Enquête molécule unique adhérence par force atomique Spectroscopie

Résumé

Un protocole permettant de coupler de manière covalente une grande variété de molécules uniques sur une pointe AFM est présenté. Des procédures et des exemples pour déterminer la force d’adhésion et l’énergie libre de ces molécules sur des supports solides et des bio-interfaces sont fournis.

Résumé

La spectroscopie de force atomique est un outil idéal pour étudier des molécules sur des surfaces et des interfaces. Un protocole expérimental pour coupler une grande variété de molécules simples de manière covalente sur une pointe d'AFM est présenté. Dans le même temps la pointe AFM est passive pour prévenir les interactions non spécifiques entre la pointe et le substrat, qui est une condition préalable pour étudier molécules simples attachés à la pointe de l'AFM. Analyses pour déterminer la force d'adhérence, la longueur d'adhérence, et l'énergie libre de ces molécules sur des surfaces solides et bio-interfaces sont peu présentés et références externes pour davantage de lecture sont fournis. molécules d'exemple sont les polytyrosine poly (acides aminés), le polymère greffé PI g -PS et la POPE phospholipide (1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine). Ces molécules sont désorbés de surfaces différentes, comme CH ₃ -SAMs, l'hydrogène fin diamant et soutenus bicouches lipidiques dans diverses conditions de solvant. Enfin, laavantages de la force spectroscopiques expériences de molécules simples sont discutés comprenant des moyens pour décider si vraiment une seule molécule a été étudié dans l'expérience.

Introduction

Au cours des 30 dernières années, la microscopie à force atomique (AFM) se est avérée être une technique d'imagerie précieux pour étudier biologiques ^1,2 synthétiques et des matériaux et des surfaces ^3, car il fournit une résolution spatiale moléculaire dans les trois dimensions et peut être utilisé dans divers solvant environnements. En outre, la force de molécule spectroscopie AFM-unique (SMFS) permet de mesurer des forces allant de la PN μN régime et a donné un aperçu sans précédent par exemple dans le repliement des protéines ^4,5, la physique des polymères ^6-8, et seule interaction molécule-surface ^{9 - 12} .La raison d'étudier des molécules simples plutôt que d'un ensemble de molécules est d'éviter les effets qui masquent souvent des événements rares ou états moléculaires cachés moyenne. En outre, une multitude de paramètres moléculaires telles que la longueur du contour, la longueur Kuhn, l'énergie libre d'adhérence, etc., peuvent êtreobtenu. Ceci est détaillé dans les exemples ci-dessous. Dans une expérience typique AFM-SMFS, la molécule sonde est couplé à une pointe très fine par une molécule de liaison. L'embout lui-même est situé à l'extrémité d'un cantilever flexible. Si l'embout est mis en contact avec la surface de la molécule sonde va interagir avec cette surface. En observant la déviation du levier lors de la rétraction de la pointe, la force, et donc l'énergie libre, à détacher de la molécule de la surface peut être déterminé. Pour obtenir des statistiques significatives, un grand nombre de soi-disant courbes force-distance doivent être acquises. En outre, d'avoir de véritables expériences seule molécule (ce est à dire, en utilisant une seule et même molécule sonde sur la durée de l'ensemble de l'expérience) la molécule de la sonde doit être couplé de manière covalente à la pointe de l'AFM. Ici, un protocole expérimental pour la fonctionnalisation cantilever avec une seule molécule par l'intermédiaire d'une liaison covalente est présentée. La seule molécule peut être soit couplé par un amino ou un thiol Groupe à la pointe de l'AFM. Le procédé de conjugaison peut être effectuée dans une large variété de solvants organiques et aqueux () pour tenir compte des propriétés de solvatation des polymères utilisés.

Dans la première partie, un protocole général pour fixer de manière covalente une molécule unique ("molécule de sonde») via une molécule de liaison à une pointe d'AFM est décrit. À cette fin, NHS- organique ou maléimide-chimie est utilisé ^13. Avec le protocole de trois molécules d'exemple, le processus d'acquisition de données et d'analyse de données sont décrites et les références de lectures complémentaires sont fournis. Les exemples de molécules sont: le (linéaire) de la tyrosine de polymère, le polymère greffé PI g -PS et la POPE lipidique. Cela inclut de légères variations du protocole, par exemple pour fixer de manière covalente cystéines. En outre, une partie est consacrée à la préparation des surfaces différentes, comme une surface de diamant, un groupe CH ₃ -self-assemblé monocouche et les bicouches lipidiques. Ces interfaces ont proven être de bonnes références et des exemples.

Protocole

REMARQUE: Voir la Figure 2 pour un aperçu du flux de traitement comprenant la préparation, l'acquisition des données et d'analyse de données étapes.

1. Réactif Setup

REMARQUE: Tous les produits chimiques doivent être manipulés avec soin, et donc une blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de protection devraient être utilisées. Toutes les opérations doivent être effectuées dans une hotte de laboratoire. En particulier, des gants spéciaux doivent être portés en cas d'utilisation de chloroforme.

1. Utiliser des produits chimiques avec faible teneur en eau tel que le chloroforme sèche rapidement et de stockage à sec, mais pas plus d'une semaine. Stocker à la fois les produits chimiques à -20 ° C et sous atmosphère d'azote ou d'argon gazeux car APTES ((3-aminopropyl) triethoxysilan) (voir tableau 1) et PEG (polyéthylèneglycol) sont hygroscopiques et PEG est soumis à une oxydation à l'air.
2. Pour éviter l'exposition fréquente du stock à l'oxygène atmosphérique et de l'humidité, de préparer des aliquotes plus petites, idéalement au sein d'un système de boîte à gants en salle et d'azotere.

2. Installation du matériel

NOTE: Pour éviter la contamination croisée, utiliser des récipients frais et propre pour chaque étape.

1. Nettoyer la verrerie et des pinces dans une solution de détergent pendant 30 min dans un bain à ultrasons à 60 ° C.
2. Rincer et équipements de traitement par ultrasons de l'étape 2.1 deux fois avec de l'eau ultra-pure.
3. Matériel de chaleur provenant de l'étape 2.1 en solution RCA (eau ultra-pure, l'eau oxygénée et d'ammoniaque (5: 1: 1)) à 75 ° C dans un four pendant 45 min, puis les rincer avec de l'eau ultrapure.
4. Enfin, sécher la verrerie et pinces sous un courant d'azote sec ou dans un four (100 ° C, 3 h).

3. Conseil fonctionnalisation

REMARQUE: Utilisez une pince à épiler, navires, etc. en acier inoxydable, PTFE, verre ou tout autre matériau qui est chimiquement stable dans des solutions organiques le cas échéant. Sauf indication contraire, effectuer toutes les étapes à RT. La quantité de solution d'incubation nécessaire dépend du nombre de puces en porte à faux. Assurez-vous que les leviers sont immergés dans les solutions respectives à tous les temps.

REMARQUE: Utilisez une hotte pour éviter l'inhalation de vapeurs organiques.

1. Formation de groupes OH sur la surface de cantilever («d'activation») (environ 0,5 h):
   1. Utilisez des pinces pour placer frites fraîches cantilever (matériel: SiN, constants de printemps: 10-100 PN / nm) sur une lame de verre propre et les mettre dans une chambre à plasma (100 W).
   2. Évacuer chambre (~ 0,1 mbar).
   3. chambre de Flood avec du gaz d'oxygène et d'évacuer à nouveau.
   4. Activer le processus de plasma (puissance: 20%, durée: 15 min, la pression du procédé: 0,25 mbar).
2. Amino-silanisation des cantilevers (environ 1 h):
   1. Préparer les 2,5 ml de solution APTES (voir le tableau 1) dans une boîte de Pétri en verre - le faire idéalement pendant le processus de plasma.
   2. Immediately après le processus de plasma, chaque cantilever tremper pendant 1 sec dans de l'acétone et les placer immédiatement après, dans la solution d'APTES.
   3. Incuber pendant 15 min à température ambiante.
   4. Rincer soigneusement les copeaux de cantilever deux fois dans 10 ml d'acétone et une fois dans 10 ml de chloroforme.
   5. Finales étape facultative: puces place en porte à faux de l'étape précédente sur une lame de verre propre et les faire cuire pendant 30 min à 70 ° C. Notez qu'il existe également des stratégies alternatives pour l'activation de surface, par exemple, le traitement UV ^12.
3. PEGylation (environ 2 h):
   REMARQUE: Effectuer les étapes 3.3.1-3.3.4 pendant amino-silanisation. NHS et groupes maléimide sont soumis à l'hydrolyse en milieu aqueux et le PEG lui-même est soumis à une oxydation à l'air. Par conséquent cadencement (notamment entre les étapes) est un paramètre critique. Reportez-vous à ¹³ pour plus d'informations.
   1. Préparer la solution de chloroforme (voir le tableau 1).
   2. Pour éviter la condensation, Chaleureux PEG saupoudre à TA avant d'ouvrir l'aliquote et en pesant le montant approprié.
   3. Pour le couplage de polymères ou de lipides avec des groupes amino, de résoudre séparément NHS-PEG-NHS (6 kDa) et la méthyl-NHS-PEG (5 kDa) dans la solution de chloroforme en les vortexant jusqu'à ce qu'ils soient complètement résolus. Reportez-vous au tableau 1 pour les concentrations.
      1. Alternativement. pour le couplage de polymères avec des groupes thiol résoudre séparément Mal-NHS- PEG et PEG-méthyl-NHS dans la solution de chloroforme.
   4. Mélanger les solutions selon les besoins pour ajuster un certain rapport entre le nombre de NHS- ou la maleimide- et les molécules de PEG à terminaison méthyle (typiquement 1: 500). On notera que le rapport idéal doit être déterminée de manière itérative à une série de cycles de préparation-expérimentation.
   5. Incuber puces en porte à faux dans la solution de PEG pendant 1 heure dans une atmosphère saturée en chloroforme pour empêcher l'évaporation du chloroforme.
4. Sonder la conjugaison molécule(> 1 h):
   NOTE: Dans le 3.4.1-3.4.3 suivante, trois exemples pour le couplage covalent de différentes molécules de sonde à la pointe de l'AFM sont décrits. Pour chaque molécule du protocole doit être ajusté. Note en outre, que dans l'exemple 1 et de 3-chimie NHS est utilisé que dans l'exemple 2, le polymère fonctionnalisé thiol PI- g -PS est couplé au PEG maléimide via la chimie. Pour plus de détails, voir ^14.
   1. Pour le poly (acide aminé) le poly-D-tyrosine (40-100 kDa)
      1. Dissoudre le polytyrosine conjugué molécule sonde dans 1 M de NaOH. Ajuster la concentration de 1 mg / ml.
      2. Remplacez le NaOH pour le tampon de borate de sodium (pH 8,1) en utilisant des colonnes de spin de dessalage (7 kDa MWCO) immédiatement avant la fonctionnalisation
      3. Rincer les leviers d'abord avec 5 ml de chloroforme, puis avec 5 ml d'éthanol et finalement avec 5 ml de tampon borate.
      4. Incuber les puces en porte à faux pendant 1 h dans la solution tampon de borate polytyrosine puis rincer avec un tampon borateet de l'eau ultrapure. Conserver dans l'eau ultra pure jusqu'à la mesure.
   2. Pour les polymères à squelette linéaire (polyisoprène, 119 kDa) ayant des chaînes latérales greffées (polystyrène, 88 kDa) ¹⁴
      1. Dissoudre le PI g -PS dans le chloroforme sec. Ajuster la concentration de la solution de conjugaison à 4 mg / ml.
      2. Rincer les cantilevers avec 5 ml de chloroforme et incuber pendant au moins 1 heure dans la solution de conjugaison.
      3. Rincer à nouveau dans 5 ml de chloroforme et de stocker dans le chloroforme dans un environnement saturé de chloroforme (pour éviter l'évaporation du chloroforme) jusqu'à ce que la mesure.
   3. Pour le pape lipidique
      1. Dissoudre PAPE dans le chloroforme sec. Ajuster la concentration à 20 mM.
      2. Rincer les cantilevers avec 5 ml d'éthanol et 5 ml d'eau ultrapure avant incubation des cantilevers pendant 1 heure dans la solution lipidique.
      3. Après incubation, rincer avec cantilevers 5 ml de chloroforme, 5 ml d'éthanol et 5 ml d'eau chaude ultra-pure (dans cet ordre) pour éliminer les molécules de la sonde non liée et de se débarrasser des résidus de chloroforme. Utiliser immédiatement conseils fonctionnalisés. Alternativement, les stocker dans le chloroforme jusqu'à ce que nécessaire.

Figure 1. (A) Schéma montrant le processus de fonctionnalisation de renseignements en utilisant l'exemple de la chimie NHS. Liaison (B) chimique utilisé pour fixer une molécule sonde à la pointe via un groupe amino. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

4. Préparation de Surface

1. monocouche auto-assemblées (SAM)
   NOTE: En surface pour le premier exemple, une monocouche auto-assemblée a été choisi. Reportez-vous à la littérature ¹⁵
2. Nettoyer les lames de verre avec une solution détergente, puis deux fois dans de l'eau ultra pure dans un bain à ultrasons pendant 30 min chacune. Puis, comme une étape de nettoyage supplémentaire, placez-les dans la solution RCA (voir l'étape 2.3) à 75 ° C pendant 15 min.
3. Enduire les lames avec 10 nickel chrome nm et 100 nm d'or dans une coucheuse à vide. Puis stocker dans le réfrigérateur et propre à nouveau dans la solution RCA directement avant l'étape suivante.
4. Incuber les lames de l'étape précédente en solution 1-dodecanthiol / éthanol 2 mM pendant 12 heures. Les groupes thiol se lient à la surface d'or et une monocouche auto assemble hydrophobe. Rincer les lames avec de l'éthanol et de l'eau ultra pure et sécher par un flux d'azote gazeux. Confirmer le caractère hydrophobe de la surface préparée avec des mesures d'angle de contact statique dans un goniomètre avec une caméra CCD ^10.

Hydrogène diamant terminé
NOTE: En tant que surface pour le deuxième exemple, un diamant à terminaison hydrogène a été choisi. La préparation de surface a été réalisée comme décrit précédemment ^16.

Soutenu bicouche lipidique
NOTE: Dans le dernier exemple, une surface soutenue bicouche lipidique (SLB) a été utilisé comme une surface. Pour obtenir une telle surface, une solution (0,1 mg / ml) de grandes vésicules unilamellaires (LUV) consistant en phospholipide de la POPC ont été formées par le procédé d'extrusion. Ensuite, 50 ul de la solution de LUV ont été placés sur une feuille de mica fraîchement clivé (A = 1 cm²) et incubées pendant 30 min. Enfin, la solution a été rincé avec 20 ml d'eau ultrapure. Voir ^17,18 pour une description détaillée de la préparation de SLBS.

5. Acquisition de données

NOTE: Pour les expériences, utiliser un AFM, qui offre la possibilité de mesurer dans les liquides. Les procédures d'acquisition de données et d'analyse des données sont applicables indépendamment du modèle AFM utilisé. En outre, dans certaines expériences, il est avantageux d'avoir la possibilité de contrôler la température dans la cellule liquide. Cantilever déviation a été détectée par le procédé de déviation du faisceau laser ^19. constantes de rappel ont été déterminées par la méthode ²⁰ de bruit thermique.

1. Insérez le cantilever fonctionnalisé dans un support de cantilever AFM qui est adapté à la mesure dans des liquides.
2. Mettez la surface (préparation, voir ci-dessus) doit être échantillonné en l'AFM et le couvrir avec du liquide. Les deux, en porte à faux et la surface devrait maintenant être immergé dans le liquide avec la pointe cantilever pointant vers la surface. A noter que dans de nombreux cas, une goutte de liquide est suffisante. Dans tous les cas, l'évaporation du liquide doit être évitée, par exemple en utilisant une cellule de fluide fermé.
3. Le cas échéant, régler la température désirée sur le contrôleur.
4. Laisser le système se équilibrer pendant au moins une demi-heure.
5. Enregistrer un spectre de bruit thermique du cantilever avec le cantilever loin de la surface afin d'exclure ne importe quelle surface effets d'amortissement. Notez que généralement une0 ou plusieurs spectres doivent être accumulés pour obtenir un rapport suffisant signal-sur-bruit.
6. Approcher la surface. Notez que dans le but de conserver la géométrie de la buse et la buse fonctionnalisation le processus d'approche doit être réalisée avec soin. Ceci peut être accompli, par exemple, se rapprochant en mode contact intermittent.
7. Déterminer la sensibilité optique inverse de levier (de InvOLS) mesurée en nm / volt. Pour ce faire, en poussant la pointe cantilever contre une surface dure.
   1. Déterminer les InvOLS en mesurant la pente de la distance de Voyage piézo contre le changement de tension de la photodiode. Monter une ligne à la partie de la courbe force-distance à laquelle la pointe cantilever est en contact avec la surface. Dans les expériences impliquant une surface molle comme bicouches lipidiques, réaliser cette étape sur les zones qui ne sont pas couverts par une bicouche lipidique (les «points défaut»).
8. Déterminer la constante de ressort (pN / nm) en ajustant un oscillateur harmonique du spectre de bruit thermique. Utilisationfonction de logiciel automatisé pour le printemps volonté constante; sinon, contacter la littérature ^20.
9. Commencez l'expérience.
   1. Courbes force-distance de nombreux records à chaque condition expérimentale. Typiquement, utiliser les valeurs suivantes pour les paramètres expérimentaux: Taux d'échantillonnage de 5 kHz, la vitesse de 1 pm / s de bout, retirer distance de 1 um.
      REMARQUE: Parfois, en fonction de la dynamique de l'expérience étudiée, il peut être nécessaire d'attendre un certain temps avec la pointe en contact avec la surface («temps de pause»).
      REMARQUE: les paramètres spécifiques L'expérience peut se écarter sensiblement des valeurs indiquées ci-dessus.
   2. Lors des mesures à long terme, la position zéro du laser sur la photodiode de temps à autre par le repositionnement de la photodiode.
   3. Facultatif: Après chaque courbe de force, déplacer l'AFM pointe à un autre poste de xy.
   4. A la fin de l'expérience, de déterminer la sensibilité et le ressort constant à nouveau pour vérifier la cohérence et la stabilité du système.
      REMARQUE: La comparaison de la constante de rappel et de la sensibilité avant et après l'expérience est aussi un moyen pour se assurer que les propriétés du système et les propriétés de la pointe sont restées inchangées au cours de l'expérience. Si la différence des constantes de ressort ne est pas trop grande (<= 15%), ils peuvent être en moyenne, depuis le incertitude intrinsèque du printemps volonté constante est aussi autour de 15%. Pour des différences plus importantes, il est conseillé de d'abord trouver et éliminer la cause de la constante de rappel apparente changer avant de poursuivre d'autres expériences.

6. Préparation des données

NOTE: Dans cette section générale étapes de préparation de données qui sont généralement effectué indépendamment du type spécifique de l'expérience pour convertir les unités Newton et nanomètre ainsi que pour corriger les données sont décrits. Les analyses de données spécifiques d'expérimentation sont briefly décrite plus en détail ci-dessous dans la section des exemples représentatifs respectifs.

1. Typiquement, effectuer toute la préparation des données et étapes d'analyse automatiquement par un algorithme maison écrite, par exemple, basé sur le logiciel IGOR Pro 6.
2. Convertir le signal de déviation brut (Defl) [V] en vigueur en multipliant avec les InvOLS [nm / V] et la constante du ressort [nN / nm].
3. La force de décalage de telle sorte que la force exercée sur la poutre à une distance suffisante de la surface (en porte-charge) devient 0 nN.
4. Calculer la position de la pointe réelle (également appelé de séparation lorsqu'il est mesuré par rapport à la surface) z *, qui prend la flexion de la poutre en compte:
   
5. Z * Décalage de telle sorte que z * = 0 correspond à la position z de la surface.
   REMARQUE: Ici, F est la force qui agit sur ​​la pointe et donc courbureest le cantilever (déterminée à l'étape 6.2.), z est la position z du capteur mesurée (donnée directement par l'instrument) et k représente la constante d'élasticité (déterminé à l'étape 5.8).

Figure 2. organigramme du processus montrant la préparation de l'échantillon, l'acquisition de données et l'analyse des données. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Résultats

Dans ce qui suit, les résultats décrits ci-dessus pour l'exemple des molécules, à savoir la polytyrosine polymères poly (acide aminé), le polymère greffé PI g -PS et la POPE phospholipide, sont présentés. Première pour chaque exemple, expérimenter des détails spécifiques pour l'acquisition des données et la préparation des données sont fournies. Ensuite, les résultats exemplaires pour des expériences où ces molécules ont été désorbé de surfaces différentes (CH ₃ -SAMs, hydrogène fin diamant et bicouc...

Discussion

Durant les dernières décennies, des expériences de molécules simples ont donné un aperçu sans précédent sur les mécanismes moléculaires et se est avéré être une approche précieuse en sciences de la vie et au-delà. Pour obtenir de bons et significatives expériences statistiques de SMF, idéalement une seule et même molécule est utilisée sur toute la durée de l'expérience. Contrairement aux expériences avec des ensembles de molécules, des expériences SMF sont capables de détecter des événements rares et états moléculai...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Matériaux
Hellmanex III concentré liquide alcalin (solution détergente)	Hellma
RCA (eau ultrapure, peroxyde d’hydrogène (35 %), ammoniac (32 %) ; 5:1:1(v/v/v))Réactif	Sigma
Vectabond / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane	Vectorlabs
Acétone sèche (< 50 ppm H< sub>2O)	Sigma
Chloroforme sec (> 99,9 %)	Sigma
Triéthylamine	Sigma
Eau ultrapure	Biochrom, Allemagne
Tétraborate de disodium (>  ; 99,5 %)	Biochrom, Allemagne
Acide borique	Biochrom, Allemagne
Monofonctionnel &alpha ;-méthoxy-&oméga ;-NHS PEG, 5 kDa, " méthyl-PEG-NHS"	Rapp, Allemagne
Hétérobifonctionnel &alpha ;,&omega ;-bis-NHS PEG, 6  ; kDa, " NHS-PEG-NHS"	Rapp, Allemagne
Hétérobifonctionnel &alpha ;-maléimidohexanoïque--oméga ;-NHS PEG, 5 kDa, " Mal-PEG-NHS"	Rapp, Allemagne
Molécule de sonde (polymère, lipide, etc.)
Equipment
Quantité suffisante de boîtes de cristallisation en verre avec bec (10  ; ml), boîtes de Pétri en verre (500 µ ; l) et couvercles en verre	VWR International GmbH, Allemagne		;   ;   ;   ;   ;   ;
[en-tête]
Four de laboratoire modèle UF30	Memmert, Allemagne
Sonicateur à température contrôlée	VWR International GmbH, Allemagne
Système plasma « Femto », 100 W	Diener, Allemagne
Une seringue en verre séparée pour chaque solvant organique	VWR International GmbH, Allemagne
Vortex mélangeur	VWR International GmbH, Allemagne
Tubes de microcentrifugation (0,5 ml ou 1,5 ml)	Pipettes Eppendorf
: 10-100 µ ; l, 50-200 et micro ; l et 100-1 000  ; et micro ; l	Eppendorf
AFM avec cellule fluide à température contrôlée (par exemple MFP-3D avec BioHeater)	Asylulm Research, Santa Barbara
Soft SiN cantilevers cantilevers, généralement fabriqués à partir de nitrure de silicium (SiN) (constante de ressort inférieure à 100 pN/nm, par exemple MLCT)	Bruker AXS, Santa Barbara