Glaucome Expérimental induite par l'injection oculaire de microsphères magnétiques

Résumé

Nous présentons une méthode pour induire une pression intraoculaire élevée (PIO), en injectant des microsphères magnétiques dans l’œil du rat, pour modéliser le glaucome. Cela conduit à de fortes augmentations de pression et à une mort neuronale étendue. Ce protocole est facile à réaliser, ne nécessite pas d’injections répétées et produit des augmentations stables et durables de la PIO.

Résumé

Les progrès dans la compréhension de la physiopathologie et la fourniture de nouveaux traitements pour le glaucome dépendent de bons modèles animaux de la maladie. Nous présentons ici un protocole d’élévation de la pression intraoculaire (PIO) chez le rat, en injectant des microsphères magnétiques dans la chambre antérieure de l’œil. L’utilisation de particules magnétiques permet à l’utilisateur de manipuler les billes dans l’angle iridocornéen, fournissant ainsi un blocage très efficace de l’écoulement du fluide du réseau trabéculaire. Cela conduit à des augmentations durables de la PIO, et finalement à la mort neuronale dans la couche de cellules ganglionnaires (GCL) ainsi qu’à une pathologie du nerf optique, comme on le voit chez les patients atteints de la maladie. Cette méthode est simple à réaliser, car elle ne nécessite pas de machines, de compétences chirurgicales spécialisées ou de nombreuses heures de pratique pour se perfectionner. De plus, les élévations de pression sont très robustes et la réinjection des microsphères magnétiques n’est généralement pas nécessaire, contrairement à certains autres modèles utilisant des billes de plastique. De plus, nous pensons que cette méthode convient à l’adaptation à l’œil de la souris.

Introduction

Glaucome primaire est une maladie oculaire dévastatrice qui touche environ 60,5 millions de personnes dans le monde ^1, qui peut conduire à modifier la vie perte de vision et la cécité ^2. La recherche sur les mécanismes de la maladie, et le développement de nouveaux traitements pour le glaucome, sont tributaires de bons modèles de la maladie qui récapitulent certaines des caractéristiques de la pathologie.

Nous présentons ici un modèle de glaucome de rat selon la méthode des Samsel et al. ³ L'objectif global de cette technique est d'augmenter la pression intraoculaire (PIO) dans l'oeil en injectant microsphères magnétiques dans la chambre antérieure, et en utilisant un anneau magnétique, directe les dans l'angle iridocornéen. Cela empêche l'écoulement aqueux, ce qui augmente la PIO, conduisant à des lésions neuronales et la perte de cellules. Le protocole a été mis au point pour tenter de fournir un modèle simple inductible du glaucome.

Ce protocole peut avoir certains avantagespar rapport aux techniques existantes. Des modèles de souris génétiques tels que la souris DBA / 2J sont disponibles, qui ne nécessitent pas de procédures d'ouverture; cependant ceux-ci peuvent avoir une apparition aléatoire de progression de la maladie ^4. En revanche, les modèles inductibles, dont la plupart se appuient sur l'élévation de la PIO chez les rongeurs chirurgicalement, ont l'avantage que l'initiation peut être commandé par l'utilisateur. Certaines de ces méthodes peuvent avoir des inconvénients de leur propre cependant, notamment en étant techniquement difficile ^5, et peut nécessiter plusieurs procédures pour maintenir une PIO élevée ^6.

En revanche, la méthode inductible détaillé dans ce manuscrit est une technique simple, efficace et reproductible qui produit stables, de fortes hausses de la pression, avec un besoin minimum de réinjection. En outre, il ne se agit pas de matériel coûteux, et ne exige des compétences chirurgicales de base à effectuer. Ce protocole peut être approprié pour les lecteurs qui cherchent à mettre en place un inductible exigeante techniquement moinsmodèle de glaucome dans leur laboratoire.

Protocole

Déclaration éthique: Toutes les expériences animales ont été menées en conformité avec le Comité soin et l'utilisation institutionnelle des animaux (IACUC), et ont été approuvés en accord avec les lignes directrices Royaume-Uni du Home Office ( http://goo.gl/FLkirW , dernier accès 10 ^ème Juin , 2014) et la Déclaration ARVO pour l'utilisation d'animaux dans ophtalmique et Vision Research ( http://goo.gl/4LFOjD , dernier accès 10 ^ème Juin, 2014).

1. hypertension oculaire induction

1. Provoquer le glaucome expérimental par élévation de la pression intra-oculaire (PIO) par injection unilatérale de microsphères paramagnétiques dans la chambre antérieure de rats Brown Norway, basée sur la méthode de Samsel et al. ³ autres rats pigmentés peuvent convenir, mais ceux-ci devront être validé d'abord par l'utilisateur.
2. Maison 250-300 g femmerats ex-éleveur Brown Norway dans un environnement de faible luminosité constante (40-60 lux) pour minimiser les fluctuations de la PIO diurne ^7, avec accès à la nourriture et de l'eau ad libitum.
3. Prendre des mesures de la PIO de base chez les animaux éveillés ⁸ avant l'anesthésie et l'injection de billes, en utilisant un tonomètre à rebond calibré pour une utilisation dans l'oeil de rat ^neuf. IOP est prise comme la moyenne de cinq mesures.
4. Anesthésier les rats avec 37,5 mg / kg de kétamine et 0,25 mg / kg de chlorhydrate de médétomidine délivré par voie intraperitoneale. Confirmez profondeur de l'anesthésie en testant les réflexes des pieds arrière de l'animal, avant l'application d'iode povidone (voir l'étape 1.5), et l'injection de talon (voir l'étape 1.8). Administrer 0,5% de chlorhydrate de proparacaïne pour l'analgésie.
   NOTE: Ne pas dilater la pupille à tout moment. Cela aidera les perles se déposer dans l'angle irido-cornéen, et empêcher la fixation de l'objectif. Appliquer une pommade oculaire pour éviter le dessèchement de la cornée sur l'oeil controlatéral non opéré.
5. Wcendres l'oeil opérationnelle avec 5% de povidone iode dans de l'eau ¹⁰ 5 min avant l'injection.
6. Après 5 min, évacuer l'iode povidone hors utilisant gaze stérile, et laver les yeux avec 0,9% de solution saline stérile. Gardez l'œil humide pendant l'anesthésie avec l'application régulière de solution saline stérile.
7. Placez un aimant toroïdal autour de l'œil.
8. Injecter 25 ul d'une solution contenant 30 mg / ml de gamma-irradiation stérilisé 8 um microsphères magnétiques dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) dans la chambre antérieure, à l'aide d'une aiguille biseautée 33 G.
   1. Pour préparer perles, laver à la re-suspension, puis centrifugation 3 fois à 10 000 g pendant 5 min avec 1 ml de HBSS, avant de faire le / solution finale de 30 mg ml. Maintenir des conditions stériles à travers.
   2. Pour l'injection, être prudent pour éviter d'insérer l'aiguille à l'iris, afin de minimiser le risque de traumatisme iris. Ceci peut être évité en orientant l'aiguille tangent à la surface de la cornée, comme parallèle àl'iris que possible. Cela permettra également de minimiser la perte de perles à partir du site d'injection.
      NOTE: Injecter perles à un rythme rapide pour assurer une distribution uniforme autour de l'angle iridocornéen, qui est essentiel pour élever la PIO. De plus, des billes de magasin, les aiguilles et les anneaux magnétiques séparément de sorte que les billes ne forment pas des grappes, ce qui les rend difficiles à charger dans la seringue et l'injection, et l'aiguille ne devient pas magnétisée.
9. Laissez l'aiguille en place pendant 1 min après l'injection pour se assurer que les perles se installent dans l'angle iridocornéen à entraver le drainage aqueuse du trabéculum. Légèrement angle l'aiguille après les perles ont d'abord installés pour permettre une fuite d'une solution aqueuse, de minimiser les augmentations transitoires de la PIO. A la fin de la chirurgie rincer l'aiguille à travers la première avec du tampon phosphate salin (PBS), puis 70% d'éthanol, puis de l'eau distillée, afin d'assurer l'utilisation continue de l'aiguille dans des procédures distinctes. Alternativement, on peut utiliseraiguilles jetables si la combinaison de la jauge et la seringue correcte est disponible. Facultatif: aiguilles peuvent être affûtées en utilisant un biseauteur de prolonger leur utilisation.
10. A ce stade, si nécessaire, retirer l'aimant, et l'utiliser pour en tirer des billes dans les zones de couverture incomplète.
11. Laissez l'aimant en place autour de l'œil pour une nouvelle post-injection de 10 min pour assurer perles se installent bien dans l'angle iridocornéen.
12. Anesthésie inverse en utilisant 0,25 mg / kg de chlorhydrate atipemezole.
13. Administrer le chloramphénicol, ou autre pommade antibiotique, par exemple la gentamycine ou la terramycine par voie topique pour prévenir l'infection, et le chlorhydrate de proparacaïne à 0,5% pour l'analgésie. Laissez les animaux de récupérer sur un tapis de chaleur jusqu'à ce qu'ils reprennent le mouvement, puis transfert à une boîte chaude et d'approvisionnement avec la nutrition supplémentaire, comme un complément alimentaire ou le régime alimentaire régulière imbibé jusqu'à la guérison est complète. Analgésie systémique ou local doit être administré à des animaux présentant des signes de douleur 24 heures après la chirurgie. Si these symptômes persistent malgré le traitement, les animaux doivent être abattus sans cruauté.
14. Utilisez l'oeil controlatéral comme un contrôle non opéré.
15. Effectuer des mesures de la PIO chaque 2-3 jours après l'administration de talon, et par la suite tous les 2-3 jours en utilisant un tonomètre à rebond étalonné pour être utilisé dans l'oeil de rat ^9.
16. Les critères d'inclusion des yeux dans les études peuvent être: 1) si la PIO est élevée au-dessus de la pression de commande controlatéral de 5 mmHg, et 2) ne dépasse pas 60 mmHg.
17. Yeux où la pression revient à la ligne de base (généralement en 1 semaine post-injection) ne devraient pas être inclus dans les études, cependant il est possible de réinjecter perles dans les yeux qui parviennent pas à développer une PIO élevée si désiré.
18. Euthanasier les animaux par asphyxie au _CO2 à la fin de l'expérience.
19. Disséquer les yeux et les nerfs optiques, et fixer paraformaldéhyde 4% (PFA) la nuit pour une analyse histologique.

2. Évaluation de la rétine Neuron Dommages Utilisation TUNEL STaining

1. Pour quantifier les cellules apoptotiques dans la montagne toute retinasuse le dosage désoxynucléotidyl transférase terminale médiation dUTP nick-étiquetage (TUNEL), selon les instructions du fabricant.
2. On dissèque la rétine de l'oeillère, pour laver 3 x 5 minutes dans 0,3% de Triton X-100 dans du tampon phosphate salin (PBS-T).
3. Perméabiliser le tissu dans 3% de T-PBS pendant 2 heures.
4. Pré-équilibrer rétines en tampon d'équilibration pendant 10 minutes, avant l'incubation dans une solution de réaction TUNEL pendant 1 heure à 37 ° C.
5. Laver le tissu pour 3 x 5 min dans 0,3% T-PBS, rincer à 0,3% T-PBS contenant 5 uM DAPI, et plate-monter dans les médias de montage.
6. Pour quantifier noyaux positifs TUNEL utilisent un microscope confocal à prendre 10 um z-piles à travers la couche de cellules ganglionnaires à 20X. Prendre trois images sur chacun des quatre pétales, sur des sites proches du nerf optique, dans la mi-périphérie, et à la périphérie loin de la rétine, ce qui donne un total de 12 images par moun ensemblet, échantillonnage environ 7000 cellules. Critères morphologiques non discrimination neuronale des cellules (endothéliales et des cellules gliales) à partir de cellules neuronales.
7. Certaines zones pour l'imagerie en utilisant uniquement le canal de DAPI, et les enquêteurs de masque à des groupes de traitement.

3. évaluer les dommages du nerf optique utilisant Bleu de Toluidine Coloration

1. Fixer nerfs optiques nuit dans une solution de Karnovsky à 4 ° C.
2. Traiter les échantillons pendant 2 heures à 1% (p / v) de tétroxyde d'osmium, puis déshydrater dans 100% d'éthanol.
3. Incuber nerfs optiques en oxyde de propylène pendant 30 min, et le placer dans un mélange 50:50 d'oxyde de propylène: nuit araldite.
4. Modifier cette solution à 100% araldite, suivie d'une incubation pendant une nuit à 60 ° C.
5. sections coupées semithin (0,75 mm d'épaisseur) et tache avec 1% toluidine bleu / borax (TB) dans 50% d'éthanol avant l'examen par microscopie optique.

4. Analyse statistique

1. Effectuer ana statistiqueslyse en utilisant un logiciel de statistiques appropriés. Une ANOVA à deux voies avec le test post-hoc de Newman-Keul peut être utilisée pour calculer la signification statistique pour la PIO change au fil du temps.
2. Une valeur de p inférieure à 0,05 peut être considéré comme significatif.

Résultats

L'injection de billes magnétiques dans l'angle iridocornéen systématiquement induit une hausse prolongée et robuste de la pression (Figure 1), qui était facilement observable au premier point de temps, trois jours après l'injection. En outre, l'augmentation de la pression a été maintenue pendant toute la durée de l'expérience, et bien que notre cours de temps a fini à 18 jours post-injection, d'autres ont signalé que la pression persiste à long terme ^3. La PIO moyenne en moyenne sur toute la longueur de l'expérience pour le contrôle, les yeux non-perles-injectés était de 19,7 ± 0,3 mmHg, comparativement à 40,5 ± 2,8 mmHg pour les yeux de perles-injecté (P <0,001). En outre, le pic est passé de la PIO 22,8 ± 0,3 mmHg à 49,9 ± 2,3 mmHg.

Pour déterminer si l'élévation de la PIO conduit à la mort des cellules ganglionnaires de la rétine, nous avons effectué une coloration TUNEL sur des rétines, et l'histologie sur des sections transversales des nerfs optiques (figure 2). Dans la rétine nous avons observé une augmentation de la coloration TUNEL (figure 2A) dans les yeux de talon injecté avec une PIO élevée. Le nombre de noyaux apoptotiques a augmenté d'environ 15 fois, de 1,6 ± 0,5 dans des cellules témoins controlatéraux, à 24,5 ± 0,5 cellules de rétines hypertendus (Figure 2B, p <0,05). En outre, dans les yeux, dans lequel des billes magnétiques ont été injectés mais la pression ne ont pas augmenté (probablement en raison de l'obstruction incomplète de l'angle iridocornéen), le nombre de cellules TUNEL-positives ne étaient pas significativement différentes de celles des contrôles non-injecté (P> 0,05). Cela donne à penser que la mort cellulaire est liée à la pression augmente, pas en raison de la toxicité directe des microsphères magnétiques. Enfin, nous avons étudié la pathologie du nerf optique dans le modèle de glaucome, et vu accumulation de bleu de toluidine dans de nombreux axones, ce qui indique une dégénérescence de ces processus cellulaires (figure 2C).

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Figure 1. L'élévation de la pression intra-oculaire en utilisant des microsphères magnétiques. Injection de microsphères magnétiques dans la chambre antérieure a induit une robuste augmentation significative de la pression intraoculaire (PIO) par rapport au contrôle controlatéral, les yeux non-injecté. Unités de l'axe Y = millimètres de mercure (mmHg). Données = moyenne ± SEM. * = P <0,001; N = 12. Ce chiffre a été modifié depuis Foxton et al, Am.. J. Pathol 182 (4):. 1379-1390.

Figure 2. L'élévation de la PIO par injection de microsphères magnétiques dans l'angle irido-cornéen, la mort neuronale induite dans la couche de cellules ganglionnaires (GCL). (A) des images représentatifs de rétines de contrôle (à gauche) et le glaucome (à droite) yeux colorés pour les noyaux apoptotiques par TUNEL (vert;flèches blanches) et DAPI (bleu), indiquant le nombre de noyaux apoptotiques augmenté que PIO Rose. (B) Quantification des cellules positives TUNEL dans le GCL, montrant que les yeux avec une PIO élevée (au milieu), avaient des cellules beaucoup plus apoptotiques en comparaison le contrôle (à gauche). En revanche, dans les yeux de perles injecté où la pression ne monte pas (à droite), a été observé aucune augmentation significative de la coloration TUNEL. Données = moyenne ± SEM. * = P <0,05; N = 7-8 (C) des images représentatives de la coloration du nerf optique, démontrant une augmentation de l'accumulation bleu de toluidine (flèches noires) dans les axones endommagés de glaucome (à droite), mais pas contrôler yeux (à gauche).. Barres d'échelle = 50 um. Ce chiffre a été modifié depuis Foxton et al., Am. J. Pathol 182 (4):. 1379-1390.

Discussion

Nous démontrons ici un procédé pour induire une élévation de la PIO chez le rat, par injection de microsphères magnétiques dans la chambre antérieure de l'oeil. Cette méthode est simple à réaliser et nécessite peu d'expertise chirurgicale, ou les heures de pratique et de raffinement. En outre, la procédure est efficace; rarement nécessitant plus d'une injection unique de perles pour induire une forte hausse robuste de la pression (taux de réinjection d'environ 10%). Cela peut fournir un avantage par rapport aux méthodes existantes inductibles, tels que la veine episceral techniquement difficile sclérose ¹¹ modèle, ou un laser de photocoagulation protocole ^6, qui peut nécessiter plusieurs procédures pour maintenir soulevées PIO.

Pour la méthode pour réussir cependant, il ya quelques petites étapes critiques qui doivent être prises. Tout d'abord, il est utile d'utiliser un aimant de forme toroïdale de tirer des billes dans l'angle irido-cornéen. Cette étape est une modification du protocole d'origine, where les billes ont été injectées dans la chambre antérieure, puis déplacé à main levée autour de l'œil ^3. Utilisant un aimant toroïdal signifie que microsphères doivent régler uniformément autour de l'angle, ce qui nécessite une redistribution manuelle minimale. Deuxièmement, le taux d'injection doit être rapide - trop lent et les perles sera principalement accumuler sur un côté de l'angle, conduisant à une couverture incomplète, et potentiellement pas d'augmentation de la pression. D'une manière générale cependant, le procédé est assez simple que l'utilisateur puisse facilement faire des modifications du protocole, comme la variation de la taille ou le volume des particules de microsphères, peut-être pour tenter de modifier le degré d'élévation de la PIO.

Cependant, un inconvénient potentiel de la méthode est que l'on a peu de contrôle sur l'étendue de la l'hypertension, qui à environ 5-10% des cas que nous avons observés a augmenté de plus de 60 mmHg. Hausses excessives des PIO peuvent être très destructeur pour le tissu de la rétine, et peuvent faire l'étude des mécanismes et biologie de la mort cellulaire contester. Cependant, le procédé produit une pathologie neuronale cohérente, à la fois dans la rétine et du nerf optique, qui peut être manipulé ¹² pharmacologiquement. Cela peut rendre le modèle attractif pour le développement de nouvelles thérapies pour traiter le glaucome. En outre, parce que les billes sont dirigés dans l'angle irido-cornéen, ce qui laisse libre l'axe visuel pour l'imagerie en temps réel du disque optique ou de la rétine. Nous prévoyons que ce modèle sera adapté et utilisé pour des applications futures dans d'autres espèces, y compris les souris.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
250 - 300g femelle Brown Norway ex-reproducteur rats	Harlan UK	203
Tonolab Tonometer Rebound	Tiolat	TV02
Ketaset (kétamine)	Fort Dodge Santé animale	BN1000118	37,5 mg/kg
Domitor (chlorhydrate de médétomidine)	Orion Pharma	140-999	0,25 mg/kg
Povidone iodée	Ecolab	BN4369LE10	5 % dans H2O
Solution saline	de Minim Bausch and Lomb	PL00033/5017
Aimant toroïdal	Supermagnete	R-10-07-03-N
Microsphères magnétiques Bangs	Laboratories	UMC4N/9692
HBSS	Invitrogen	14025
33 G aiguille biseautée	Hamilton	7747-01
Seringue à pointe Luer à aiguille	Hamilton	80601
Antisedan (chlorhydrate d’atipémézole )	Orion Pharma	141-003	0,25 mg/kg
Pommade au chloramphénicol	Medicom	18956-0005
Kit de coloration TUNEL	Promega	G3250
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Vectashield support de montage	Vector Labs	H-1000