Utilisant une impédance Cell-substrat et imagerie de cellules vivantes pour mesurer les changements en temps réel dans adhésion cellulaire et De-adhérence induites par Matrix Modification

Résumé

Ici, nous présentons un protocole de quantifier en permanence les processus d'adhésion cellulaire et de-adhésion avec haute résolution temporelle d'une manière non-invasive par l'impédance cellulaire substrat et imagerie des cellules vivantes analyses. Ces approches révèlent la dynamique des processus adhésion cellulaire / de-adhérence déclenchées par modification de la matrice et de leur relation temporelle à des événements de signalisation adhérence dépendant.

Résumé

L'adhérence cellule-matrice jouent un rôle clé dans le contrôle de la morphologie cellulaire et de signalisation. Les stimuli qui perturbent l'adhérence cellule-matrice (par exemple, la myéloperoxydase et d'autres oxydants de matrice modificateur / enzymes libérées au cours de l'inflammation) sont impliqués dans le déclenchement des changements pathologiques dans la fonction cellulaire, le phénotype et la viabilité dans un certain nombre de maladies. Ici, nous décrivons comment impédance cellule-substrat et les approches d'imagerie des cellules peuvent être facilement utilisés pour quantifier avec précision les changements en temps réel dans l'adhésion cellulaire et de-adhérence induite par modification de la matrice (en utilisant des cellules endothéliales et myéloperoxydase comme un stimulus de matrice modifier physiopathologique) avec une résolution temporelle élevée et d'une manière non-invasive. Le système de l'impédance cellule-substrat xCELLigence quantifie en continu la zone d'adhérence cellule-matrice, en mesurant l'impédance électrique à l'interface cellule-substrat dans les cellules cultivées sur des réseaux de microélectrodes or. L'analyse des images du time-lapse différenLes films tiel de contraste d'interférence de quantifier l'évolution de la surface projetée de cellules individuelles dans le temps, représentant les changements dans la zone de contact cellule-matrice. Les deux techniques de quantifier avec précision les changements rapides aux processus d'adhésion cellulaire et de-adhérence. Impédance Cell-substrat sur les tableaux de microélectrodes biocapteurs fournit une plate-forme pour des mesures robustes, à haut débit. Analyse imagerie des cellules vivantes fournir des détails supplémentaires concernant la nature et la dynamique des changements morphologiques quantifiés par des mesures d'impédance cellule-substrat. Ces approches complémentaires fournissent de précieuses informations sur la façon dont la modification oxydative myéloperoxydase catalysée subcellulaires composants de la matrice extracellulaire déclenche des changements rapides dans l'adhésion cellulaire, la morphologie et de signalisation dans les cellules endothéliales. Ces approches sont également applicables pour l'étude de la dynamique d'adhésion cellulaire en réponse à des stimuli autres modificateurs de matrice et des cellules adhérentes connexes (par exemple, des cellules épithéliales).

Introduction

Adhésives contacts stables entre les cellules et leur matrice extracellulaire environnante sont nécessaires pour le maintien de l'homéostasie tissulaire. Par exemple, l'adhésion des cellules endothéliales à la matrice sous-endothéliale dans les vaisseaux sanguins joue un rôle critique dans le maintien de l'intégrité de la couche endothéliale et sa fonction de régulation homéostatique comme une barrière semi-perméable vasculaire ^1. Le cytosquelette d'actine est mécaniquement couplé à l'adhésif molécules de la matrice sur les sites d'adhérence cellule-matrice et des contacts d'adhésif à l'interface cellule-matrice jouent un rô....

Protocole

1. Généralités cellules endothéliales Culture

1. Culture des cellules bovines endotheliales aortiques (passages 4-9) sur des flacons de culture tissulaire revêtues de gélatine (couche de surface de culture de tissu avec 0,1% p / v de gélatine dans du PBS à température ambiante pendant 15 min) dans EGM-2 médias (à l'EGM-2 balle Kit contenant 5% de sérum bovin foetal, des facteurs de croissance et tous les suppléments fournies par le fabricant, à l'exception de l'hydrocortisone).
2. Lorsque les cellules sont confluentes à court (environ 3 jours après le semis, après une 1: split 4), la récolte des cellules par traitement avec 0,05% p / v de t....

Résultats

Quantification en temps réel des cellules endotheliales de-adhérence de fibronectine, en réponse à l'oxydation de la fibronectine MPO médiée (Expérience 2). L'ensemencement des suspensions de cellules endotheliales sur native (MPO libre) fibronectine ou MPO portant les résultats de la fibronectine dans l'attachement cellulaire maximale et d'étalement moins de 2 heures, tel que jugé par un plafonnement des valeurs d'index de cellule de la mesure de l'impédance du substrat cellulai.......

Discussion

L'adhérence cellule-matrice et processus de-adhérence peuvent être quantifiés avec précision en temps réel avec une haute résolution temporelle utilisant une impédance cellulaire substrat et imagerie des cellules vivantes analyses. Ces approches en temps réel fournissent un avantage majeur sur les analyses point final de l'adhésion cellulaire, qui fournissent une mauvaise résolution temporelle. En quantifiant avec précision rapides réponses de-adhésion avec haute résolution temporelle, ces analyses peuvent fourn.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réseau de microélectrodes d’impédance cellule-substrat en or à 96 puits	ACEA Biosciences / Roche	E-Plate 96	plaque à usage unique utilisée pour la réalisation d’essais cellulaires sur le système xCELLigence
blebbistatine	Sigma	B0560	inhibiteur sélectif de la myosine non musculaire-II
Cellules endothéliales aortiques bovines, cryoconservées  ;	Lonza	BW-6001
Albumine sérique bovine	Sigma	05470
EGM-2 BulletKit	Lonza	CC-3162	Kit de milieu de croissance cellulaire endothéliale
Fibronectine, poudre lyophilisée	Sigma	F-4759	à partir de plasma bovin
Fluorodish 35 mm Boîte de culture cellulaire à fond de verre	World Precision Instruments	FD35-100	Boîte de cuture cellulaire avec fond en verre de qualité optique pour l’imagerie
Gélatine de peau de bovin	Sigma	G9391	substrat de culture cellulaire
Hank’s Balanced Salt Solution	Life Technologies	14025076
Peroxyde d’hydrogène	Merck	107298
Medium-199	Life Technologies	11150-059	Milieu cellulaire sans sérum
Méthionine	Sigma	M9500	éteint les oxydants chlorants générés par la myéloperoxydase
, la myéloperoxydase, les leucocytes polynucléaires humains	Millipore	475911
RTCA MP Instrument / xCELLigence système d’impédance de substrat cellulaire	ACEA Biosciences / Roche		Se compose d’un analyseur RTCA, d’une station MP RTCA (plaques multiples) et d’une unité de contrôle RTCA
Trypsine-EDTA (0,5 %)	Gibco	15400-054  ;