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Article de méthode

Génération de la RCA cellules T pour la thérapie adoptive dans le contexte de glioblastome norme de diligence

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DOI :

10.3791/52397

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16 février 2015

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1Duke Brain Tumor Immunotherapy Program, Department of Neurosurgery, Duke University, 2Department of Biomedical Engineering, Duke University, 3Department of Pathology, Duke University

Dans cet article

Résumé

Les effets lymphodéplétifs et immunomodulateurs de la chimiothérapie et de la radiothérapie standard peuvent être exploités pour améliorer l’efficacité antitumorale de l’immunothérapie par lymphocytes T. Nous décrivons une méthode pour générer des lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (CAR) spécifiques de l’EGFRvIII et les administrer dans le contexte de la norme de soins du glioblastome.

Résumé

L’immunothérapie adoptive par lymphocytes T offre une stratégie prometteuse pour cibler et éliminer spécifiquement les gliomes malins. Les lymphocytes T peuvent être modifiés ex vivo pour exprimer des récepteurs antigéniques chimériques spécifiques des antigènes du gliome (cellules CAR-T). L’expansion et la fonction des cellules CAR-T transférées par l’adoption peuvent être potentialisées par les effets lymphodéplétifs et tumoricides de la chimiothérapie et de la radiothérapie standard. Nous décrivons une méthode de génération de cellules CAR-T ciblant EGFRvIII, un antigène spécifique du gliome, et évaluons leur efficacité lorsqu’elles sont combinées à un modèle murin de glioblastome standard de soins. Les lymphocytes T sont modifiés par transduction avec un vecteur rétroviral contenant le gène CAR anti-EGFRvIII. Les animaux porteurs de tumeurs sont soumis à un conditionnement de l’hôte par une série de témozolomide et d’irradiation du cerveau entier à des schémas posologiques conçus pour modéliser la norme clinique de soins. Les cellules CAR-T sont ensuite administrées par voie intraveineuse aux hôtes amorcés. Cette méthode peut être utilisée pour évaluer l’efficacité antitumorale des cellules CAR-T dans le contexte des soins standard.

Introduction

Le glioblastome (GBM) est la tumeur la plus fréquente primaire maligne au cerveau et est toujours mortelle. La résection chirurgicale couplé à la norme non-spécifique de chimiothérapie et la radiothérapie soins ne parvient pas à éliminer complètement les cellules malignes, résultant en un mauvais pronostic de moins de 15 mois chez les patients atteints de cette maladie une. En revanche, l'immunothérapie offre une approche précise pour cibler spécifiquement les cellules tumorales, et a donc le potentiel pour servir de plate-forme de traitement très efficace avec un risque réduit de garantie toxicité 2-4. Des lymphocytes T modifiés ex vivo pour exprimer des récepteurs d'antigènes chimériques (RAC) offrent une stratégie polyvalente pour l'immunothérapie des tumeurs. RAC sont produites par fusion de la région variable d'un anticorps extracellulaire avec une ou plusieurs cellules T molécule intracellulaire (s) de signalisation, au lieu d'une pleine longueur complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) -restricted récepteur de cellule T 5. Ce mode d'anticorps-antigène comme reconpermet à des cellules T spécifiques de l'antigène de réactifs reconnaissent et répondent aux antigènes de tumeur en l'absence de CMH et peuvent être adaptés pour un répertoire pratiquement infini d'antigène.

CAR cellules T modifiées contre une variété d'antigènes tumoraux ont montré l'efficacité préclinique et la promesse exceptionnelle dans la clinique 6-9. Plus précisément, dans le cadre de GBM, une variante CAR T plate-forme de ciblage cellulaire de croissance épidermique du récepteur du facteur III (EGFRvIII), une mutation spécifique de la tumeur exprimé sur la surface de la cellule 10, a été représenté à prolonger la survie chez les souris de gliome portant 11. Malgré leur polyvalence, cependant, le bénéfice clinique de la RCA thérapie adoptive n'a pas été pleinement réalisé, en partie grâce à une immunosuppression associé à une tumeur et l'évasion immunitaire 12-16 ainsi que les défis dans l'établissement et le maintien des cellules T spécifiques de l'antigène in vivo. Se appuyant sur la norme de diligence (SOC) avec une immunothérapie peut potentiellement surmonter plusieurs de ces limitations, résultant en une efficacité accrue à la fois dans la mise en préclinique et clinique.

SOC pour la post-résection GBM se compose de témozolomide à haute dose (TMZ), un agent alkylant d'ADN 17, et l'irradiation du cerveau entier (WBI) 1. Ces traitements sont présumés en synergie avec les vaccins tumorales via la régulation positive de la tumeur expression du CMH 18-20 et l'effusion d'antigènes par les cellules tumorales mortes 17,19,21,22. En effet, l'addition de TMZ 20,23 ou 18,24 WBI conduit à une amélioration efficacité antitumorale de traitements immunitaires dans la mise en préclinique. En outre, comme de nombreux agents chimiothérapeutiques cytotoxiques non-spécifiques, TMZ est connu pour causer de 25,26 lymphopénie systémique, qui peut être mis à profit comme un moyen de l'hôte conditionné pour les plateformes de thérapie adoptifs 27-29. Lymphodepletion TMZ médiée a été montré pour améliorer la fréquence et la fonction des cellules T spécifiques de l'antigène, ce qui augmente l'efficacité d'un 'adoptiontive plate-forme de traitement contre les tumeurs intracrâniennes 30. Dans le cadre de la thérapie de voitures, lymphodepletion sert de moyen de conditionnement d'hôte à la fois par la réduction du nombre de lymphocytes T suppresseurs endogène 31 et induire la prolifération homéostatique réduite 32 par compétition pour des cytokines 33, améliorant ainsi l'activité antitumorale 11,34. Étant donné la relation synergique entre GBM SOC et d'immunothérapie plates-formes, l'évaluation de nouvelles thérapies adoptifs et les plates-formes de vaccins dans le cadre du SOC est essentiel pour tirer des conclusions significatives concernant l'efficacité.

Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour la production et l'administration intraveineuse de cellules T spécifiques CAR-EGFRvIII murins aux côtés de TMZ et le WBI chez les souris portant des tumeurs intracrâniennes EGFRvIII-positifs (voir la figure 1 pour le traitement timeline). Brièvement, les cellules T sont versées CAR ex vivo par transduction rétrovirale. Rein embryonnaire humain (HEK) 293T cellules sont transfectées en utilisant un complexe ADN / lipide (contenant le vecteur de la RCA et plasmides PCL-Eco) pour produire un virus, qui est ensuite utilisé pour la transduction de splénocytes murins activés qui sont récoltées et cultivées en parallèle. Au cours de la génération de la RCA, les hôtes murins portant des tumeurs intracrâniennes EGFRvIII-positifs sont administrés fractionné l'ensemble du cerveau irradiation aux rayons X et le traitement systémique TMZ à des doses comparables à SOC clinique. cellules T CAR sont ensuite livrés par voie intraveineuse à des hôtes lymphodepleted.

La procédure suivante est décrite dans sept phases distinctes: (1) L'administration de témozolomide à la tumeur portant souris, (2) Le total irradiation de cerveau de souris porteuses de tumeurs, (3) la transfection, (4) La splénectomie et cellules T Préparation, (5 ) transduction, (6) Culture CAR des lymphocytes T et la récolte, et (7) l'administration de cellules T CAR à des souris porteuses de tumeurs. Ces phases se composent de plusieurs étapes qui se étendent sur 6-7 jours et sont exécutés simultanément.

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Protocole

Ce protocole est basé sur un modèle expérimental où 10 souris sont traitées avec 10 cellules T 7 CAR chacun. Cela signifie que 10 8 cellules CAR T seront nécessaires; le rendement devrait être surestimée par 5 x 10 -1 7 x 10 8 pour tenir compte de la perte de la viabilité. Le protocole suivant est mis à l'échelle pour générer environ 200 x 10 6 cellules. Les cellules sont ensuite administrées par voie intraveineuse à la femelle C57BL / 6 de souris avec des tumeurs de 9 jours établis syngéniques de EGFRvIII positif intracrâniennes, développé à partir des lignes existantes de cellules de mélanome de KR158B astrocytome ou B16. Concomitamment avec la RCA génération de lymphocytes T, des souris porteuses de tumeurs sont administrés des doses cliniquement pertinentes de lymphodepletive TMZ (60 mg / kg) et de WBI (16,5 Gy).

Les souris ont été maintenus et élevés dans des conditions exemptes d'agents pathogènes à Duke University Medical Center (DUMC). Toutes les expériences animales ont été effectuées selon des protocoles approuvés par la Duke University Institutional protection des animaux et l'utilisation Comité (IACUC).

1. Administration de Témozolomide à des souris porteuses de tumeurs

Jours 0 à 4:

  1. Calculer le nombre total de souris à injecter et à multiplier par 0,5 pour déterminer le volume de solution TMZ nécessaire (par exemple, 30 souris x 0,5 ml = 15 ml TMZ) et ajouter 1,5 ml à ce volume pour tenir compte des retombées (16,5 ml TMZ ).
  2. Multipliez ce volume total de 3 mg / ml pour déterminer le poids de lyophilisé TMZ nécessaire (par exemple, 16,5 x 3 = 49,5 mg TMZ). Peser cela dans un 50 ml conique.
    ATTENTION: TMZ est toxique par inhalation, ingestion et contact avec les yeux, la peau et les muqueuses. Consultez travail sécurité de l'institution et / ou la santé de l'environnement et le département de bien-être pour les recommandations sur la réduction des risques d'exposition.
  3. Multipliez le volume total de 0,15 pour déterminer le volume de diméthylsulfoxyde (DMSO) nécessaire (par exemple, 16,5 x0,15 = 2,475 ml de DMSO). Filtre stériliser ce volume de DMSO (plus un supplément de 2 ml pour tenir compte des retombées) à travers un filtre de 0,2 um dans un tube stérile. Ajouter 2,475 ml de DMSO stérile pour la poudre TMZ.
  4. Placer la solution TMZ / DMSO dans un bécher d'eau sur une plaque chauffante à 65 ° C pendant 10-15 min. Une fois TMZ est entièrement dissous, la solution devrait devenir de couleur jaune pâle; si la solution devient rose, le TMZ est dégradée, et une nouvelle solution devrait être préparée par un nouveau lot de TMZ.
  5. Calculez le volume approprié de solution saline stérile nécessaire en multipliant par 0,85 le volume total (0,85 x 16,5 ml = 14,025 ml de solution saline). Ajouter 15 ml de solution saline stérile à 50 ml d'une conique. Bien que le TMZ est dissout dans le DMSO, la chaleur du sérum physiologique à 65 ° C.
  6. Vortexer la solution / DMSO TMZ faire en sorte que la poudre soit complètement dissoute TMZ et ajouter lentement une solution saline chauffée à la solution / DMSO TMZ.
  7. Immédiatement après la préparation, charger entièrement 15 x 1 ml Seringue tuberculinees avec une solution TMZ pour l'administration à des souris porteuses de tumeurs établies de quatre jours.
  8. Répétez cette procédure sur les jours 1 à 4 pour un total de cinq administrations TMZ.

2. Cerveau Global irradiation des souris porteuses de tumeurs

Jours 2 à 4:

  1. Allumez l'irradiateur à rayons X et le laisser se réchauffer-à pleine tension. Assurez-vous que le filtre approprié est en place et entrée la tension appropriée et les paramètres actuels (figure 2A).
    NOTE: La dosimétrie de l'irradiateur sera établie au préalable pour déterminer les paramètres de tension et la disposition de grille (figure 2A, B) approprié.
  2. Calculer la longueur de temps qui est nécessaire pour aboutir à 5,5 Gy d'irradiation aux rayons X. Par exemple, si les rayons X sont livrés à un taux de 2 Gy / min, puis 2,75 min est nécessaire pour livrer un total de 5,5 Gy. Saisissez le durée appropriée.
    NOTE: Le tableau 2 présente la souris WBI doses And leurs équivalents cliniques chez l'homme. Dans le contexte de gliomes de haut grade, 60 Gy fractionnée WBI (deux fractions Gy, 5 jours / semaine pendant 6 semaines) est la norme clinique des soins, et l'équivalent murin utilisé ici est de 16,5 Gy (5,5 Gy x 3).
  3. Préparer une solution fraîche de la kétamine / xylazine pour l'anesthésie systémique par addition de 2 ml de kétamine et de xylazine 1 ml à 17 ml de sérum physiologique telle que la solution finale est de 10 mg / ml de kétamine et 1 mg / ml de xylazine.
  4. Peser et administrer des souris 10 ul de la kétamine / xylazine par voie intraperitoneale par gramme de poids corporel, tels que les animaux reçoivent une dose de kétamine à 100 mg / kg et 10 mg / kg de xylazine. Souris devrait être pleinement sous sédation et respiration visiblement moins de 2 minutes de la kétamine administration / xylazine.
  5. Pour maintenir l'humidité ophtalmique chez les animaux sous sédation, frottez doucement une petite quantité de larmes artificielles onguent sur chaque œil.
  6. Placer sous sédation souris sur la grille de telle sorte que les têtes sont positionnées dans la zone qui reçoit la plus élevée des rayons X enintensité (figure 2B, C). corps de blindage de la nuque vers le bas avec la taille appropriée tuyau de plomb de bloquer la livraison systémique rayons X (figure 2D).
  7. Passer souris positionné sous le faisceau de rayons X de telle sorte que le laser désignant le point focal du faisceau de rayons X est à la coordonnée (0,0) sur la configuration de la grille. Commencez livraison X-ray.
  8. Lorsque la livraison de rayons X est terminée, retirez les animaux de l'irradiateur et les placer sur un coussin chauffant chaud. Ne pas abriter des animaux sous sédation avec des animaux conscients que les animaux ont repris conscience suffisante pour maintenir couchée sternale. Une fois que les animaux peuvent maintenir couchée sternale, placer des animaux conscients de retour dans leurs cages appropriées.
  9. Répéter ce procédé aux jours 3 et 4 pour un total de trois doses fractionnées de rayonnement.

3. transfection

Jour -1:

  1. Préparer médias D10 en ajoutant 50 ml de sérum bovin fœtal (FBS) à 500 ml de M par Dulbeccoodified milieu Eagle (DMEM).
  2. Préparer T milieux cellulaires (TCM) en ajoutant 5,5 ml de L-glutamine, 5,5 ml de pyruvate de sodium, 5,5 ml d'acides aminés non essentiels, et 5,5 ml de pénicilline / streptomycine (pen / strep) à 500 ml de milieu RPMI-1640. Ensuite, ajouter 550 pi de 2-mercaptoéthanol et 550 ul de gentamicine. Enfin, ajoutez 50 ml de FBS.
  3. Récolte in vitro des cellules HEK293T cultivés dans et amener à une concentration de 7,5 x 10 6 cellules / ml dans les médias de D10.
  4. Plaque de support 10 ml de D10 et ajouter 1 ml de suspension de cellules HEK293T dans chacun des 16 x 10 cm de poly-D-lysine (PDL) des plaques revêtues.
  5. Incuber pendant une nuit à 37 ° C avec 5% de CO 2.

Jour 0:

  1. Remplacez le support avec 10 ml D10 frais au moins 30 min avant la transfection de cellules.
  2. Déterminer la quantité de vecteur plasmidique, PCL-Eco vecteur et réactif de transfection liposomale nécessaire pour la transfection en multipliant le nombre total de plaques + 1 (16 + 1 = 17) de 14,1 ugvecteur plasmidique (14,1 x 17 = 239,7 ug), 9,9 ug PCL-Eco vecteur (9,9 x 17 = 168,3 ug), et 60 pi de réactif de transfection liposomale (60 x 17 = 1020 pi). Tous les réactifs doivent être à température ambiante avant de préparer les solutions.
  3. Étiqueter deux tubes A et B. Dans le tube A, ajouter 239,7 ug vecteur plasmidique et 168,3 ug PCL-Eco vecteur (1,5 x 17) ML-sérique réduite du milieu de Eagle (RS-MEM) modifié. Dans le tube B, ajouter 1 020 pi de réactif de transfection liposomale à (1,5 x 17) ml RS-MEM.
  4. Incuber A et B séparément pendant 5 min à température ambiante.
  5. Mélanger A et B ensemble doucement (vortex pendant 1-2 sec ou inverser plusieurs fois) et incuber pendant 20 min à température ambiante pour former lipide / le complexe d'ADN.
  6. Ajouter goutte complexe lipide / ADN sage de cellules HEK293T en boîte de 10 cm.
  7. Incuber à 37 ° C pendant 6-8 heures ou toute la nuit (ne pas dépasser 24 heures).
  8. Après 6-8 heures d'incubation, remplacez milieu avec 12 ml de TCM frais pour la production virale. Ce support plaquésera utilisé lors de la Journée 2 comme surnageant viral T transduction cellulaire.

4. La splénectomie et T Préparation des cellules

Jour 0:

  1. Verser 10 ml de TCM dans un conique de 50 ml et placer sur la glace pour la collecte de la rate.
  2. Sacrifiez le nombre approprié d'animaux par asphyxie au CO2 et la décapitation secondaire: La place des animaux dans une cage recevoir CO 2 à un débit de 10 à 30% du volume cage / minute, par directives de l'American Veterinary Medical Association (pas plus de cinq animaux peuvent être sacrifiée simultanément) jusqu'à ce que se termine de la respiration et pendant deux minutes par la suite. Retirer les animaux de la chambre de CO 2 et de décapiter.
    REMARQUE: Une rate d'un vieux 6-12 semaines féminine souris C57BL / 6 donnera environ 4,5 à 5 x 10 7 splénocytes. Ici, quatre rates seront récoltées pour environ 200 x 10 6 cellules.
  3. Placez la souris de sorte que son côté droit vers le haut, etvaporiser avec 70% d'éthanol. Avec la pince, saisir une mince pli de la peau en dessous de la cage thoracique gauche et couper une légère incision avec des ciseaux. Peler la peau, prenez soin d'une mince repli du péritoine avec une pince, et couper une petite cavité.
  4. La rate est un petit organe allongé rouge, et sombre qui ressemble à un haricot aplati; délicatement saisir la rate avec la pince et de l'accise en coupant le tissu conjonctif environnant. Placez les rates excisées dans le conique contenant 10 ml de TCM sur la glace.
  5. Verser rates sur une maille de tamis de 70 pm et ventiler par brassage avec l'extrémité émoussée de l'intérieur d'une seringue de 5 ml pour générer une suspension à cellule unique. Un maximum de deux rates devraient être ventilées par passoire.
  6. Utilisez un petit volume de TCM à laver soigneusement la crépine suivante désagrégation de recueillir des splénocytes restants. Piscine toute rates ventilées en une suspension à cellule unique. Apportez volume final à 50 ml avec MTC pour un lavage d'uneD tourner à 300 g pendant 10 min.
  7. Préparer une solution de tampon de lyse par addition de 1 x 5 ml de tampon de lyse 10X et 45 ml d'eau stérile. Pour éliminer les globules rouges, remettre le culot dans 5 ml de 1x tampon de lyse par rate dans un 50 ml conique, bien mélanger en pipetant doucement monter et descendre. Si plus de 5 rates, utiliser un tube de centrifugeuse de 250 ml. Passer conique ou tube de centrifugeuse dans un bain d'eau à 37 ° pendant 5 min.
  8. Retirer la réaction de lyse à partir du bain d'eau et ajouter TCM à un rapport 1: 1 avec du tampon de lyse pour neutraliser la réaction. Laver par centrifugation à 300 g pendant 10 min.
  9. Aspirer surnageant et le culot entièrement remettre en suspension dans TCM (2 ml / rate, 8 ml au total pour 4 rates) par aspiration et refoulement.
  10. Compter les cellules en ajoutant 10 ul de suspension de cellules à 190 pi de bleu trypan (1:20 de dilution). Multiplier le nombre obtenu en l'un des quatre points de grille de carrés de 20 x 10 x 4 volume total (8 ml) pour obtenir le nombre total de cellules (par exemple, des cellules 125 x 20 x 10 4 x 8 ml = 200 x 10 6 splénocytes).
  11. Diluer les cellules à une concentration de 2 x 10 6 cellules / ml dans du TCM, supplémenté avec 2 pg / ml de concanavaline A (ConA) et 50 UI / ml recombinant interleukine-2 humaine (rhIL-2). Ainsi, pour 200 x 10 6 splénocytes, ajouter 92 ml médias à 8 ml de cellules, 200 ug ConA, et 5000 UI rhIL-2.
  12. Ajouter 2 ml de cellules dans chaque puits de plaques de culture tissulaire à 24 puits traitées, de telle sorte que 4 x 10 6 cellules sont dans chaque puits (par exemple, 100 ml de cellules, il faudra environ 4 plaques).
  13. Incuber pendant une nuit à 37 ° C avec 5% de CO 2.

5. transduction

Jour 1:

  1. Calculer le nombre de culture non-tissu traité plaques à 24 puits nécessaires pour la transduction en multipliant le nombre de rates récoltées par deux (8 plaques sont nécessaires pour quatre rates).
  2. Ensuite, on calcule le volume requis de fragment de fibronectine humaine recombinante (RHFF) solutionnécessaire pour plaques de revêtement en multipliant (nombre total de puits + 3) x 0,5 ml (8 x 24 puits des plaques = 192 = 195 + 3) x 0,5 ml = 97,5 ml.
  3. Préparer 97,5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant RHFF à une concentration de 25 ug / ml en multipliant le volume total de 25 ug (97,5 x 25 = 2437,5 pg). Ajouter cette quantité de RHFF à 97,5 ml de PBS.
  4. Culture non traitée tissu Coat plaques à 24 puits par addition de 0,5 ml de solution PBS / RHFF par puits.
  5. Incuber pendant une nuit à 4 ° C.

Jour 2:

  1. Dump solution PBS / RHFF culture de tissu non traitée plaques à 24 puits.
  2. Ajouter 1 ml / puits de sérum albumine bovine à 2% (BSA) dans du PBS et incuber à température ambiante pendant 30 min.
  3. Retirer BSA par bouleversant fermement plaque. Lavez en ajoutant 2 ml de PBS.
  4. Recueillir surnageant viral par le transfert de médias de chaque plaque PDL HEK293T dans un tube de 250 ml de centrifugeuse et tourner 10 min à 500 x g.
  5. Soigneusement transférer su viralepernatant dans un 250 ml nouveau tube de centrifugation, en étant sûr de ne pas perturber le culot cellulaire qui se est formée.
  6. Ajouter TCM frais au surnageant viral de telle sorte que le volume final est de 3 ml de plus que la quantité nécessaire pour les puits revêtus de RHFF. Par exemple, pour 192 puits revêtues RHFF, porter le volume de surnageant viral pour 192 ml + 3 = 195 ml.
  7. Retirer splénocytes en culture de l'incubateur et remettre en suspension en pipetant doucement monter et descendre 2-3 fois dans chaque puits. Transférer dans un 250 ml conique. Si vous utilisez une pipette multicanaux, en utilisant un réservoir stérile avant de transférer va aider à accélérer cette étape. Compter comme décrit précédemment et de spin à 300 g pendant 10 min.
  8. Ajouter rhIL-2 à surnageant viral à une concentration de 50 UI / ml. Par exemple, ajouter 50 x 195 = 9750 UI rhIL-2 à 195 ml de surnageant viral.
  9. Reprendre splénocytes en surnageant viral à 1 x 10 6 cellules / ml
  10. Ajouter 1 ml / puits de la suspension de splénocytes RHFF revêtues de plaques à 24 puits.
  11. Spin pendant 90 min selon les paramètres suivants: 770 x g, l'accélération = 4, freinage / décélération = 0, 32 ° C.
  12. Préparer une solution de TCM avec 50 UI / ml de rhIL-2. Par exemple, préparer une solution en ajoutant 200 MTC 10000 UI rhIL-2. Ajouter 1 ml de rhIL-2 / TCM de chaque puits après centrifugation.
  13. Culture pendant une nuit à 37 ° C dans 5% de CO2.

6. RCA cellules T Culture et récolte

Jours 3 et 4:

  1. Si les cellules T atteindre> 80% de confluence, les cellules peuvent être divisés (cela se produit généralement après 3 jours ou 4 jours). Pour diviser les cellules, pipeter doucement monter et descendre dans chaque puits 2-3 fois, et passer de 1 ml de chaque puits dans de nouveaux puits d'une 24 puits de culture tissulaire nouvelle plaque traitée. Ensuite, ajoutez 1 ml de TCM frais avec 50 UI / ml d'IL-2 à chaque puits de telle sorte que le volume final est de 2 ml dans tous les puits.
  2. Si les cellules ne parviennent pas à> 80% de confluence, effectuez un changement moitié de médias par pipetage lentement 1 ml de milieu du haut de chaque puits. Évitez disturbing cellules installées sur le fond tout en enlevant les médias. Ajouter 1 ml de TCM frais contenant 50 UI / ml rhIL-2.

Jour 5:

  1. Resuspendre les cellules T CAR par pipetage doucement monter et descendre trois fois dans chaque puits et transférer dans un tube de centrifugeuse de 250 ml. Spin cellules à 300 g pendant 10 min.
  2. Aspirer le surnageant sans déranger culot. Laver une fois avec du PBS, compter les cellules comme décrit précédemment, et laver avec du PBS une seconde fois. Un rendement typique CAR de cellules T est d'environ 1 x 10 6 cellules par puits (8 plaques de cellules x 24 puits = 192 x 10 6 CAR T).
  3. Resuspendre les cellules dans du PBS à une concentration de 5 x 10 7 / ml pour une injection de 1 x 10 7 dans un volume de 200 pg (par exemple, de 192 x 10 6 cellules CAR T, remettre en suspension lavé le culot dans 3,84 ml de PBS).

7. CAR T administration de cellules à des souris porteuses de tumeurs

Jour 5:

  1. Transport cellules sur la glace à l'animalerie pour l'injection intraveineuse. Charge 500-1000 ul dans l'insuline seringue avec 27-31 aiguille G, assurant que toutes les bulles sont expulsés.
  2. Prenez une souris à la base de la queue et placer dans un limiteur de tube.
  3. Tirez la queue tendue avec la veine vers le haut, et glisser l'aiguille d'environ 1-2 mm sous la peau dans la veine en l'insérant parallèle à la veine de la queue. Lentement expulser 200 pi dans la veine. Si l'aiguille est correctement inséré dans la veine, le volume facilement circuler dans; sinon il y aura résistance et l'aiguille devra être retiré de la queue et ré-inséré correctement.

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Résultats

cellules T CAR sont générés par transduction avec le vecteur rétroviral EGFRvIII CAR 11. Ce vecteur, MSGV1, a été développé à partir du vecteur SFGtcLuc_ITE4 35, qui contient le virus de cellules souches murines (MSCV) longs Les répétitions terminales, la région de gag et enveloppe site d'épissage prolongée (donneur d'épissage, sd, et accepteur d'épissage, SA), et virale signal d'emballage (ψ). Le CAR EGFRvIII contenant la chaîne unique fragment humaine anti-EGFRvIII variable (scFv)...

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Discussion

Le calendrier de traitement décrit ici a été conçu pour modéliser norme clinique de soins et de tirer parti de ses effets pour la RCA thérapie adoptive. T doses CAR cellulaires, schémas TMZ, et l'administration de la radiothérapie peuvent être modifiés pour améliorer l'activité in vivo des cellules T, lymphodepletion, et le meurtre de la tumeur. TMZ schémas peuvent être augmentés pour obtenir myéloablation hôte et une expansion accrue des cellules adoptive transférés 30. En outre, les effets ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier la Dre Laura Johnson et le Dr Richard Morgan d’avoir fourni la construction rétrovirale CAR. Les auteurs remercient également Giao Ngyuen pour son aide à la dosimétrie pour l’irradiation du cerveau entier. Ce travail a été soutenu par une subvention NIH NCI 1R01CA177476-01.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Vecteur d’emballage du rétrovirus pCL-EcoImgenex10045PVecteur auxiliaire pour la génération du rétrovirus CAR
Concanavalin ASigma AldrichC2010Mitogène non spécifique pour induire la prolifération des lymphocytes T et la transduction virale
RétronectineClonTech/TakaraT100BFacilite la transduction rétrovirale des lymphocytes T
Lipofectamine 2000Life Technologies11668-019Réactif de transfection
DMEM, hyperglycémie, pyruvateLife technologies11995-065Milieux de culture HEK293
RPMI 1640Life Technologies11875-093Milieux de culture de cellules T
Opti-MEM I Reduced Serum MediumLife technologies11058-021Milieux de transfection
200 mM L-GlutamineLife technologies25030-081Supplément de milieux de culture de cellules T
100 mM Pyruvate de sodiumLife technologies11360-070Supplément de milieux de culture de cellules T
100X MEM Non-Essential Amino Acids SolutionLife technologies11140-050Supplément de milieux de culture de cellules T
55 mM 2-MercaptoethanolLife technologies21985-023Agent réducteur pour éliminer les radicaux libres
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/ml)Life technologies15140-122Supplément de milieux de culture de cellules T
Gentamicine (50 mg/ml)Life technologies15750-060Supplément de milieux de culture de cellules T
GemCell U.S. Origin Fetal Bovin SerumGemini Bio Products100-500Fournit des facteurs de croissance et des nutriments pour la croissance cellulaire in vitro
Albumine sérique bovine (BSA), Fraction V&ndash ; ProduitsGemini Bio700-100PBloque la liaison non spécifique du rétrovirus aux plaques recouvertes de rétronectine
Pharm Lyse (concentré 10x)BD Biosciences555899Lyses les globules rouges pendant le traitement des splénocytes
70 &mu ; m Passoires à cellules stérilesCorning352350Filtre les grosses particules de tissus pendant le traitement des splénocytes Boîtes
de culture BioCoat 100 mm avec Poly-D-LysineCorning356469Favorise l’adhésion cellulaire HEK293 pour maximiser la prolifération après transfection
[en-tête]
TémozolomideBest PharmatechN/APoudre lyophilisée préparée le jour de l’administration
Dimethyl SulfoxideSigma Life SciencesD2650Nécessaire à la dissolution complète du témozolomide
SalineHospiraIM 0132 (5/04)Solvant pour témozolomide et kétamine/xylazine
Ketathesia HClHenry Schein Animal Health11695-0701-1Solution de kétamine
AnaSedLloyd IncN/AXylazine solution stérile 100 mg/ml
de qualité standard

Références

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