Un protocole permettant de coupler de manière covalente une grande variété de molécules uniques sur une pointe AFM est présenté. Des procédures et des exemples pour déterminer la force d’adhésion et l’énergie libre de ces molécules sur des supports solides et des bio-interfaces sont fournis.
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Article de méthode
Enquête molécule unique adhérence par force atomique Spectroscopie
Dans cet article
Résumé
Résumé
La spectroscopie de force atomique est un outil idéal pour étudier des molécules sur des surfaces et des interfaces. Un protocole expérimental pour coupler une grande variété de molécules simples de manière covalente sur une pointe d'AFM est présenté. Dans le même temps la pointe AFM est passive pour prévenir les interactions non spécifiques entre la pointe et le substrat, qui est une condition préalable pour étudier molécules simples attachés à la pointe de l'AFM. Analyses pour déterminer la force d'adhérence, la longueur d'adhérence, et l'énergie libre de ces molécules sur des surfaces solides et bio-interfaces sont peu présentés et références externes pour davantage de lecture sont fournis. molécules d'exemple sont les polytyrosine poly (acides aminés), le polymère greffé PI g -PS et la POPE phospholipide (1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine). Ces molécules sont désorbés de surfaces différentes, comme CH 3 -SAMs, l'hydrogène fin diamant et soutenus bicouches lipidiques dans diverses conditions de solvant. Enfin, laavantages de la force spectroscopiques expériences de molécules simples sont discutés comprenant des moyens pour décider si vraiment une seule molécule a été étudié dans l'expérience.
Introduction
Au cours des 30 dernières années, la microscopie à force atomique (AFM) se est avérée être une technique d'imagerie précieux pour étudier biologiques 1,2 synthétiques et des matériaux et des surfaces 3, car il fournit une résolution spatiale moléculaire dans les trois dimensions et peut être utilisé dans divers solvant environnements. En outre, la force de molécule spectroscopie AFM-unique (SMFS) permet de mesurer des forces allant de la PN μN régime et a donné un aperçu sans précédent par exemple dans le repliement des protéines 4,5, la physique des polymères 6-8, et seule interaction molécule-surface 9 - 12....
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Protocole
REMARQUE: Voir la Figure 2 pour un aperçu du flux de traitement comprenant la préparation, l'acquisition des données et d'analyse de données étapes.
1. Réactif Setup
REMARQUE: Tous les produits chimiques doivent être manipulés avec soin, et donc une blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de protection devraient être utilisées. Toutes les opérations doivent être effectuées dans une hotte de laboratoire. En particulier, des gants spéciaux doivent être portés en cas d'utilisation de chloroforme.
- Utiliser des produits chimiques avec faible teneur en eau tel que le ....
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Résultats
Dans ce qui suit, les résultats décrits ci-dessus pour l'exemple des molécules, à savoir la polytyrosine polymères poly (acide aminé), le polymère greffé PI g -PS et la POPE phospholipide, sont présentés. Première pour chaque exemple, expérimenter des détails spécifiques pour l'acquisition des données et la préparation des données sont fournies. Ensuite, les résultats exemplaires pour des expériences où ces molécules ont été désorbé de surfaces différentes (CH 3 -SAMs, hydrogène fin diamant e.......
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Discussion
Durant les dernières décennies, des expériences de molécules simples ont donné un aperçu sans précédent sur les mécanismes moléculaires et se est avéré être une approche précieuse en sciences de la vie et au-delà. Pour obtenir de bons et significatives expériences statistiques de SMF, idéalement une seule et même molécule est utilisée sur toute la durée de l'expérience. Contrairement aux expériences avec des ensembles de molécules, des expériences SMF sont capables de détecter des événements rares et états moléculai.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Les auteurs remercient la DFG (Hu 997/2-2) pour son soutien financier. FS prend acte de la Hanns-Seidel-Stiftung (HSS). SKr a été soutenu par l’Elitenetzwerk Bayern dans le cadre du programme de doctorat en science des matériaux des interfaces complexes. SKi remercie le SFB 863 pour son soutien financier.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Matériaux | |||
| Hellmanex III concentré liquide alcalin (solution détergente) | Hellma | ||
| RCA (eau ultrapure, peroxyde d’hydrogène (35 %), ammoniac (32 %) ; 5:1:1(v/v/v))Réactif | Sigma | ||
| Vectabond / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Vectorlabs | ||
| Acétone sèche (< 50 ppm H< sub>2O) | Sigma | ||
| Chloroforme sec (> 99,9 %) | Sigma | ||
| Triéthylamine | Sigma | ||
| Eau ultrapure | Biochrom, Allemagne | ||
| Tétraborate de disodium (> ; 99,5 %) | Biochrom, Allemagne | ||
| Acide borique | Biochrom, Allemagne | ||
| Monofonctionnel &alpha ;-méthoxy-&oméga ;-NHS PEG, 5 kDa, " méthyl-PEG-NHS" | Rapp, Allemagne | ||
| Hétérobifonctionnel &alpha ;,&omega ;-bis-NHS PEG, 6 ; kDa, " NHS-PEG-NHS" | Rapp, Allemagne | ||
| Hétérobifonctionnel &alpha ;-maléimidohexanoïque--oméga ;-NHS PEG, 5 kDa, " Mal-PEG-NHS" | Rapp, Allemagne | ||
| Molécule de sonde (polymère, lipide, etc.) | |||
| Equipment | |||
| Quantité suffisante de boîtes de cristallisation en verre avec bec (10 ; ml), boîtes de Pétri en verre (500 µ ; l) et couvercles en verre | VWR International GmbH, Allemagne | ; ; ; ; ; ; | |
| [en-tête] | |||
| Four de laboratoire modèle UF30 | Memmert, Allemagne | ||
| Sonicateur à température contrôlée | VWR International GmbH, Allemagne | ||
| Système plasma « Femto », 100 W | Diener, Allemagne | ||
| Une seringue en verre séparée pour chaque solvant organique | VWR International GmbH, Allemagne | ||
| Vortex mélangeur | VWR International GmbH, Allemagne | ||
| Tubes de microcentrifugation (0,5 ml ou 1,5 ml) | Pipettes Eppendorf | ||
| : 10-100 µ ; l, 50-200 et micro ; l et 100-1 000 ; et micro ; l | Eppendorf | ||
| AFM avec cellule fluide à température contrôlée (par exemple MFP-3D avec BioHeater) | Asylulm Research, Santa Barbara | ||
| Soft SiN cantilevers cantilevers, généralement fabriqués à partir de nitrure de silicium (SiN) (constante de ressort inférieure à 100 pN/nm, par exemple MLCT) | Bruker AXS, Santa Barbara |
Références
- Scheuring, S., Sapra, K., Müller, D. Probing Single Membrane Proteins by Atomic Force Microscopy. Handbook of Single-Molecule Biophysics. , 449-485 (2009).
- Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy.
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Réimpressions et autorisations
