer la survie des greffes de graisse fait défaut dans la recherche scientifique fondamentale. Une approche d’imagerie à haute résolution pour évaluer les volumes des greffes de graisse permettrait non seulement des mesures de volume précises et reproductibles, mais aussi des mesures répétées permettant de visualiser l’évolution de la survie des greffes de graisse en temps réel.

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Protocole

REMARQUE: Les protocoles expérimentaux et les formulaires de consentement des patients pour obtenir la graisse ont été examinés et approuvés par le Conseil de l'Université Stanford examen institutionnel (Protocole N ° 2188). Toutes les procédures d'animaux ont été approuvés par la commission administrative sur Stanford Laboratoire de protection des animaux (APLAC) en vertu du protocole # 9999. Toutes les expériences ont été menées dans le strict respect de la sécurité des animaux et des lignes directrices de soins humanitaires.

1. Fat récolte

  1. En utilisant la procédure Coleman 17-19, obtenir des tissus adipeux humain de l'abdomen, le flanc, et / ou les régions de la cuisse de patients sains de sexe féminin subissant la liposuccion élective.
  2. Pour traiter le lipoaspirat pour le greffage, commencer par permettre à la graisse de se contenter de 30 min.
  3. Lipoaspirat installe généralement en trois couches, avec de l'huile au sommet, en gras dans le milieu, et le sang au fond. Aspirer et jeter la couche d'huile supérieure et la couche de sang bas.
  4. Pour retirer davantage tout en restant tumescfluide ent ou des débris de cellules, Centrifugeuse la graisse pendant 5 min à 350 xg et 4 ° C, et aspirer la couche aqueuse inférieure.
  5. Calculer la quantité de graisse nécessaire pour le greffage, permettant 20% d'erreur de livraison, et de transférer le volume souhaité de la graisse à 50 ml conique (s). Multiplier par 400 le nombre de souris dans l'étude pour obtenir microlitres de graisse nécessaire pour le greffage.
  6. À ce stade, si la cellule effectuer assistée Lipotransfer 20,21, lieu volume de graisse pour le greffage sur la glace. Puis récolter les cellules stromales dérivées du tissu adipeux (CSA) de la graisse restante en utilisant la technique standard décrite par Zuk et al 22.

2. Fat greffage

  1. Obtenir femelle, homozygote souris CD-1 nue pour l'étude expérimentale. Choisissez souris entre 8-12 semaines d'âge.
  2. Pour induire une anesthésie, le lieu souris dans une boîte de knockdown avec le mélange isoflurane / oxygène de 2,5% à 2 L / min pendant environ 10 min. Se il vous plaît noter que ISOF recommandéelurane dose varie avec la souche de souris.
  3. Lorsque le taux de la souris de la respiration a ralenti, confirmer sédation adéquate avec une pincée d'orteil. Appliquer vétérinaire pommade ophtalmique lubrifiante pour les deux yeux de souris.
  4. Si la souris ne bronche pas en réponse à pincement de l'orteil, ce qui confirme un plan suffisante de l'anesthésie. Placez le nez de la souris dans une ogive prestation mélange isoflurane / oxygène de 2,5% à 1-2 L / min. Si la souris se rétracte de pincement de l'orteil, retourner à la boîte démontable et retest après 5 min.
  5. Mettre en place la souris sous champ stérile, puis stériliser cuir chevelu avec 2,5% de povidone-iode, suivie par une solution d'éthanol à 70%. Répéter deux autres fois.
  6. Placez draps chirurgicaux sur la souris et veiller à maintenir champ stérile. Instruments stériles, des gants et PPE devraient être utilisés à tout moment.
  7. Si le volume de graisse pour être greffé a été précédemment mis sur la glace, permettra la graisse d'abord se adapter à la température ambiante avant la livraison.
  8. Un backloading 1 ml seringue Luer-Lok avec 1 mlde matières grasses.
  9. Raccorder une 14 G, 8 cm de long canule graisse greffage à l'extrémité de la seringue.
  10. Premier système en appuyant sur le piston de la seringue jusqu'à ce que entre 200 et 400 ul de graisse reste dans la seringue. Tout en appuyant sur le piston de la seringue confirmer que la canule est entièrement rempli avec de la graisse par l'observation de la graisse sortant du trou de la canule distale.
  11. En utilisant des pinces fines, soulever la peau du dos sur la ligne médiane recouvrant la caudale aspect le plus du crâne. Faire un 1,5 mm, découpées dans la peau à l'aide de ciseaux fins.
  12. Placez une seule suture 6-0 de nylon dans milieu de la coupe qui sera ensuite utilisé pour amener bords de la plaie ensemble après greffage est effectué. Ne pas attacher la suture.
  13. Créer une poche sous-cutanée sur le crâne en insérant la canule à travers l'incision de la peau et passer la canule avant en arrière dans un motif en forme d'éventail sur le crâne pour libérer les pièces jointes du tissu conjonctif de la peau sus-jacente.
  14. Une fois que la poche a été créée, placez le cAnnula sur la ligne médiane de la souris directement sur le crâne jusqu'à ce que la pointe se trouve au-rostrale aspect le plus de la poche qui devrait être juste derrière une ligne tracée entre les yeux. (Figure 1A)
  15. Injecter lentement la graisse de façon rétrograde, avancer le plongeur tout en tirant la canule arrière. En utilisant des pinces, amener les bords de la plaie ensemble et les soulever pour garder toute la graisse de se échapper de la poche.
  16. Attachez le fil de suture qui a été précédemment placé, se assurer que le premier nœud se trouve légèrement contre la peau. Attachez trois autres noeuds carrés et couper le fil de suture avec une queue de 3 mm. (Figure 1B)
  17. Confirmez avec la visualisation et la palpation manuelle que la poche ne est pas surchargé et la peau recouvrant la poche ne est pas tendue. Si la poche a été trop rempli, couper la suture et enlever tout le gras de l'intérieur de la poche. Laver la poche avec tampon phosphate salin (PBS) pH 7,4 et réinjecter un plus petit volume de graisse.
  18. Retirer la souris à partir d'unenesthesia et lieu sur le dos ou sur le côté dans une cage propre par lui-même. Surveiller l'animal pour la respiration régulière, les mouvements normaux, absence de saignements, et des signes de douleur ou de détresse. Administrer la buprénorphine à 0,1 mg / kg par voie sous cutanée toutes les 6 h jusqu'à 48 h si l'animal est dans la douleur.
  19. Assurez-vous que l'animal est réveillé suffisamment pour maintenir décubitus sternal avant de le laisser sans surveillance. Ne pas placer l'animal dans une cage avec les autres animaux jusqu'à ce qu'il ait totalement récupéré.
  20. Après 4 heures, se assurer que l'animal est capable de manger et de boire, de déplacer et de respirer normalement et qu'il n'y a pas de saignement du site opératoire. Retournez à l'établissement de soins des animaux.

3. Micro-CT

  1. Souris Scan for volume de base par jour post-opératoire 3, puis répéter les analyses aux semaines post-opératoires 2, 4, 6 et 8.
  2. Lorsque l'imagerie de la souris à chaque point de temps, suivre les directives de sédation et de soins des animaux avant et après la procédure comme indiqué précédemment dans S02.02 à 02.04 et de 02.17 à 02.19 Teps.
  3. Effectuer des analyses sur un scanner micro-CT avec une taille de voxel la reconstruction de 100 um ou mieux.
  4. Avec un pic kilovoltage rayons X de 80 kVp et un courant anodique de 450 uA, administrer une dose d'environ 5 ration centiGy pendant un balayage de 9 min à chaque souris. Se il vous plaît noter que ces valeurs varient en fonction du protocole de balayage.
  5. Avant de procéder à la première analyse, calibrer micro-CT avec un fantôme d'imagerie qui distingue entre l'air, l'eau, et l'intensité de l'os.
  6. Placez quatre souris dans scanner dans la position ventrale avec deux souris sur le dessus et deux sur le fond. Un lit de balayage peut facilement être construit en utilisant 60 ml seringues pour maintenir le corps de la souris et de 10 ml seringues que des cônes de nez 23.
  7. Maintenir souris sous anesthésie avec un mélange isoflurane / oxygène de 2,5% à 1-2 L par minute.
  8. Confirmez image dépisteur que l'ensemble du crâne de la souris, du nez à la première vertèbre cervicale, et du haut du crâne à la base du skull, sera imagé.

4. Analyse Micro-CT

  1. Ouvrez les images reconstruites avec un logiciel de micro-imagerie CT analyse qui permet la création de régions d'intérêt (ROI) en sélectionnant voxels en utilisant des seuils pour l'intensité de pixel. Le logiciel permet également la création de surfaces 3D par l'interpolation des voxels sélectionnés, et pour l'analyse du volume.
  2. Commencez par charger les images tomodensitométriques reconstruites en deux dimensions (2D) coronale, axiale, et une vue sagittale. (Figure 2A)
  3. Utilisation de la coupe axiale comme un guide, accédez à la coupe sagittale qui correspond à l'aspect le plus à gauche de la greffe de graisse. Sélectionner un seuil supérieur et inférieur pour l'intensité du pixel qui saisit tous les voxels correspondant à la greffe de graisse, mais qui exclut le tissu et l'os environnant. (Figure 2B)
  4. Définir un retour sur investissement dans la vue sagittale qui correspond à la greffe de graisse à l'aide de seuils d'intensité de pixel précédemment définies. REPEAT cette procédure chaque cinquième coupe sagittale, la navigation jusqu'à la plus à droite aspect du greffon est atteint. (Figure 2C)
  5. Interpole voxels sélectionnés de tous 2D ROI en une seule, combinée ROI 3D. (Figure 2D)
  6. Volume de ROI enregistrement calculée par le logiciel.
  7. Rendre l'isosurface 3D pour visualiser le volume final de greffe de graisse. (Figure 2E)
  8. Dans les analyses ultérieures, être sûr de garder le maximum d'intensité de pixel et les valeurs de seuil minimum les mêmes que ceux utilisés pour l'analyse de base.

5. Fat récolte

  1. Après les souris ont été numérisés pour la semaine 8 24,25 point de temps, anesthésier les souris comme décrit précédemment ci-dessus dans les étapes 2.2 à 2.4 et 2.17 à 2.19.
  2. Conformément aux lignes directrices de l'APLAC, euthanasier les souris en séparant leurs colonnes vertébrales.
  3. Placez la souris dans le champ opératoire. Avec des ciseaux de ténotomie, ouvrir soigneusement la poche et disséquer til recouvrant la peau et les pièces jointes du tissu conjonctif de la greffe de graisse.
  4. À ce stade, il peut aider à exciser un patch de la peau recouvrant dorsale pour faciliter l'extraction de la greffe. (Figure 3A)
  5. Maintenir légèrement traction sur la greffe avec une pince et tournez la greffe d'un côté à l'autre pour visualiser les points successifs de tension qui doivent être libérés avec des ciseaux.
  6. Rester aussi près que possible du greffon lors de l'excision de minimiser le tissu conjonctif prise avec le greffon. (Figure 3B)
  7. Après excision greffe, mesurer la masse sur une échelle taré qui est une précision d'au moins 0,01 grammes.
  8. Calculer le volume de la greffe de graisse en utilisant la valeur mesurée de masse et la densité moyenne de la graisse humaine (0,9 g / ml) en tant que taux de conversion.
  9. Comparer volume calculé de greffe de graisse à celle obtenue à l'aide de micro-CT.
  10. Greffe de graisse peuvent être traitées pour l'histologie ou une analyse plus approfondie si nécessaire.

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Résultats

Greffe de graisse progressivement diminué en volume sur le cours de l'étude, résultant de la survie moyenne de 62,2% par semaine 8. (figure 4A) 24 À la fin de l'analyse Semaine 8, chaque greffe de graisse a été extrait en une seule pièce. Un test rang Wilcoxan somme a été utilisée pour comparer la différence entre les mesures de volume de greffe de graisse obtenus soit par micro-CT ou calculées de la masse physique. Aucune différence significative n'a été observée entre ces deux méthodes ...

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Discussion

Jusqu'à ce point, la plupart des chercheurs se sont appuyés sur les modalités non-imagerie pour quantifier la survie à long terme de la greffe de graisse, mais ces méthodes nécessitent le sacrifice de l'animal de l'étude et produire une seule mesure. 3,10-12 Notre étude représente une méthode d'analyse qui permet une meilleure objectif, la quantification en temps réel de la survie du greffon de graisse dans un modèle de souris.

Critique dans ce processus est de se ...

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Déclarations de divulgation

Aucun des auteurs n’a d’intérêt financier concurrent à signaler.

Remerciements

Cette étude a été soutenue par la Fondation Oak, le Laboratoire Hagey for Pediatric médecine régénérative, et l'Institut national de la santé, subventions NIHR21DE019274, NIHR01DE019434, NIHR01DE021683 et NIHU01HL099776 à MTLDCW a été soutenu par la bourse de recherche ACS Franklin H. Martin Faculté, le Hagey Laboratoire de médecine régénérative pédiatrique, et la Faculté Scholar Award Child Health Research Institute de l'Université de Stanford. Micro-CT a été menée au Centre de Stanford pour l'innovation en imagerie in vivo.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
à lipoaspiration
Beckman Coulter, Inc., Pasadena, CA
Tubes coniques de 50 mlBD Biosciences, San Jose, CA
Souris nues CD-1 (Crl :CD1-Foxn1nu)Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA
IsofluraneHenry Schein, Dublin, OH
2,5 % de bétadinePurdue Pharma, L.P., Stamford, CT
Solution d’éthanol à 70 %  ;Gold Shield, Hayward, CA
Seringue luer-lock 1ccBD Biosciences, San Jose, CA
Canule de calibre 14Shippert Medical, Centennial, CO
ForcepsFine Science Tools, Heidelberg, Allemagne
Ciseaux de ténotomieFine Science Tools, Heidelberg, Allemagne
Suture en nylon 6-0Ethicon, Blue Ash, OH
Saline tamponnée au phosphateGibco, Carlsbad, CA
microscope micro-CT  ;Siemens Healthcare, Pleasanton, Californie
Phantom  ;TriFoil Imaging, Northridge, CA
Logiciel d’analyse d’imagerieIRW, Siemens Healthcare, Pleasanton, CA
Scale  ;Mettler-Toledo International, Inc., Columbus, OH
Centrifugeuse SAL

Références

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