Une analyse comparative des recombinant expression des protéines dans différents bio-usines: bactéries, cellules d'insectes et Plant Systems

Summary

Dans cette étude, l’expression d’une protéine recombinante humaine cible dans différentes plateformes de production a été comparée. Nous nous sommes concentrés sur les cultures traditionnelles à base de fermenteurs et sur les plantes, en décrivant la configuration de chaque système et en mettant en évidence, sur la base des résultats rapportés, les limites et les avantages inhérents à chaque plateforme.

Abstract

Systèmes à base de plantes sont considérées comme une plate-forme précieuse pour la production de protéines recombinantes en raison de leur potentiel bien documenté pour la production à faible coût flexible de haute qualité, produits bioactifs.

Dans cette étude, nous avons comparé l'expression d'une protéine cible recombinante humaine dans les cultures traditionnelles à base de fermentation de cellules (bactériennes et d'insectes) avec les systèmes d'expression à base de plantes, à la fois transitoires et stables.

Pour chaque plate-forme, nous avons décrit la mise en place, l'optimisation et la longueur du processus de production, la qualité du produit final et les rendements et nous avons évalué les coûts de production provisoires, spécifiques de la protéine recombinante cible sélectionnée.

Dans l'ensemble, nos résultats indiquent que les bactéries ne sont pas appropriés pour la production de la protéine cible en raison de son accumulation dans les corps d'inclusion insolubles. D'autre part, les systèmes à base de plantes sont des plateformes polyvalentes tchapeau permet la production de la protéine choisie à plus faibles que les coûts-baculovirus / système de cellule d'insecte. En particulier, les lignées transgéniques stables affichent le plus haut rendement du produit final et transitoires plantes exprimant le processus de développement plus rapide. Cependant, toutes les protéines recombinantes peuvent bénéficier de systèmes à base de plantes, mais la meilleure plate-forme de production devraient être déterminées empiriquement avec une approche au cas par cas, comme décrit ici.

Introduction

Les protéines recombinantes sont produites commercialement en masse dans des systèmes d’expression hétérologues à l’aide d’outils biotechnologiques émergents. Les facteurs clés à prendre en compte lors du choix du système d’expression hétérologue sont : la qualité des protéines, la fonctionnalité, la vitesse du processus, le rendement et le coût.

Dans le domaine des protéines recombinantes, le marché des produits pharmaceutiques est en pleine expansion et, par conséquent, la plupart des produits biopharmaceutiques produits aujourd’hui sont recombinants. Les protéines peuvent être exprimées dans des cultures cellulaires de bactéries, de levures, de moisissures, de mammifères, de plantes et d’insectes, ainsi que dans des systèmes végétaux (par transformation stable ou transitoire) et des animaux transgéniques ; Chaque système d’expression a ses avantages et ses limites inhérents et pour chaque protéine recombinante cible, le système de production optimal doit être soigneusement évalué.

Les plateformes à base de plantes apparaissent comme une alternative importante aux systèmes traditionnels basés sur des fermenteurs pour une production sûre et rentable de protéines recombinantes. Bien que les coûts de traitement en aval soient comparables à ceux des cellules microbiennes et de mammifères, l’investissement initial moins élevé requis pour la production commerciale de plantes et l’économie d’échelle potentielle, fournie par la culture sur de grandes superficies, sont des avantages clés.

Nous avons évalué des plantes en tant que bioréacteurs pour l’expression de l’isoforme 65 kDa de l’acide glutamique décarboxylase humaine (hGAD65), l’un des principaux auto-antigènes du diabète auto-immun de type 1 (DT1). hGAD65 est largement adopté comme marqueur, à la fois pour classifier et surveiller la progression de la maladie et son rôle dans la prévention du DT1 est actuellement à l’étude dans des essais cliniques. Si ces essais sont couronnés de succès, la demande mondiale de hGAD65 recombinant augmentera considérablement.

Ici, nous nous concentrons sur l’expression de la contrepartie enzymatiquement inactive de hGAD65, hGAD65mut, un mutant généré par substitution du résidu de lysine qui lie le cofacteur PLP (pyridoxal-5'-phosphate) à un résidu d’arginine (K396R)¹.

hGAD65mut conserve son immunogénicité et, dans les cellules de plantes et d’insectes, accumule jusqu’à dix fois plus que hGAD65, son homologue de type sauvage. On a émis l’hypothèse que l’activité enzymatique de hGAD65 interfère avec le métabolisme des cellules végétales à un point tel qu’elle supprime sa propre synthèse, tandis que hGAD65mut, la forme enzymatiquement inactive, peut être accumulée dans les cellules végétales à des niveaux plus élevés.

Pour l’expression de hGAD65mut, l’utilisation de différentes technologies, largement utilisées en biotechnologie végétale, a été explorée ici et comparée aux plateformes d’expression traditionnelles (Escherichia coli et à base de baculovirus/cellules d’insectes).

Dans ce travail, les plateformes recombinantes développées pour l’expression de hGAD65mut comprenant des systèmes traditionnels et à base de plantes ont été examinées et comparées sur la base de la vitesse et du rendement du procédé, ainsi que de la qualité et de la fonctionnalité du produit final.

Protocol

1. Construction de vecteurs d'expression

1. Commercial recombinaison système de clonage:
   1. Amplifier la séquence du gène cible (hGAD65mut) avec des amorces appropriées permettant l'addition d'une pince de CACC à l'extrémité 5 'du gène, comme décrit précédemment ² de pleine longueur.
   2. Clonage du produit d'amplification purifié sur gel, selon les directionnels spécifications de la trousse de clonage, dans le vecteur d'entrée (topoisomérase liée) par l'assemblage de la réaction dans un volume total de 6 ul, en utilisant une 1,5: 1 ratio molaire insert: vecteur et 1 ul de solution de sel (NaCl 0,2 M et 0,01 MgCl _2). Incuber pendant 5 min à température ambiante (RT).
   3. Transformer la totalité de la réaction dans E. chimiquement compétente cellules coli selon directionnelles spécifications du kit de clonage et colonies d'écran obtenus par PCR sur colonie ^3, en utilisant M13 amorces sens et antisens inclus dans le kit de clonage directionnel. Isoler le plasmide d'un pocolonie sitif selon l'une préparation d'ADN plasmide spécifications de la trousse et la séquence insert M13 en utilisant des amorces directe et inverse pour assurer l'absence de mutations ^3.
   4. Utilisez une entrée clone obtenu pour effectuer la réaction de recombinaison de l'Lambda recombinase Clonase II Enzyme (LR) avec des vecteurs de destination spécifiques: pour l'expression de protéines recombinantes dans des cellules bactériennes avec pDEST17 (rendement pDEST17.G65mut), dans les plantes (transitoire ou stable) avec pK7WG2 (donnant pK7WG2.G65mut), dans Baculovirus / système de cellule d'insecte avec l'ADN viral linéarisé (donnant Baculo.G65mut) ^4. Monter la réaction, selon les spécifications de la trousse de Clonase, avec 100 ng de vecteur d'entrée, 150 ng de vecteur de destination et 2 ul de mélange enzymatique dans un volume final de 10 ul. Incuber le mélange à température ambiante pendant 1 heure.
   5. Transformer le produit de recombinaison dans E. chimiquement compétente cellules coli selon Clonase spécifications du kit. Écran colonies obtenues par PCR ³ à l'aide de toutes les colonies dérivées de la réaction de transformation de la même amorce inverse spécifique GAD65mut (5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ') et les vecteurs de destination amorces sens spécifiques suivants: pour pDEST17: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'; pour pK7WG2: 5'-AAGATGCCTCTGCCGACAGT-3 '; pour Baculo vecteur linéarisé: 5'-AAATGATAACCATCTCGC-3 '.
   6. Isoler l'ADN plasmidique en utilisant un kit d'ADN de minipréparation commercial et confirmer la présence de la séquence cible par PCR ^3, en utilisant les mêmes combinaisons d'amorces spécifiques décrites dans l'étape précédente.
   7. Utilisation des plasmides PCR-positifs obtenus à transformer les organismes cibles différentes, en fonction de la plate-forme choisie pour l'expression de protéines recombinantes comme décrit dans les étapes suivantes.
2. Système de MagnICON ^7.5:
   1. Clonage du gène cible dans la 3'-module pICH31070, comme décrit précédemment en détail ^7, ce qui donne pICH31070.G65mut. Utilisez lesuivant le cycle de réaction spécifique: 30 min d'incubation à 37 ° C, 5 min à 50 ° C, puis 5 min à 80 ° C.

2. Recombinant Protein Expression

1. Système de cellule bactérienne:
   1. Transformer pDEST17.G65mut dans E. coli BL21 (DE3) Des cellules électrocompétentes utilisant des techniques classiques et l'écran les colonies cultivées sur contenant de l'ampicilline (100 ug / ml) du milieu LB, par une PCR sur colonie en utilisant les amorces spécifiques d'un transgène suivante: 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 'et 5' -CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ', avec une température d'hybridation de 58 ° C et un temps d'élongation de 20 sec. Effectuer la réaction PCR dans un volume total de 20 ul après dissolution des cellules bactériennes avec un embout en plastique dans le tube.
   2. Inoculer une seule colonie pendant une nuit à 37 ° C dans 3 ml d'ampicilline contenant (100 ug / ml de milieu LB).
   3. Diluer la culture bactérienne 1: 100 dans 100 ml de milieu LB frais (y compris ampicillin) et incuber à 37 ° C pendant 1-6 h jusqu'à une DO finale de 0,8 _600.
   4. Induire l'expression de la protéine recombinante par addition d'isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) à une concentration finale de 1 mM et on incube la culture avec agitation vigoureuse pendant 3 heures à 37 ° C.
   5. Recueillir les cellules par centrifugation à 4000 xg pendant 20 min et en utilisant culot bactérien pour l'extraction de la protéine (étape 3.1.1.1).
2. Baculovirus / système de cellule d'insecte:
   1. Semences Spodoptera frugiperda (Sf9) cellules dans des plaques 6 puits (8 x 10 ⁵ cellules par puits) et laver deux fois avec 2 ml de non-complété insectes milieu de Grace.
   2. Retirez et remplacez le goutte à goutte du mélange de transfection (5 pi LR réaction recombinant, solution de Celfectin 6 pi et 200 pi non complétée insectes milieu de Grace) moyen.
   3. Incuber les plaques à 27 ° C pendant 5 heures.
   4. Retirer et remplacer mélange de transfection avec 2 ml de frais Sf-900 milieu, complémenté avec 10% de sérum bovin foetal, 10 ug / ml de gentamycine et 100 uM de ganciclovir pour sélectionner des clones de baculovirus recombinant.
   5. Après une incubation de 96 h à 27 ° C, de recueillir moyen (V1 stock virale), centrifuger à 4000 xg pour éliminer les cellules et les gros débris et de stocker dans l'obscurité à 4 ° C.
   6. Graine 1 x 10 ⁶ cellules Sf9 par puits dans 2,5 ml Sf-900 un milieu contenant 10% de sérum bovin foetal, 10 ug / ml de gentamycine et 100 uM de ganciclovir et d'infecter avec 100 ul de stock en V1 chaque puits.
   7. Incuber les cellules pendant 3 jours à 27 ° C.
   8. Recueillir et milieu de centrifuger à 4000 x g.
   9. Stocker le surnageant (V2-titre élevé stock) à 4 ° C.
   10. Graine 1 x 10 ⁶ cellules Sf9 par puits dans 2,5 ml Sf-900 un milieu contenant 10% de sérum bovin foetal, 10 ug / ml de gentamycine et 100 uM de ganciclovir et d'infecter avec 25 ul de stock en V2 chaque puits.
   11. Incuber les cellules pendant 3 jours à 27 ° C.
   12. Recueillir les cellules par centrifugation à 4000 xg et en utilisant culot de cellules d'insecte pour l'extraction de la protéine (étape 3.1.2. 1).
3. Nicotiana benthamiana systèmes d'expression transitoire:
   1. Cultivez N. benthamiana plantes dans une serre, sous la lumière naturelle dans la plage de température de 18 à 23 ° C. Pour agroinfection utiliser de vieux 4-5 semaines plantes.
   2. Gardez les plantes agroinfected dans une chambre climatique à 22 ° C avec un 13 h jours / 11 h nuit photopériode.
   3. Commercial recombinaison système de clonage:
      1. Introduire dans pK7WG2.G65mut souche d'Agrobacterium tumefaciens EHA105 cellules électrocompétentes ⁸ comme décrit précédemment et cribler les colonies cultivées sur du milieu LB contenant de la rifampicine (50 ug / ml), streptomycine (300 ug / ml) et de spectinomycine (100 ug / ml) après 2 jours d'incubation à 28 ° C, par PCR sur colonie ⁸ en utilisant les amorces spécifiques de transgènes suivantes: 5'-CATGGTGGAGCACGACACGCT-3 & #8217; et 5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ', avec une température d'hybridation de 58 ° C et un temps d'élongation de 50 sec. Effectuer la réaction PCR dans un volume total de 20 ul.
      2. Inoculer les bactéries dans 30 ml de milieu LB contenant de la rifampicine (50 ug / ml), streptomycine (300 ug / ml) et de spectinomycine (100 ug / ml) pendant deux jours à 28 ° C.
      3. Recueillir les bactéries par centrifugation à 4000 xg pendant 20 min et remettre en suspension le culot dans 10 ml de tampon d'infiltration (MES 10 mM, 10 mM de _MgCl2, 100 uM d'acétosyringone, pH 5,6). Mesurer la valeur OD ₆₀₀ puis ajuster à 0,9 par dilution dans le même tampon.
         REMARQUE: le volume total nécessaire pour l'infiltration de trois N. benthamiana plantes est de 30 ml.
      4. Utiliser une seringue sans aiguille de 2,5 ml d'infiltrer la suspension d'Agrobacterium dans N. benthamiana laisse. Soigneusement et lentement injecter panneaux de feuilles avec la suspension de la seringue. Infiltrez trois l élargicombles par plante et utilisent trois plantes triple.
         REMARQUE: pour des raisons de santé et de sécurité portent des lunettes de protection pendant le processus d'infiltration.
      5. Ramasser les feuilles 2 jours infection agroinfiltrated de poste (ppp) et le gel dans de l'azote liquide. Magasin tissu végétal à -80 ° C.
   4. MagnICON système:
      1. Présentez les vecteurs de MagnICON - le «module (pICH20111), 3 '5 module (pICH31070.G65mut), et le module de l'intégrase (pICH14011) - dans A. tumefaciens souche GV3101 utilisant des techniques standard. Cribler les colonies cultivées sur du milieu LB contenant 50 ug / ml de rifampicine et antibiotique approprié spécifique de vecteur (50 ug / ml de carbénicilline à pICH20111 et pICH14011, 50 pg / ml de kanamycine pour pICH31070), par une PCR sur colonie en utilisant des amorces spécifiques pour chaque vecteur.
      2. Inoculer séparément les trois A. tumefaciens souches dans 5 ml de milieu LB contenant 50 pg / ml de rifampicine et un antibiotique spécifique vecteur appropriéet agiter pendant une nuit à 28 ° C.
      3. Pellet cultures d'une nuit bactériennes par centrifugation à 4000 g pendant 20 min et remettre en suspension dans deux volumes de la culture bactérienne initiale de 10 mM de MES (pH 5,5) et 10 mM MgSO _4.
      4. Mélanger des volumes égaux de suspensions bactériennes contenant les trois vecteurs et utiliser le mélange de suspension pour seringue infiltration de N. benthamiana laisse. Infiltrez trois feuilles déployées par plante.
      5. Ramasser les feuilles agroinfiltrated à 4 ppp et congeler dans l'azote liquide.
      6. Magasin tissu végétal à -80 ° C.
4. Nicotiana tabacum système d'expression stable:
   1. Développer et entretenir les plantules in vitro de N. tabacum (var Sr1.) sur une solide milieu de culture végétale (4,4 g / L de Murashige et Skoog - MS - support y compris les vitamines, 30 g / L de saccharose, pH 5,8, 7 g / agar usine de L) dans des conditions contrôlées en chambre climatique à 25 ° C avec 16 h jour / 8 h / niGHT régime.
   2. Démarrer une pré-culture de A. tumefaciens EHA105 hébergeant le pK7WG2.G65mut vecteur d'expression dans 5 ml de milieu YEB liquide avec des antibiotiques appropriés (à la rifampicine 50 ug / ml, streptomycine 300 pg / ml, la spectinomycine 100 ug / ml) et de croître pendant une nuit à 28 ° C dans un ensemble d'agitateur orbital à 200 rpm.
   3. Utiliser 1 ml de la pré-culture pour inoculer une culture de 50 ml d'Agrobacterium dans un milieu plus les antibiotiques YEB (rifampicine 50 ug / ml, streptomycine 300 pg / ml, la spectinomycine 100 ug / ml) et de croître pendant 24 heures, jusqu'à ce que la culture bactérienne est saturé ₍₆₀₀ OD valeur de 0,5 à 1,0).
   4. Recueillir les bactéries par centrifugation à 4000 g pendant 20 min et remettre le culot dans 50 ml de milieu liquide de culture de plantes. Répétez cette étape deux fois pour enlever complètement antibiotiques.
   5. Prenez premières feuilles saines sont entièrement développés à partir de plantes in vitro dans de tabac et les couper en carrés d'environ 1 cm.
   6. morceaux de feuilles de transfertaux plats de Pétri contenant profondes suspension bactérienne et laisser dans l'obscurité pendant 20 min.
   7. Retirer les morceaux de feuilles de suspension et sécher sur du papier filtre stérile.
   8. Placez les morceaux de feuilles avec côté adaxial (surface supérieure des feuilles) sur un milieu de culture de la plante solide contenant 1,0 pg / ml 6-benzylaminopurine (BAP) et / acide acétique naphtalène ml 0,1 pg (NAA) et incuber les plaques pendant deux jours dans une chambre climatique à contrôlée conditions (25 ° C, 16 h jour / 8 h nuit).
   9. la feuille de transfert de pièces sur un milieu de culture solide (y compris 1,0 ug / ml de BAP, 0,1 mg / ml de NAA, 500 ug / ml de cefotaxime, 100 ug / ml de kanamycine) avec une surface abaxiale (surface inférieure de la feuille) en contact avec le milieu.
   10. Incuber les plaques pendant 2-3 semaines dans la chambre climatique à 25 ° C avec 16 h / 8 h régime jour / nuit pour induire la formation de tournage. Subculture toutes les 2 semaines en transférant explants de feuilles au milieu de culture de la plante solide frais contenant 1,0 pg / ml BAP, 0,1 pg / ml NAA, 500ug / ml de cefotaxime et 100 ug / ml de kanamycine.
   11. Lorsque les pousses apparaissent les transférer à des boîtes Magenta contenant du milieu de culture solide comprenant 500 ug / ml de cefotaxime et 100 ug / ml de kanamycine pour induire la formation de racines. Incuber plantules avec 16 h jour / 8 h nuit photopériode à 25 ° C pendant 1-2 semaines.
   12. Lorsque les racines forme, transférer les plantes dans le sol dans la serre.
   13. Prélever un morceau de feuille pour chaque plante et isoler l'ADN génomique avec un kit commercial.
   14. Détecter la présence du transgène par PCR spécifique. Utiliser 30 ng d'ADN génomique comme matrice pour l'amplification par PCR en utilisant les amorces spécifiques d'un transgène suivante: 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 'et 5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3', avec une température d'hybridation de 58 ° C et un temps d'allongement de 20 s . Effectuer la réaction PCR dans un volume total de 50 ul.
   15. Analyser le produit de 220 pb par électrophorèse sur gel d'agarose à 1% dans du Tris-acétate-EDTA (TAE) tampon (40 mM Trest, de l'acide acétique 20 mM, et EDTA 1 mM).
   16. Sélectionner des plantes transgéniques contenant le gène cible.
   17. Prélever un morceau de chacun de la plante transgénique sélectionnée de la feuille et congeler dans l'azote liquide immédiatement.
   18. Préparer des extraits de protéines totales de tissus de feuille de la plante (étape 3.1.3) et de tester chaque échantillon par analyse western blot comme décrit précédemment ² pour sélectionner la meilleure expression de plante de tabac de protéine recombinante.
   19. Sac fleurs de la plante sélectionnée meilleure performant avant la floraison pour empêcher la pollinisation croisée.
   20. Après la floraison, maturation du fruit et le séchage de semences, la collecte des sacs.
   21. Séparer les graines de la paille et de les stocker dans un endroit sec à température contrôlée (20-24 ° C).
   22. Semez les graines séchées pour produire les secondes plantes transgéniques de la génération, puis sélectionnez l'usine la plus performante pour être auto-pollinisation.
   23. Répétez la même procédure décrite dans les étapes 2.4.19-2.4.21 pour les générations suivantes.

3. Protéines recombinantes Analyses d'expression

1. Extraction des protéines totales:
   1. Les cellules bactériennes:
      1. Remettre en suspension le culot de cellules bactériennes, recueilli comme décrit dans l'étape 2.1.5, dans la moitié du volume de culture d'une solution saline tamponnée au Tris (TBS - 2 mM de Tris / HCl, 500 mM de NaCl) à pH 7,4 supplémenté avec phenylmethanesulfonylfluoride 1 mM (PMSF).
      2. Soniquer remis en suspension culot cellulaire trois fois pendant 40 secondes à mi-puissance, tout en gardant l'échantillon sur de la glace.
      3. Clarifier lysat par centrifugation à 14 000 g pendant 20 min à 4 ° C.
      4. Transférer le surnageant dans un tube propre et stocker à la fois séparément surnageant et le culot à -80 ° C.
      5. Solubiliser les corps d'inclusion, recueillies dans le culot, dans la moitié du volume de lysat cellulaire de TBS pH 8,0 supplémenté avec 6 M d'urée par agitation vigoureuse pendant une nuit à température ambiante.
      6. Centrifuger à 10 000 g pendant 25 min à température ambiante et de recueillir surnageant dans un endroit propretube.
      7. Stocker à la fois surnageant et le culot à -80 ° C.
   2. Les cellules d'insectes:
      1. Laver culot de cellules d'insecte infectées, recueilli comme décrit dans l'étape 02/02/12, avec 1 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS - 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na ₂ HPO _4, 1,8 mM de KH ₂ PO ₄₎ à pH 7,4.
      2. Resuspendre les cellules dans 200 ul de tampon de lyse (20 mM Tris / HCl pH 8,0, 0,5 M de NaCl, 3 mM de β-mercaptoéthanol et 1% de Tween-20) et laisser incuber sur de la glace pendant 30 min.
      3. Centrifugeuse cellules solubilisé à 14 000 g pendant 20 min à 4 ° C.
      4. Recueillir des fractions solubles et conserver à -80 ° C et jeter le culot.
   3. tissus de la feuille de la plante:
      1. N. Grind benthamiana ou N. tabacum tissus en poudre fine dans de l'azote liquide en utilisant un mortier et un pilon.
      2. Homogénéiser 100 mg de tissu broyé dans 300 ul de tampon d'extraction (40 mM de Hepes pH 7,9, 5 mM de DTT, 1,5% CHAPS), Supplemented avec 3 ul d'inhibiteur protéase cocktail et de dégel sur la glace.
         REMARQUE: le ratio choisi entre le poids du tissu de la plante (g) mettre en mémoire tampon le volume (ml) est de 1: 3.
      3. extrait de Centrifuger à 30 000 xg pendant 30 min à 4 ° C.
      4. Recueillir surnageant dans un tube propre et conserver à -80 ° C.
2. Coomassie gel coloration:
   1. Préparer une dilution appropriée d'extraits de protéines totales (par exemple, 2 ul d'extrait de plante, 5 ul d'extraits bactériens et les insectes) jusqu'à un volume final de 10 ul de tampon d'extraction et ajouter 5 pl de tampon d'échantillon 3X (1,5 M Tris / HCl pH 6,8, 3% de SDS, 15% de glycerol, 4% de β-mercaptoéthanol) à une concentration finale 1x.
   2. Faire bouillir les échantillons pendant 10 min.
   3. Protéines séparées par 10% SDS-PAGE.
   4. Après électrophorèse, le gel de la chaleur en présence de Coomassie solution A (0,05% de bleu brillant R-250, 25% d'isopropanol, de l'acide acétique à 10%) dans un four à micro-ondes pendant environ deux minutess jusqu'au point d'ébullition.
   5. Refroidir gel à la température ambiante en agitant doucement.
   6. Jeter Coomassie solution de coloration A.
   7. Gel Destain par chauffage en présence de Coomassie solution B (0,05% de bleu brillant R-250, 25% d'isopropanol), C (acide acétique à 10%) (0,002% de bleu brillant R-250, de l'acide acétique à 10%) et D à chaque fois suivant le même protocole pour la coloration.
   8. Après la dernière étape de chauffage avec une solution D, laissez gel décoloration jusqu'au fond est clair ^neuf.
3. Analyse par Western blot:
   1. Après l'électrophorèse, le transfert des protéines sur une membrane de nitrocellulose en utilisant des techniques standard et des blocs avec 4% de lait dans du PBS séparée à pH 7,4 à température ambiante pendant 1 heure.
   2. Incuber le buvardage pendant la nuit à 4 ° C ou pendant 4 heures à la température ambiante dans la solution de blocage contenant un anticorps primaire de lapin dirigé contre la protéine cible à 1: 10 000 et supplémenté avec 0,1% de Tween-20.
   3. Après étiquette anticorps primaireing, laver la membrane 3 fois pendant 5 minutes chacun avec une solution de blocage contenant 0,1% de Tween-20.
   4. Incuber la peroxydase de raifort (HRP) d'anticorps anti-lapin -conjugate au 1: 10 000 pendant 1,5 heure.
   5. Laver la membrane 5 fois pendant 5 minutes chacun avec du PBS-T (PBS supplémenté avec 0,1% de Tween-20).
   6. Processus western blot en utilisant le substrat de la peroxydase chimioluminescent.
4. dosage radioimmunologique (RIA):
   1. Permettre aux réactifs (antisérum, traceur et la protéine A-Sepharose) pour atteindre la température ambiante et la pipette 20 ul d'échantillons et les étalons d'extrait de protéines à différentes concentrations (de 300-2,400 ng / ml de commerce recombinant hGAD65) dans des tubes de polystyrène de 12 x 75 mm.
   2. Ajouter 20 ul d'antisérum, préparé dilution 1:30 du sérum de plasmaphérèse d'un patient atteint de diabète de type 1.
   3. Ajouter 50 ul de traceur (125 I-GAD65) et incuber pendant 2 heures à température ambiante. Fixer un tube avec traceur seulement pour estimer l'activité totale.
   4. Ajouter 50 ulde protéine A-Sepharose et incuber pendant 1 heure à température ambiante.
   5. Verser 1 ml de tampon PBS froid dans chaque tube et centrifuger à 1500 g à 4 ° C pendant 30 min.
   6. Décanter les tubes pour éliminer surnageant et absorber le liquide résiduel sur du papier buvard en tapotant doucement tube.
   7. Mesure de la radioactivité immunoprécipitée dans tous les tubes par comptage pendant 1 minute dans un compteur gamma.
   8. Terrain en échelle logarithmique les taux de liaison (B / T%) des calibrateurs liés à l'activité totale, pour établir la courbe standard, et lire la concentration GAD d'échantillons sur la courbe d'étalonnage ^10.
      NOTE: Restreint zones devraient être conçus pour le stockage, la manipulation et l'élimination des matières radioactives.

Results

Un modèle expérimental pour l'expression hétérologue d'une protéine recombinante cible dans différents systèmes de production est décrite ici. Le premier objectif était la mise en place des différentes plates-formes mettant en place les conditions optimales pour l'expression de la protéine cible dans chaque système.

L'expression de la protéine cible, hGAD65mut, a été induite en triple E. coli cultures. A la suite de l'expression 3 h à 37 ° C, les cellules bactériennes ont été recuei...

Discussion

Dans cette étude, trois modes différents ont été comparés pour l'expression d'une protéine recombinante humaine: des cellules bactériennes, des cellules de baculovirus / insectes et de plantes. La plate-forme à base de plantes a été étudiée plus en exploitant trois technologies d'expression largement utilisés (c.-à-transitoire - MagnICON et pK7WG2 base - et stables). La protéine cible choisie pour cette expérience, hGAD65mut, a déjà été exprimé dans différents systèmes ^13, et sa productio...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Extrait de levure	Sigma	Y1333
Tryptone	Formedium	TRP03
Agar Bacteriological Grade	Applichem	A0949
Sf-900 II SFM medium	Gibco	10902-088
Grace' s Milieu insecte, non supplémenté	Gibco	11595-030
Réactif Cellfectin II	Invitrogen	10362-100
Milieu MS avec vitamines	Duchefa Biochemie	M0222
Saccharose	Duchefa Biochemie	S0809
Gélose végétale	Duchefa Biochemie	P1001
Ampicilline sodique	Duchefa Biochemie	A0104	Sulfate de
gentamycine	Duchefa Biochemie	G0124
Toxique Ganciclovir	Invitrogen	I2562-023
Carbenicilline disodique	Duchefa Biochemie	C0109	Sulfate
kanamycine	Sigma	K4000
Rifampicine	Duchefa Biochemie	R0146	Toxique et ndash ; 25 mg/ml de DMSO
Sulfate de streptomycine	Duchefa Biochemie	S0148	Chlorhydrate de
spectinomycine	Duchefa Biochemie	S0188
IPTG (isopropil-&beta ;-D-1-tiogalattopiranoside)	Sigma	I5502
Hydrate de MES	Sigma	M8250
MgCl2	Biochemical	436994U
Acétosyringone	Sigma	D134406	Toxique &ndash ; 0,1 M stock dans une seringue DMSO
(1 ml)	Terumo
MgSO4	Fluka	63136
BAP (6-Benzylaminopurine)	Sigma	B3408	NAA toxique
(Acide naphtalène acétique)	Duchefa Biochemie	N0903
Irritant Cefatrome	Mylan Génériques
Trizma base	Sigma	T1503	Ajuster le pH avec 1 N HCl pour faire un tampon Tris-HCl
	Sigma	H1758	Corrosif
NaCl	Sigma	S3014	1 M stock
KCl	Sigma	P9541
Na2HPO4	Sigma	S7907
KH2PO4	Sigma	P9791
PMSF (fluorure de phénylméthanesulfonyle)	Sigma	P7626	Corrosif, toxique
Urea	Sigma	U5378
&beta ;-mercaptoethanol	Sigma	M3148	Toxic
Tween-20	Sigma	P5927
Hepes	Sigma	H3375
DTT (Dithiothreitol)	Sigma	D0632	Toxique &ndash ; 1 M stock, stocker à -20 ° ; C
CHAPS	Duchefa Biochemie	C1374
Toxique Cocktail inhibiteur de protéase végétale	Sigma	P9599	Ne pas congeler/décongeler trop de fois
SDS (Sodium dodecyl sulfate)	Sigma	L3771	Inflammable, toxique, corrosif &ndash ; 10 % stock
Glycérol	Sigma	G5516
Bleu brillant R-250	Sigma	B7920
Isopropanol	Sigma	24137	Inflammable
Acide acétique	Sigma	27221	Corrosif
Anti-Glutamic acid decarboxylase 65/67	Sigma	G5163	Ne pas congeler/décongeler trop de fois
Anticorps anti-lapin conjugué à la peroxydase de raifort (HRP)	Sigma	A6154	Ne pas congeler/décongeler trop de fois
Sf9 Cellules	Vie Technologies	11496
BL21 Compétent E. coli	New England Biolabs	C2530H
Protéine A Sepharose	Sigma	P2545
Plaques de culture cellulaire	Sigma	CLS3516
Kit d’immuno-immuno	Techno Génétique	12650805	Matière radioactive