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Évaluation de l'impact de l'exposition répétée de organotypiques 3D bronchiques et nasales Tissue Culture modèles Whole fumée de cigarette

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DOI :

10.3791/52325

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12 février 2015

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1Biological Systems Research, Philip Morris International R&D, Philip Morris Products S.A.

Dans cet article

Résumé

L’objectif de ce protocole est d’exposer des modèles de tissus bronchiques et nasaux organotypiques humains en 3D à la fumée de cigarette principale (CS) à l’interface air-liquide. L’impact de la CS sur les tissus est ensuite étudié à l’aide d’un test d’activité du cytochrome P450, d’une mesure du battement des cils et d’une approche de biologie des systèmes.

Résumé

La fumée de cigarette (CS) a un impact majeur sur la biologie pulmonaire et peut entraîner le développement de maladies pulmonaires telles que la bronchopneumopathie chronique obstructive ou le cancer du poumon. Pour comprendre les mécanismes sous-jacents du développement de la maladie, il serait important d’examiner l’impact de l’exposition au CS directement sur les tissus pulmonaires. Cependant, cette approche est difficile à mettre en œuvre dans les études épidémiologiques car le prélèvement de tissus pulmonaires est complexe et invasif. Par ailleurs, les modèles de culture tissulaire peuvent faciliter l’évaluation des impacts de l’exposition sur le tissu pulmonaire. Les cultures de cellules 2D submergées, telles que les cultures de cellules épithéliales bronchiques humaines normales (NHBE), ont traditionnellement été utilisées à cette fin. Cependant, ils ne peuvent pas être exposés directement à la fumée de la même manière que dans le cas d’une exposition in vivo. Les modèles de culture tissulaire 3D récemment développés reflètent mieux la situation in vivo car ils peuvent être cultivés à l’interface air-liquide (ALI). Leurs faces basales sont immergées dans le milieu de culture ; tandis que leurs côtés apicaux sont exposés à l’air. De plus, les cultures de tissus organotypiques qui contiennent différents types de cellules représentent mieux la physiologie du tissu in vivo. Dans ce travail, l’utilisation d’un système d’exposition in vitro pour exposer des modèles de tissus bronchiques et nasaux organotypiques humains à la CS grand public est démontrée. La fréquence des battements ciliaires et l’activité du cytochrome P450s (CYP) 1A1/1B1 ont été mesurées pour évaluer les impacts fonctionnels du CS sur les tissus. De plus, afin d’examiner les altérations induites par la CS au niveau moléculaire, des profils d’expression génique ont été générés à partir des tissus après l’exposition. Une légère augmentation de l’activité du CYP1A1/1B1 a été observée dans les tissus exposés au CS par rapport aux tissus exposés à l’air. Une approche de biologie des systèmes basée sur le réseau et la transcriptomique était suffisamment robuste pour démontrer des altérations du métabolisme xénobiotique induites par la CS qui étaient similaires à celles observées dans les cellules épithéliales bronchiques et nasales obtenues chez les fumeurs.

Introduction

Les poumons sont exposés directement et constamment à de l’air inhalé qui peut contenir divers toxiques tels que des polluants et des constituants de la fumée de cigarette (CS). L’étude de l’impact de l’exposition à ces substances toxiques sur les tissus respiratoires est plus informative lorsqu’elle est effectuée d’une manière qui ressemble à une exposition in vivo. Par rapport aux cultures cellulaires immergées 2D classiques (par exemple, les cellules épithéliales bronchiques humaines normales (NHBE)), les modèles de tissus organotypiques 3D récapitulent mieux les aspects morphologiques, physiologiques et moléculaires de l’épithélium des voies respiratoires humaines in vivo1,2 : les modèles de tissus 3D contiennent la diversité des types de cellules observés in vivo, y compris les cellules épithéliales différenciées, les cellules ciliées et non ciliées, les cellules caliciformes et les cellules basales. Ils ont des jonctions serrées fonctionnelles et présentent un phénotype mucociliaire 1-3. De plus, les cultures peuvent être cultivées sur une membrane poreuse perméable, dans une interface air-liquide, permettant une exposition directe à l’aérosol du côté apical (alors que le côté basolatéral est immergé dans le milieu de culture) 3-5. Dvorak et ses collègues ont rapporté que les profils d’expression génique des modèles de tissus bronchiques étaient similaires à ceux obtenus à partir de brossages bronchiques humains 3. De plus, Mathis et ses collègues ont montré que les réponses de ces modèles tissulaires à la CS étaient similaires aux différences observées entre les cellules épithéliales bronchiques obtenues chez les fumeurs et les cellules obtenues chez les non-fumeurs 6. Enfin, étant donné que les modèles de tissus bronchiques pourraient être cultivés pendant plusieurs mois 4,5, ils pourraient potentiellement être utilisés pour examiner les effets d’une exposition à long terme des éléments testés.

Les évaluations de cytotoxicité sont des paramètres courants mesurés à la suite d’agressions chimiques ou pour évaluer la toxicité de composés ou de mélanges spécifiques. Par exemple, l’intégrité de la membrane peut être mesurée par un dosage luminescent et permet de mesurer un effet cytotoxique dose-dépendant sur la culture cellulaire 7. Cependant, pour évaluer les effets physiopathologiques des composés à des concentrations subtoxiques, d’autres paramètres doivent être mesurés. Par exemple, l’intégrité tissulaire déterminée à l’aide du test de résistance électrique transépithéliale (TEER) garantit la fonctionnalité des jonctions serrées et surveille la perturbation de la couche épithéliale 8,9. La fréquence des battements ciliaires permet également de mesurer les effets liés à la CS sur les tissus respiratoires. Une fréquence de battement normale pour la muqueuse des cils bordant les voies respiratoires supérieures et inférieures est importante pour se protéger contre les infections des voies respiratoires 10. Chacune des cellules épithéliales cylindriques ciliées de l’épithélium respiratoire a 200 à 300 cils battant à une fréquence particulière pour éliminer les agents infectieux ou les particules inhalées piégées dans le mucus libérées par les cellules caliciformes intercalées 11. Le CS contient des produits chimiques qui peuvent inhiber le battement ciliaire 12, ce qui réduit la protection des voies respiratoires. Ce travail montre que le battement ciliaire peut être mesuré dans des modèles de tissus organotypiques. Cette approche permet d’évaluer si les cellules épithéliales présentent leur fonction normale dans la culture de tissus organotypiques. Le CS active également les réponses métaboliques xénobiotiques dans les voies respiratoires pour métaboliser les constituants de la fumée de tabac 13. L’activité des enzymes métaboliques xénobiotiques de phase I, CYP1A1 et CYP1B1, des modèles tissulaires peut être mesurée. De plus, comme indiqué précédemment, l’expression génique globale peut être mesurée dans les modèles de tissus bronchiques organotypiques 6,14,15. Une approche de données transcriptomiques et de biologie des systèmes basée sur un réseau est exploitée pour évaluer l’impact de la CS sur le métabolisme xénobiotique 15.

Les méthodologies utilisées pour exposer des modèles de tissus bronchiques et nasaux organotypiques 3D à la CS grand public à l’aide d’un système d’exposition in vitro et pour mesurer les réponses tissulaires à cette exposition par rapport à l’exposition à l’air frais (contrôle) sont détaillées ici.

Protocole

1. Culture du tissu bronchique organotypiques Culture Modèle

Remarque: les modèles de tissus reconstitués ont été achetées que des inserts qui sont prêts à utiliser. En variante, la culture peut être développée à partir de cellules primaires comme décrit par exemple par 16 Karp et al. Suite à la réception des tissus sous emballage stérile, toujours gérer les tissus organotypiques humains dans des conditions stériles.

  1. Ajouter 0,7 ml de pré-chauffé (37 ° C) du milieu d'essai dans chaque puits d'une nouvelle plaque de 24 puits stérile sous le capot.
  2. Retirer l'emballage des tissus sous le capot, et de transférer les inserts de culture de tissu à la nouvelle plaque à 24 puits préparée (décrit à l'étape 1.1. Ci-dessus).
  3. Maintenir et la culture des tissus dans un incubateur à 37 ° C (5% de CO 2, 90% d'humidité).
  4. Remplacez le milieu tous les deux jours.
  5. Lors d'un changement de milieu, examiner les tissus sous un microscope optique pour se assurer qu'ils sont contaminatisur-libre et qu'il n'y ait pas de fuite de milieu.

2. La fumée de cigarette (CS) exposition en utilisant un système in vitro de l'exposition

  1. Trois jours avant les expériences d'exposition, laver le côté apical de la culture de tissus avec 200 ul de milieu de culture.
  2. Le jour de l'exposition, si la mesure de battement ciliaire est prévu avant l'exposition, manipuler les tissus pour la mesure ciliaire battant comme décrit dans l'article 3.
  3. Préchauffer la chambre climatique vitro du système d'exposition et dans le module de base de culture à 37 ° C. Remplissez le module de base de culture avec 17,5 ml de milieu par rangée.
  4. Retirer les tissus de l'incubateur et de les placer sous le capot pour transférer les inserts de culture de tissu à partir de la plaque de culture sur le module de base de la culture in vitro en système d'exposition. En outre, couvrir le module de base de la culture avec un couvercle en verre.
  5. Transférez les tissus dans la chambre climatique de l'exposition vitro syste dansm pour une exposition à intégrer CS.
  6. Si le système d'exposition in vitro en est équipée d'une microbalance, mise en place de la microbalance à cristal de quartz avant l'exécution de l'exposition à mesurer le dépôt de la fumée particulaire en temps réel sur un cristal de quartz à l'aide du logiciel de microbalance.
    1. Remplacez les cristaux dans les modules de microbalance connectés à chaque ligne du système de dilution / distribution.
    2. Connecter le module de microbalance au logiciel de microbalance. Réglez l'échelle de la mesure à zéro dans le logiciel.
  7. Exposer les tissus selon le mode opératoire expérimental (par ex., Comme dans la figure 1)
    Note: Avant l'exposition, les cigarettes de référence (3R4F) sont conditionnés entre 7 et 21 jours dans des conditions contrôlées à 22 ± 1 ° C et une humidité relative de 60 ± 3% selon la norme ISO 3402 17.
    1. Générer de la fumée de cigarette (par ex., À partir 3R4F cigarettes) en utilisant un 30 ports carrousel fumer machine selon le régime intense Santé Canada: Je fume les cigarettes à un longueur de mégot standard, ce est à dire, environ 35 mm à 55 ml bouffée plus de 2 secondes, deux fois par minute et 8 secondes de temps pompe d'évacuation.
      Remarque: Si nécessaire, diluer le courant CS sorte que la dose ne est pas trop toxique. Dans les résultats rapportés ici, la fumée est diluée à 16% (vol / vol).
    2. Utilisez 60% d'air humidifié pour les échantillons de contrôle (air-exposé).
    3. Exposer les tissus pour les 6-7 min (ie., Une cigarette ou exposées à l'air) dans le système in vitro de l'exposition dans
    4. Mettez les tissus dans l'incubateur à 37 ° C (5% de CO 2, 90% d'humidité) pendant 1 heure.
    5. Répétez les étapes 2.7.3 et 2.7.4 de trois fois plus.
  8. A la fin de l'expérience d'exposition, arrêter le logiciel de microbalance. Le logiciel va générer un fichier contenant l'ensemble des mesures avec une représentation graphique de la déposition de particules.
  9. Transfert retour les tissus de la culture bModule ase de la plaque de culture. Placez les tissus dans l'incubateur à 37 ° C (5% de CO 2, 90% d'humidité) jusqu'à ce que les mesures pour les différents effets aux post-exposition points de temps spécifiques.

3. Mesure de battement ciliaire

Remarque: Conformément au plan expérimental (Figure 1), fiche ciliaire battant avant l'exposition et directement après l'exposition.

  1. Retirez les plaques de culture de tissus de l'incubateur et les laisser sous le capot à température ambiante pendant 30 min pour stabiliser le battement de cils.
  2. Placez les tissus au microscope optique lié au Logiciel CiliaMetrix.
  3. Enregistrer de la vidéo et la fréquence (en Hertz) du battement ciliaire. Mesurer la fréquence toutes les 3 secondes pendant 1 minute.
  4. Retourner les tissus de retour à l'incubateur à 37 ° C (5% de CO 2, 90% d'humidité).

4. résistance électrique transépithéliale (TEER) Mesure

Remarque: La mesure de la TEER est effectuée 3 jours avant et 48 heures après l'exposition sous la hotte dans des conditions stériles à l'aide de baguettes d'électrode (STX-2) reliée à une voltohmmeter.

  1. Ajouter 200 ul de milieu de culture à la surface apicale des tissus bronchiques humaines.
  2. Mettez la machine EVOMX; laver l'électrode avec une solution d'éthanol à 70%.
  3. Laver l'électrode avec le milieu de culture.
  4. Mesurer la résistance (Ω) par l'insertion de l'électrode dans le milieu sur le côté apical de la culture de tissu sans toucher le tissu.
  5. Répétez l'étape 4.4 cinq fois pour obtenir des mesures de cinq exemplaires.
  6. Après les mesures, retirez délicatement le support du côté apical des cultures de tissus à l'aide d'un aspirateur.
  7. Remettre les cultures de tissus à l'étuve à 37 ° C à (5% de CO2, 90% d'humidité) à la culture.

5. Le cytochrome P450 (CYP) 1A1 / 1B1 Activity

  1. Avant le début de l'étude, préparer le réactif de détection de luciférine en transférant la totalité du contenu du flacon de tampon de reconstitution approprié pour la bouteille ambre contenant le réactif de détection de luciférine (selon les instructions du fabricant). aliquotes de magasins de 2 ml à -20 ° C pour un maximum de 1 mois.
  2. Pour le moment post-exposition de 48 h, incuber les tissus pendant 48 heures après l'exposition CS à 37 ° C.
  3. Chauffer le réactif de détection Luciferin à TA.
  4. Incuber inserts de tissus pendant 3 heures ou O / N avec le substrat luciférine-CEE (dilué à 1:50) dans le milieu de culture de base.
  5. Transfert 50 pi de milieu de culture de chaque tissu insérer une plaque de luminomètre blanc opaque 96 puits à température ambiante.
  6. Ajouter 50 ul de réactif de détection de luciférine à chaque puits pour initier une réaction luminescente.
  7. Incuber la plaque à température ambiante pendant 20 min.
  8. Lire la luminescence en utilisant un luminomètre.
    Remarque: Pour laluminomètre, utiliser un temps d'intégration de 0,25 à 1 sec par puits comme une ligne directrice.

6. Extraction de l'ARN.

  1. Avant de recueillir inserts de tissus organotypiques 3D, préparer 1) une boîte avec de la glace sèche, 2) une quantité suffisante de lames (un par insert 3D), 3) PBS froid sans chlorure de calcium et le chlorure de magnésium, 4) une 25 ml pipette en verre, et 5 ) aiguilles de verre stériles pour l'aspiration.
    1. Identifier les tubes remplis de billes de céramique pour homogénéiser les échantillons cellulaires solides et ajouter 700 ul de QIAzol.
    2. Tournez sur la machine d'aspiration.
    3. Recueillir la plaque des inserts de tissus organotypiques 3D de l'incubateur.
    4. Laver chaque insert sur la plaque 3 fois avec du PBS froid. Entre les lavages, aspirer PBS avec l'aiguille en verre. Après le troisième lavage, aspirer avec du PBS et la plaque de couvercle pour éviter l'assèchement de l'insert.
    5. Pour chaque insert de la plaque, découpez la membrane d'insertion (sur lequel insert de tissu 3D réside) jusqu'à ce que le membrane se trouve à plat sur la lame.
    6. Transférer le tissu (avec la membrane d'insertion) de la lame sur le tube d'homogénéisation dûment étiquetés et visser le couvercle sur le tube, le secouer et le vortex il.
    7. Congeler l'échantillon dans de la glace sèche et conserver à -80 ° C ou de continuer à l'extrait l'ARN.
      Remarque: Avant de l'extraction de l'ARN, étiqueter tous les tubes et colonnes selon la conception de la randomisation (le cas échéant). Préparer tous les réactifs selon les recommandations du fabricant et de prendre des échantillons de -80 ° C congélateur et décongeler sur la glace jusqu'à ce qu'ils soient complètement décongelés.
  2. Homogénéisation
    1. Échantillons Grind avec homogénéisation instrument sur 6000 Hz pendant 45 sec. Répéter si les échantillons ne sont pas correctement homogénéisé et laissé les échantillons pendant 5 min à température ambiante.
    2. Ajouter 140 ul de chloroforme de l'échantillon et vortexer pendant 10 à 15 sec.
    3. Transférer le surnageant à partir du tube d'homogénéisation à un tube de verrouillage de phase et agiter sur unthermoshaker pendant 2 min à 1400 rpm et la température ambiante.
    4. En outre incuber les échantillons pendant 2 minutes à la température ambiante et des échantillons à centrifuger à 12 000 xg pendant 15 min à 4 ° C.
  3. ARN précipitation, lavage, la suspension et la purification dans QIAcube.
    1. Transférer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube de 2 ml.
    2. Charger tous les réactifs nécessaires dans le robot d'extraction selon la feuille de protocole du fabricant, sélectionnez le protocole approprié, réglez le volume d'élution (30 pi) et exécuter le robot d'extraction.
    3. Lorsque la course est terminée, retirez les adaptateurs de rotor et de garder tubes d'élution immédiatement à 4 ° C pour une analyse ultérieure ou à -80 ° C pour le stockage à long terme.
  4. Contrôle de la qualité de l'ARN isolé
    1. Déterminer la quantité de l'ARN isolé en utilisant un lecteur UV selon les instructions du fabricant.
    2. Vérifiez la qualité de l'ARN et de l'intégrité de l'ARN en utilisant microfluidique-gel à base-lab-on-a-chip et un lecteur UV, selonording aux instructions du fabricant.

7. Microarray workflow

Remarque: Le procédé décrit ci-dessous se concentre sur la méthode pour Kit Affymetrix GeneChip haut débit 3'IVT Express, qui est utilisé pour la synthèse de cible pour l'hybridation sur des cartouches d'expression de gène Affymetrix 3 'à partir de la préparation de l'ARN à l'utilisation du complexe système de manipulation de liquides (par ex., pipetage, la dilution, la délivrance ou l'intégration).

  1. Préparation
    1. Aléatoire échantillons pour éviter les effets de lots. Le nombre d'échantillons traités par lots est de 1 à 96, dont un positif (ARN Commercial humaine universelle de référence) et négatif (RNase eau libre) contrôle par lot.
    2. Lancer la synthèse de cible en utilisant 100 ng d'ARN total en 3 ul d'eau sans RNase. Pour 100 ng d'ARN total, utiliser un temps d'incubation de 16 h.
  2. Amplification d'ARN
    1. Préparer le Poly-A-pic dans l'ARN la solution de contrôle par une dilution en série de la Poly-A ARN Stock avec Poly-un tampon de dilution contrôlée:
      1. Pour une dilution, préparer 2 pl polyA commande stock de 36 tampon de dilution ul.
      2. Par dilution 2, 2 ul de préparer une dilution dans 98 ul de tampon de dilution.
      3. Par dilution 3, 4 ul de préparer une dilution en 2 196 pi de tampon de dilution.
      4. Par dilution 4, préparer 20 pi d'une dilution dans 3 180 pi de tampon de dilution.
    2. Diluer l'ARN dans RNAse eau libre pour obtenir une concentration de 33,3 ng / ul.
    3. Ajouter 2 ul de la solution de contrôle pour les polyA 3 ul d'échantillon d'ARN total directement dans une plaque à 96 puits. Cette étape est réalisée par le système de manipulation de liquide.
    4. Préparation du système de manipulation de liquide et la synthèse de la cible. Placer les plaques sur le robot. Placez tous les réactifs nécessaires et du matériel de laboratoire sur le pont. Le robot va commencer la procédure en préparant le appropriate mastermix et incuber les échantillons dans le bloc de PCR commandé à distance automatisé.
    5. Contrôle de Premier contrôle de la qualité: le contrôle du processus d'amplification
      1. Si la qualité de l'ARNa est acceptable, effectuer l'étape de fragmentation en ajoutant à chaque échantillon 8 pi de tampon 5X de fragmentation (Cette étape est réalisée par le système de manipulation de liquide). Sinon, effectuez l'étape précédente à nouveau à partir de l'ARN. Utilisez fragmenté ARNa immédiatement ou stocker non dilué et fragmentée ARNa à -20 ° C (ou -70 ° C pour le stockage à long terme).
      2. Effectuer une deuxième analyse de contrôle de qualité en ramassant au hasard 12 échantillons dans la plaque et le transfert 1 pi sur le système à base de gel de la microfluidique pour vérifier l'efficacité de la fragmentation.
  3. la technique d'hybridation
    1. Scannez le code-barres de puces et d'enregistrer chaque échantillon dans le logiciel du fabricant selon les instructions.
    2. Préparer le mélange d'hybridationsuit pour une seule réaction et l'ajouter à 33 pl de la ARNa fragmenté et marqué: 4,2 ul de contrôle oligonucléotide B2 (3 nm), 12,5 pi de 20x contrôles d'hybridation eucaryotes, 25 ul de DMSO à 100%, 125 ul de tampon 2x d'hybridation et 50 pi de H 2 O pour un volume final de 216,7 pi
      Remarque: Hybrider, laver et balayer contrôles positifs et négatifs avant de traiter les échantillons.
    3. Pré-mouiller le tableau avec 200 pi de pré-mélange d'hybridation contenus dans le kit d'hybridation et de lavage Stain.
    4. Placez la puce dans l'hybridation four réglé à 45 ° C et 60 RPM pendant 10 min.
    5. Dans l'intervalle, dénaturer la plaque (hybridation finale contenant le mélange de cocktail) dans un bloc de PCR à 99 ° C pendant 5 min et 45 ° C pendant 5 min.
    6. Retirer le mélange de pré-hybridation de la matrice et le remplacer par 200 pi de la cible hybridation cocktail (un échantillon par puce).
    7. Placez le tableau dans l'Hybridization four réglé à 45 ° C pendant 16 heures (O / N) avec une vitesse de rotation de 60 tours par minute.
  4. Lavage et coloration
    1. Exécutez "Fluidics" dans la barre de menu du logiciel. Dans la boîte de dialogue Fluidics, sélectionnez le module d'intérêt (1-4), puis sélectionnez le programme Prime_450 à tous les modules. Placer le tube de tampon de lavage A dans une bouteille (400 ml) et de tampon de lavage B dans une bouteille (200 ml), ainsi que pour l'eau milliQ dans une bouteille (500 ml).
    2. Ensuite, suivez les instructions à l'écran LCD. Soulevez les aiguilles et placez 600 pi tache cocktail 1 (SAPE Solution Mix) et 600 pi tache cocktail 2 (solution d'anticorps Mix) contenant des microtubes à des positions # 1 et # 2, et 900 tableau ul Tenir solution tampon à la position # 3.
    3. Après l'O / N incubation dans le four, aspirer le cocktail de la puce et de remplir la puce avec 250 pi de tampon de lavage A. Attribuer le droit puce pour chaque module, sélectionnez le protocole FS450-001 et exécuter chaque moisDule, en suivant les instructions à l'écran. Ce processus dure 90 min.
    4. Une fois l'écran LCD indique le message "Ejecter Cartouche", retirer la puce et inspecter se il ya des bulles. Si des bulles sont présentes, remplir le tableau entièrement avec le tampon de tableau contenant. Appliquer des autocollants sur les cloisons pour éviter toute fuite dans le scanner et nettoyer la fenêtre de puces à ADN avant le chargement dans le scanner.
  5. Numérisation.
    1. Faire chauffer le scanner. Charger la puce dans le chargeur automatique du scanner et lancer la numérisation.
      Note: Après ~ 12 min par puce, un fichier .CEL par puce est généré.
    2. Vérifiez l'image et aligner la grille (si nécessaire) sur les lieux pour identifier les cellules de la sonde.
      Remarque: Le jeu de données a été soumis à ArrayExpress (code = adhésion E-MTAB-1721).

8. Systèmes basés sur le réseau analyse de biologie pour une évaluation de l'impact

  1. traitement des données de puces à ADN.
    Note: Le traitement des données d'uned méthodes de notation ont été mises en œuvre en utilisant la version R de 2,14 environnement statistique.
    1. Ouvrez une session R 18 et charger les Affy 19, gcrma, et forfaits affyPLM installés en exécutant les commandes: bibliothèque (Affy)> bibliothèque (gcrma)> bibliothèque (affyPLM)
    2. Lire les fichiers de données brutes exécutant la commande: data.affybatch <-ReadAffy ("chemin vers le dossier où sont stockés les fichiers CEL")
    3. Soustraire la correction de fond et normale quantile pour générer ensemble de sondes valeurs d'expression utilisant le paquet gcrma, en exécutant la commande: eset.norm <-gcrma (data.affybatch)
  2. Contrôle de la qualité.
    1. Générer des parcelles de dégradation de l'ARN avec la commande: deg <-AffyRNAdeg (data.affybatch)
    2. Extraire le coefficient de la pente de la dégradation de l'ARN exécutant la commande: pente = deg $ pente
    3. Tracer le coefficient de pente et d'identifier les valeurs aberrantes possibles.
    4. Générer Nuse et RLE parcelles exécutant les commandes suivantes: Pset <-fitPLM (data.affybatch)> RLE (Pset)> Nuse (Pset).
    5. Identifier si certains des boxplots générés sont aberrantes: un tableau est considéré comme aberrante si au moins deux des trois QC mesures définies ci-dessous diffèrent des autres tableaux:
      - Deg $ pente est différente de la pente moyenne deg $
      - Terrain de Nuse: un tableau est considéré comme aberrante si le quartile supérieur tombe en dessous de 0,95 ou le quartile inférieur au-dessus de 1,05, ce est à dire, si la boîte à moustaches est entièrement au-dessus de 1,05 ou entièrement en dessous de 0,95..
      - Terrain de RLE: un tableau est considéré comme aberrante si la médiane de la distribution de RLE est supérieur à 0,1 ou inférieur à -0,1.
    6. Si un tableau est identifiée comme une valeur aberrante, puis jeter et recommencer depuis l'étape 8.1.2.
    7. Ajuster un modèle linéaire global aux données pour les contrastes spécifiques d'intérêt (ie., Les comparaisons de "traité" et les conditions de «contrôle») générer des valeurs de P premières pour chaque ensemble de sondes sur la puce, qui peut être Furtson ajusté en utilisant la procédure Benjamini-Hochberg du paquet Limma. Sélectionner un probeset par gène de garder en tant que représentant du gène pour d'autres analyses comme décrit dans 20.
      Remarque: un facteur de groupage (la plaque d'exposition) à partir de la conception de l'expérience a été représenté dans le modèle de traitement de données.
  3. Analyse basée sur le réseau.
    Remarque: Le procédé tel que mis en oeuvre ici est décrite en détail par Martin et al. (Dans la révision en bioinformatique BMC).
    1. Pour chaque comparaison par paire d'intérêt, commencez par le calculée (log2-) facteurs de variation (traitement par rapport au témoin) pour chaque gène dans le réseau (de l'étape 8.2).
    2. Calculer la matrice de Laplace signé L du réseau définie par L (i, j) = - connexion (i ~ j) w (i, j) se il ya un bord de pondération w (i, j) entre le noeud i et j, L (i, j) = deg (i) est le degré pondérée de i et L (i, j) = 0 sinon. Le poids w (i, j) sont égaux à 1 si i et j sont dans le squelette et w (i, j) = 1 / n si i est un noeud d'ossature et j est l'un de ses n Neighbors de la couche de transcription.
    3. Calculer des scores de la colonne vertébrale par f = L3-1L2Tx où L3 est la sous-matrice de L vers les ganglions dorsaux et L2 est la sous-matrice dont les lignes de L correspondent aux noeuds de la couche de la transcription et de la colonne vers les ganglions dorsaux
    4. Calculer la signé Laplace, Q, du réseau défini par le réseau de base où tous les signes de bord sont inversés.
    5. Calculer le score par NPA NPA = fTQf.
    6. Calculer l'intervalle de confiance, l'épine dorsale bord permutation p-valeur et la transcription couche permutation p-valeur.
      Remarque: (. Par exemple, la variation biologique entre les échantillons dans un groupe expérimental) En plus des intervalles de confiance des scores NPA, qui représentent l'erreur expérimentale, les statistiques de compagnie ont été dérivées pour décrire la spécificité du score NPA à la biologie décrit dans le réseau. Parce NPA est une forme quadratique des changements pliage, sa variance peut être calculée sur la base du facteur de variation estimé variances. Un intervalle de confiance est ensuite dérivé en utilisant le théorème central limite. Deux tests de permutation ont été mises en œuvre 21 dans lequel premièrement, évalue si les résultats étaient spécifiques à la preuve sous-jacente (ie., Gene facteurs de variation) dans le modèle, conduisant à une valeur P de permutation (désigné par * O dans les chiffres lorsque P -value <0,05). Deuxièmement, afin d'évaluer si la couche "cause à effet" du réseau a largement contribué à l'amplitude de la perturbation du réseau (noté K * dans les chiffres lorsque P-valeur <0,05).
    7. Considérons le réseau impacté par le traitement si l'intervalle de confiance ne contient pas zéro et les deux permutation valeurs p <0,05.
    8. Calculer les nœuds principaux qui sont définies comme les nœuds clés dans le squelette contribuer jusqu'à 80% de la note NPA.

Résultats

Dans les résultats décrits ci-dessous, les tissus étaient organotypiques cellules épithéliales humaines primaires isolées de santé, non-fumeurs, des donateurs et du Caucase ont été reconstitués en utilisant des fibroblastes 15.

Bronchique 3D et modèles de tissus nasaux
Dans bronchique vitro et modèles organotypiques nasales ressemblent au niveau cellulaire de l'épithélium des voies respiratoires humaines (Figure 2).

L'exposition CS
Bronchique organotypique et modèles de tissus nasaux peuvent être exposés de façon répétée à intégrer CS à l'interface air-liquide. La procédure expérimentale de l'exposition à la fumée utilisée pour les résultats illustrés ici est représenté sur la figure 1.

Enregistrement du battement ciliaire
Cilia battement a été enregistrée dans les tissus exposés à l'air, comme illustré dans les vidéos. CS exposition a été associée à une réduction de la fréquence de battement ciliaire: le plus fort pic observé autour4 Hz dans le simulacre exposé et avant l'exposition ne est pas observée plus longtemps après l'exposition CS (Figure 3). Cette fréquence réduite rendrait les cils battant moins efficace pour éliminer le mucus et les agents infectieux 22.

Mesure de TEER et CYP1A1 activité / 1B1
TEER a été mesurée 48 h après la dernière exposition pour assurer le tissu est encore fonctionnel. CYP1A1 / 1B1 activité a également été mesurée 48 h après la fin de l'exposition comme illustré sur la Figure 1. Les valeurs TEER dans les tissus CS-exposées étaient pas significativement différentes par rapport aux tissus de l'air exposé confirmant qu'il n'y a pas d'effet cytotoxique important de fumée à cette concentration. Au post-exposition 48 h, CYP1A1 / 1B1 activité des tissus a été légèrement augmenté, indiquant une modeste augmentation de mécanisme de défense de tissu après l'exposition (Figure 4).

Gene profils d'expression et des systèmes basés sur le réseau biologie approche pour étudier l'impact de l'exposition CS sur l'altération du métabolisme des xénobiotiques
Les tissus ont été prélevés à des moments post-exposition 48 h. Par la suite, l'analyse de puces à ADN a été réalisée pour générer des profils d'expression génique de la CS et des tissus exposés à l'air. Impact de l'exposition sur le métabolisme des xénobiotiques CS a été étudiée en utilisant une approche basée sur le réseau biologie des systèmes à effet de levier à partir des profils d'expression génique et comme rapporté plus tôt 15. En utilisant une approche biologie des systèmes en réseau montre que les effets de l'exposition CS au niveau des nœuds de réseau fédérateur dans le modèle de réseau de métabolisme des xénobiotiques étaient bien corrélées entre le in vitro et in vivo des ensembles de données (figure 5). En revanche, au niveau de chacun des changements d'expression génique, le manque de corrélation n'a été observée entre le in vitro (CS-exposé vs. air-exposée) et in vivo contre les non-fumeurs (fumeurs).

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Figure 1. Représentation schématique de la procédure exposition répétée de CS pour les modèles de tissus bronchiques organotypiques Abréviations:. CYP, cytochrome P450; CS, la fumée de cigarette; TEER, résistance électrique transépithéliale.

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Figure 2. organotypiques bronchique et les modèles de culture de tissus épithéliales nasales. Dessinée illustrant le bronchique (A) et nasal (B) la culture tissulaire insert à l'interface air-liquide. Les modèles in vitro contiennent des cellules ciliées indiquées dans la couche apicale des cellules colorées hématoxyline & éosine (C pendant bronchique, D) pour l'administration nasale 15 comme indiqué précédemment. Les modèles ont été co-cultivées avec des fibroblastes qui sont importantes pour la croissance et la différenciation des cellules épithéliales (indiqué par des flèches). Coloration des marqueurs de la lignée des voies respiratoires: p63 (E pour bronchique, F pour nasale) et MUC5AC (G pour bronchique, H pour nasale) sont présentés comme indiqué précédemment 15. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 3. Fréquence Battre Cilia. Cilia fréquence de battement (CBF) a été mesuré dans l'air et exposées dans la culture avant et après l'exposition. Une diminution de la CBF a été observée après l'exposition CS (résultats représentatifs de deux insert sont présentés comme une réplique (R1) et répliquent 2 (R2)).

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Figure 4. Mesure de l'activité CYP1A1 / CYP1B1 et TEER. Panneaux gauche indiquent l'activité CYP1A1 / bronchique dans la CYP1B1 (A) et nasal (B) modèles de tissus. Panneaux de droite indiquent la mesure de la TEER bronchique (C) et nasal (D) modèles de tissus. Moyens ± SD sont présentés. Abréviations: CS, la fumée de cigarette; CYP, cytochrome P450; TEER, résistance électrique transépithélial; AVC, unité de luminescense relative.

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Figure 5. Les systèmes basés sur le réseau approche de biologie pour l'évaluation de l'exposition CS dans le cadre du métabolisme des xénobiotiques de l'impact. Les changements de niveaux d'expression des gènes ont été utilisés pour calculer l'activation du noeud épine dorsale du modèle de réseau Xénobiotique métabolisme (A) strong> tel que rapporté dans une publication précédente 15. La figure de droite illustre le concept de la quantification des noeuds du squelette, aussi connu comme "valeur de réseau fédérateur différentiel», en utilisant l'approche NPA. Les ovales bleues représentent l'activité des noeuds de réseau fédérateur (par exemple., La couche fonctionnelle) et les billes vertes représentent l'expression des gènes (ce est à dire., La couche de transcription). Impacts d'une exposition dans les tissus bronchiques CS organotypiques (in vitro, CS-exposés vs exposées à l'air) au 48 h de post-exposition ont été comparés à ceux du tabagisme sur l'épithélium bronchique humain prélevé par bronchoscopie et nasale épithéliale par burshing cornet inférieur (GSE16008 ) (in vivo, les fumeurs vs les non-fumeurs) (B). Encarts, la corrélation de l'expression du gène change entre le in vitro et in vivo des ensembles de données. Abréviations: CS, la fumée de cigarette; NPA, l'amplitude de perturbation du réseau.ove.com/files/ftp_upload/52325/52325fig5large.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Ici, nous avons démontré l'applicabilité de bronchique organotypique humaine et modèles de tissus nasaux pour évaluer l'impact d'une exposition répétée CS. Comme une alternative à l'expérimentation animale, un certain nombre de systèmes d'exposition ont été élaborées pour les évaluations toxicologiques de l'exposition d'aérosol in vitro (par exemple., Vitrocell, Cultex, ALICE, etc.). Ces modules d'exposition peuvent également être utilisés pour une évaluation toxicologique des polluants atmosphériques, les particules en suspension, les nanoparticules, etc. Dans cette étude, nous avons utilisé le système Vitrocell qui peut accueillir jusqu'à 48 échantillons différents simultanément, ce qui permet pour les grandes expériences à grande échelle et une plus faible variabilité entre les traitements. Pour chaque exposition aérosol in vitro, le risque de contamination de la culture de tissu demeure un risque majeur dont l'atténuation exige une manipulation soignée des cultures de tissus tout au long des expériences.

Mesure de dépôt de particules en temps réel sur le cours de la microbalance électroniquexposition expérience permet de surveiller que les doses CS générés par le système d'exposition sont conformes aux attentes. Pour assurer la précision du dépôt de particule mesurée, mise en place correctement la mesure en ligne avant l'exposition est critial, par exemple, la mise en place de l'échelle à 0. En outre, en raison de la différence entre les zones de la microbalance (cm 2) et le insert de culture de tissu (0,33 cm 2), on a ajusté le calcul final de la zone de l'insert de culture: seulement 33% du dépôt sur ​​la microbalance reflète le dépôt effectif dans l'insert de culture.

Mesure de TEER de vérifier la fonctionnalité de barrière étanche jonction et d'évaluer la perturbation de la couche épithéliale est une procédure relativement facile à mettre en œuvre, que nous avons rapporté ici. Cependant, parce que les modèles de tissus bronchiques et nasales les contiennent des cellules caliciformes intercalées mucus production, lave-apicale doit être effectuée avant que les AME TEERme-. Le lavage apicale est essentiel parce que la présence de la couche de mucus et la variabilité de son épaisseur peut biaiser la mesure de TEER, interférer avec l'impact de l'exposition CS. Cette notion est en accord avec ce qui a été rapporté par Hilgendorf et ses collègues, dans lequel la perméabilité des cellules Caco-2 a été affectée par la co-culture avec la lignée cellulaire gobelet mucus produisant HT29 23. Le mucus doit être lavé avant la mesure TEER, parce laver apicale juste avant l'exposition peut interférer avec les réponses tissulaires à CS. Par conséquent, la mesure est effectuée trois jours avant l'exposition, et non juste avant l'exposition.

Nous avons montré que l'activité CYP1A1 / CYP1B1 pourrait être mesurée à partir des modèles de culture organotypiques après exposition CS bien que l'activité a été que modestement augmenté de CS. Ce signal faible peut être amplifié par une incubation plus longue du substrat CYP1A1 / de 1B1 (ie., La luciférine-FEC), par exemple pour24 heures (données non présentées). Une des limites de la mesure de l'activité de CYP dans le présent travail est l'absence de normalisation au niveau de la protéine CYP ou de la numération cellulaire, qui pourraient être prises en considération pour de futures études pour se assurer que la modification de l'activité enzymatique ne est pas influencée par la modification de l'une ou l'autre niveau de la protéine ou du nombre de cellules.

Nous avons signalé que l'exposition CS a inhibé la ciliaire battre à la fois dans l'nasale et modèles de tissus bronchiques. Des observations similaires ont été faites dans des modèles différents mammifères et non mammifères 12. Pour battement ciliaire mesure, en veillant à ce que les tissus sont manipulés et traités d'une manière similaire est critique, par exemple si le changement moyen est mis en oeuvre, il doit être appliqué pour tous les échantillons. Sutto et ses collègues ont rapporté que le pH affecté le ciliaire mammifère battant fréquence 24. Ainsi, lorsque l'on compare battant fréquences entre les cellules traitées avec différentes compunds / mélanges, pHajustement doit être considérée pour réduire au minimum la variabilité de la mesure de battements ciliaires. En outre, la température à laquelle la mesure est effectuée est également essentiel que la fréquence de battement ciliaire diminue lorsque la température diminue. Pour minimiser la variabilité due à ces changements, un incubateur stade supérieur, équipées avec la température, de CO 2, et contrôle de l'humidité a été utilisé dans cette étude. Malgré cela, nous avons observé que le battement ciliaire fréquences dans les tissus bronchiques après l'exposition CS était très variable (ie., Augmenter en un insert et diminuer dans l'autre insert), ce qui suggère que le battement ciliaire est juste très perturbé après l'exposition. En revanche, nous avons observé l'absence d'mesurables fréquences de battement ciliaire dans le tissu nasal après exposition CS, ce qui suggère que la réponse du tissu nasal est plus sensible et cohérente. Ce est en accord avec une précédente publication montrant que le tissu nasal a une capacité inférieure à détoxifier quepar rapport à 25 la bronche.

Enfin, nous avons montré que l'expression du gène de profilage de la bronchique organotypique et modèles de tissus nasaux exposés à CS pourrait démontrer un impact de CS sur le métabolisme des xénobiotiques. Fait intéressant, la modification observée dans le métabolisme des xénobiotiques dans le bronchique et nasale organotypique des modèles in vitro exposé à CS qui ressemblent à de la situation in vivo chez les fumeurs comme on le verra plus en détail dans une publication précédente 15. Pour les analyses de l'expression génique, en utilisant l'instrument robotisé fait une analyse à haut débit possible. De plus, la manipulation robotisée automatique augmente encore la cohérence et la précision des résultats d'expression de gène. Néanmoins, la collecte rapide des échantillons de tissu est critique pour éviter la dégradation de l'ARN au cours de l'extraction de l'ARN. Le traitement de l'ARN et des approches transcriptomiques décrits ici peuvent également être appliqués à des échantillons de tissus in vivo.

Déclarations de divulgation

Cette étude a été financée par Philip Morris International.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier Maurice Smith et Marja Talikka pour la révision du manuscrit.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
MucilAir-fibroblastes humains-bronchieEpithelix Sá ; rl, Genève, Suissehttp://www.epithelix.com/content/view/122/19/lang,en/
MucilAir Culture MediumEpithelix Sá ; rl, Genève, Suissehttp://www.epithelix.com/content/view/84/16/lang,en/
VITROCELLVITROCELL systems GmbH, Waldkirch, Allemagnehttp://www.vitrocell.com/index.php?Nav_Nummer=2&R=
3R4F référence cigaretteUniversité du Kentuckyhttp://www2.ca.uky.edu/refcig/
Machine à fumer carrousel à 30 ports SM2000Philip Morris, Int.
Caméra et logiciel CiliaMetrixLa Haute & Eacute ; cole de Gestion (HESGE), Genève, Suisse Microscope
Leica DMIL  ;Leica, Heerbrugg, Suisse
Source de lumière LEDTitan Tool Supplies, Buffalo, NY
Baguette électrode STX-2World Precision Instrumentshttp://www.wpiinc.com/products/physiology/stx2-chopstick-electrode-set-for-evom2/
EVOMXTM Voltohmmètre épithélial  ;World Precision Instrumentshttp://www.wpiinc.com/products/physiology/evom2-evom2-epithelial-voltohmmeter-for-teer/
Réactif de détection de luciférine »
Instrument MagNA Lyser  ;Rochehttp://www.roche.com/products/product-details.htm?region=us&type=product&id=66
chloroforme  ;Sigma-Aldrichhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion=
QIAcube  ;Qiagen9001882
NanoDropThermo Scientifichttp://www.nanodrop.com/
Bioanalyseur Agilent 2100 »Agilenthttp://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106
Affymetrix GeneChip Haut débit 3' IVT Express KitAffymetrixhttp ://www.affymetrix.com/catalog/prod370001/AFFY/High-Throughput-(HT)-Whole-Transcript-(WT)-Kit
Scanner 3000 7G  ;Affymetrixhttp://www.affymetrix.com/catalog/131503/AFFY/Scanner-3000-7G

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