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Nucléocapside recuit-Mediated électrophorèse (NOM) Assay permet l'identification rapide des VIH-1 inhibiteurs Nucleocapsid

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DOI :

10.3791/52474

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19 janvier 2015

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1Department of Pharmaceutical and Pharmacological Sciences, University of Padova, 2The RNA Institute, SUNY Albany

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit NAME, un test qui permet d’identifier rapidement des molécules capables d’inhiber in vitro les activités chaperonnes de la protéine nucléocapside du VIH-1.

Résumé

ARN ou ADN plié en pliage tridimensionnel stable sont des cibles intéressantes dans le développement de médicaments antiviraux ou anti-tumorale. Dans le cas du VIH-1, les protéines virales impliquées dans la régulation de l'activité du virus reconnaissent plusieurs acides nucléiques. La protéine de nucléocapside NCp7 (NC) est une protéine de régulation clé plusieurs procédés au cours de la réplication du virus. NC est en fait un chaperon déstabilisant les structures secondaires de l'ARN et de l'ADN et facilitant leur recuit. L'inactivation du NC est une nouvelle approche et une cible intéressante pour la thérapie anti-VIH. Le N ucleocapsid Un nnealing- M ediated E lectrophoresis (NOM) test a été développé pour identifier des molécules capables d'inhiber la fusion et le recuit de l'ARN et de l'ADN plié en conformations tridimensionnelles thermodynamiquement stables, comme les structures en épingle à cheveux de goudron et éléments cTAR du VIH, par la protéine de nucléocapside du VIH-1. Le nouveau test emploie soit la rérecombinant ou la synthèse des protéines, des oligonucléotides et sans la nécessité de leur marquage précédente. L'analyse des résultats est réalisée par électrophorèse sur gel de Polyacrylamide standard (PAGE) suivie d'une coloration d'acide nucléique conventionnel. Le protocole rapporté dans cet ouvrage explique comment effectuer le NOM test avec la protéine pleine longueur ou sa version tronquée dépourvue du domaine N-terminal de base, à la fois compétente comme les acides nucléiques chaperons, et comment évaluer l'inhibition de l'activité de chaperon NC par un filetage intercalant. En outre, le nom peut être effectué dans deux modes différents, utile pour obtenir des indications sur le mécanisme d'action présumé des inhibiteurs NC identifiés.

Introduction

La protéine de nucléocapside NCp7 (NC) de l'immunodéficience humaine virus de type 1 (VIH-1) est une petite protéine basique qui est étroitement associé à l'ARN génomique du virus infectieux mature, jouant un rôle essentiel dans la réplication du virus en tant que cofacteur pendant la transcription inverse , la reconnaissance du génome, et l'emballage. 1-3 NC agit comme un chaperon d'acide nucléique catalyser la déstabilisation des structures stables d'acide nucléique et l'hybridation de séquences complémentaires. Son activité acide nucléique agrégation réside principalement dans les 11 acides aminés N-terminal alors que l'activité déstabiliser duplex a été cartographiée à ses structures de doigt de zinc (12 à 55 peptidiques). 4 La protéine chargée positivement abaisse la barrière électrostatique de la réaction d'hybridation et augmente la vitesse à laquelle les deux séquences complémentaires distincts se rejoignent.

Les acides nucléiques pliées de conformation stable exigent les activités chaperonnes de NC à facilitate leur recuit 5 Cela est particulièrement important dans la transcription inverse, où NC est critique dans des événements de transfert de brins:. dans le transfert brin moins, l'ADN d'arrêt brin moins, tout rétrotranscrit, doit être transférée et hybridée à une séquence complémentaire de la région R à l'extrémité 3 'du génome de l'ARN matrice. 6 Bien que thermodynamiquement favorisée, cette réaction ne se produit pas largement en l'absence de NC en raison de la présence de la structure stable de l'activation trans région sensible (TAR) ARN dans les régions de recherche, qui doit être associé à sa copie d'ADN (cTAR ADN). Les sept régions cTAR et TAR sont, en fait, très structuré avec une tige-boucle conformation caractéristique. NC protéine se dénature ces épingles à cheveux, et favorise le transfert de brin négatif en augmentant le taux de recuit intermoléculaire entre les brins d'acide nucléique complémentaires. Le mécanisme de NC recuit de goudron et cTAR a été soigneusement étudié et dedécrite comme test TAR de recuit dans plusieurs documents de recherche et le schéma proposé est représenté dans d'excellentes critiques. 8-11 Résumer, NC déstabilise la structure secondaire de l'ARN stable comme TAR-ARN, déstabilise la structure secondaire de sa séquence complémentaire, cTAR-DNA et favorise la réaction d'annelage de l'ARN / ADN conduisant à TAR / cTAR formation d'hétéroduplex. 10,11 Par conséquent, l'étape de transfert de brin pendant la replication du VIH est favorisée. 12

NC est une cible intéressante pour le développement de nouveaux agents antiviraux puisque les risques d'interférence induite par de petites molécules en vue NC entraînerait une diminution de la transcription inverse du génome viral à la suite d'une activité NC compromise. 2,13 Cette approche pourrait finalement conduire au développement d'agents anti-VIH réussies. Dans le cadre d'un dépistage de la NC inhibiteurs 14 nous avons développé un test en se appuyant sur ​​les propriétés bien connuesde nucléocapside de déstabiliser efficacement et recuit oligonucléotides complémentaires 10,11. Nous l'avons appelé N ucleocapsid Un nnealing- M ediated E lectrophoresis (NOM) dosage. NOM essai utilise NC pour arbitrer le recuit entre les copies de manière stable structurés d'acides nucléiques complémentaires, dans notre cas de l'oligonucléotide correspondant à la partie apicale d'une séquence TAR-ARN avec sa séquence d'ADN complémentaire (cTAR) pour donner le hybride TAR / cTAR heteroduplex . L'analyse de la TAR / cTAR réaction de recuit en présence de NC peut être étudiée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide natif (PAGE).

Ce protocole montre comment effectuer le dosage NOM à recuire rapidement à des oligonucleotides à la température ambiante dans des structures pliées en épingle à cheveux stable, la manière d'analyser les résultats de la réaction et éventuellement de dépannage de l'expérience. Le marquage radioactif de l'acide nucléique ne est pas demandée, et detectisur des bandes d'oligonucléotides peut être réalisée par des procédés classiques de coloration. L'essai, qui emploie soit la protéine pleine longueur recombinant ou une version synthétique tronqué de NC, permet l'identification des agents intercalants d'enfilage NC inhibant une activité corrélée à une forte liaison à l'ARN et de l'ADN 14.

Protocole

1. Préparation du matériel, Nucleic Acids et Protéines

  1. Nucleic Acids
    1. Autoclave les tubes de 1,5 ml et les stocker dans un récipient stérile. Effectuez chaque étape à l'aide des conseils de filtration stériles pour éliminer les agents contaminants à savoir nucléases de consommables de laboratoire.
    2. Préparer tampon Tris-HCl 10 mM pH 7,5 dans de l'eau traitée au DEPC et filtrer la solution avec un filtre de taille de pore de 0,22 um.
    3. NOTE: L'oligonucléotide appelé "goudron" correspond à la séquence de l'ARN court (29-mer) 5'-GGCAGAUCUGAGCCUGGGAGCUCUCUGCC-3 '15 est alors cTAR sa séquence complémentaire d'ADN 5'-GGCAGAGAGCTCCCAGGCTCAGATCTGCC-3'.
      1. Solubiliser deux TAR et cTAR dans le tampon Tris-dessus mentionnée (1.1.2.) Pour faire 100 uM solutions d'achat d'actions. Magasin cTAR solution stock à -20 ° C (aliquotes peut être stocké pendant des mois dans ces conditions). Pour le stockage à long terme de l'ARN, faire 20 aliquotes de la TARsolution mère, sécher chaque aliquote utilisant un concentrateur centrifugeuse sous vide et de les stocker à -80 ° C. Fraîchement avant l'utilisation, la remise en suspension de chaque aliquote TAR dans 20 l'eau traitée au DEPC ul.
        REMARQUE: aliquotes TAR de travail peut être conservé à -20 ° C pendant deux semaines.
  2. Protéine NC et (12-55) NC peptide
    1. Préparer la pleine longueur de protéine recombinante NC comme indiqué. 16 Conserver le solution stock à -20 ° C. Déterminer la concentration en protéine exact avec un spectrophotomètre UV-Vis de l'utilisation d'un coefficient d'extinction à 280 nm de 6410 M -1 cm -1.
    2. Reprendre le synthétique (12-55) NC peptide dans du Tris-HCl 10 mM pH 7,5 et stocker la solution stock à -20 ° C. Déterminer la concentration en peptide correct sur ​​un spectrophotomètre UV-Vis de l'utilisation d'un coefficient d'extinction à 280 nm de 5700 M -1 cm -1.
      NOTE: Le (12-55) NC peptide a été obtenu HPLC purifié et lyophilized partir d'une solution contenant deux équivalents de chlorure de zinc.
  3. Composé 1
    1. Peser environ 1 mg du composé lyophilisé 1 en utilisant une balance analytique et dissoudre dans 100 pi de DMSO à 100%, opportunément pesés, pour obtenir une concentration élevée (≈10 mM) de solution de stock. Déterminer la concentration du composé exacte sur un spectrophotomètre UV-VIS utilisant son coefficient d'extinction (à 354 nm: 11 387 M -1 cm -1). Conserver la solution d'achat d'actions dans l'obscurité à -20 ° C avant de l'utiliser.

2. Mise en place de Gel Appareil et coulée du gel

  1. Pour mettre en place le gel, rincer deux plaques (un long et un court) avec 70% d'éthanol, les laisser sécher, puis placez deux entretoises de 1 mm le long des bords longs de la plaque plus; couvrir avec la plaque courte, et assurez-vous d'aligner les deux plaques au fond.
  2. Pour lancer le gel, suivez les instructions fournies par le suppLier (différents fournisseurs utiliser un appareil légèrement différente; pinces sandwich et des piles sont fournies par chaque appareil de coulée). Dans tous les cas, assurez-vous que les colliers, les piles et les joints sont propres, et éliminer les traces d'acrylamide laissés par les utilisateurs précédents.
  3. Placez le sandwich de gel assemblé dans le stand de coulée et suivre les instructions spécifiques par le fournisseur.
    NOTE: En général, un joint en silicone propre au fond de la fente de coulée assure une bonne étanchéité et permet d'éviter les fuites lors de la coulée du gel.
  4. Pour vérifier les fuites, verser de l'eau distillée en utilisant une pipette entre les plaques de verre. Ajouter de l'eau pour remplir le sandwich et attendre quelques minutes pour se assurer qu'il n'y a pas de fuites. Si le sandwich est correctement assemblé, éliminer l'eau et insérer un papier filtre entre les deux verres pour sécher les verres. Retirez le papier et maintenant le sandwich est prêt pour le gel coulée.
  5. Verser le gel à la température ambiante (TA, 25 ° C). Depuis polyacrylamide est très neurotoxique, porter des gants. Nouse continues gels de polyacrylamide 12% en non-dénaturation conditions (natif) pour effectuer NOM dosage.
    1. Préparer la solution de gel à 12%: mélanger 12 ml de 40% d'acrylamide / bisacrylamide (19/1) solution, 4 ml TBE 10x tampon (10x: mM, borate 890 mM, EDTA 20 mM Tris-HCl 890) et de l'eau milliQ 24 ml . Ajouter 400 ul APS et 50 ul TEMED immédiatement avant utilisation. Mélanger la solution rapidement et en utilisant une pipette pour verser la solution vers le bas entre les plaques de verre. Introduire le peigne entre les plaques de verre, en évitant les bulles. Ajouter la solution de gel pour remplir complètement le sandwich.
  6. Laissez le gel polymériser pendant 45 min à 1 h. Immédiatement avant le chargement des échantillons, enlever le peigne lentement et rincez abondamment à l'eau des puits distillée.
  7. Après les étapes de polymérisation et de puits de rinçage, suivre les instructions spécifiques par le fournisseur de placer le sandwich de gel dans l'appareil pour électrophorèse sur gel vertical. Si un système de refroidissement est présent, assurez-vous de placer le système de gel dans le corla position rect du noyau de refroidissement.
  8. Si le système est conçu pour gérer plus d'un gel, mais seulement un gel doit être exécuté, fixez un sandwich de gel comme barrage tampon au refroidissement du cœur de l'autre côté pour former la chambre complète tampon supérieure.
    REMARQUE: si le barrage ne est pas placé correctement, le tampon supérieur fuira éventuellement arrêter la course de gel.
  9. Préparer 2,5 L de TBE tampon de migration (1x: Tris-HCl 89 mM, borate 89 mM, EDTA 2 mM) dans de l'eau déminéralisée. Mis à part environ 500 ml de tampon TBE pour la chambre tampon supérieure et verser le reste dans la chambre tampon inférieure. Verser le restant 500 ml de tampon de TBE dans la chambre tampon supérieure.
  10. Placer le couvercle sur la partie supérieure de la chambre tampon inférieure, de sorte que l'anode et la cathode sont dans la position appropriée.
  11. Connectez le noyau de refroidissement, le cas échéant, à un robinet d'eau en utilisant des tuyaux. Remplissez le noyau avec de l'eau du robinet, qui agira comme un dissipateur de chaleur pendant l'électrophorèse, et laisser l'eau du robinet circuler à travers le noyau pendant élusrophoresis.

3. Nucleocapsid recuit médiée par électrophorèse (NOM) Dosage

  1. Préparation des tampons
    1. Préparer tampon TNMg: eau (1 x Tris-HCl 10 mM, NaCl 20 mM, Mg (ClO 4) 2 1 mM, pH 7,5) dans traitée au DEPC et filtrer la solution avec un filtre de taille de pore de 0,22 um.
      REMARQUE: TNMg tampon peut être stocké à 4 ° C jusqu'à 7 jours. Pour de meilleurs pliage et de recuit résultats, nous recommandons l'utilisation de tampons fraîchement préparés.
    2. Préparer le tampon de chargement de gel contenant du SDS (SDS GLB: Tris-HCl 100 mM, EDTA 4 mM, 50% p / v de glycérol, 2% p / v de SDS, 0,05% p / v de bleu de bromophénol) dans de l'eau traitée au DEPC.
      REMARQUE: GLB permet de suivre dans quelle mesure les échantillons oligonucléotides sont en cours d'exécution dans le système de gel et permet de couler les échantillons dans le gel. Addition de SDS à la GLB est une étape cruciale pour la réussite optimale de NOM dosage. Si cette étape ne est pas respectée, il ne est pas possible de distinguer les acides nucléiques dans la bande geSystème de l (figure 2).
  2. Contrôle préparation
    1. Diluer en série les oligonucléotides solutions mères et utiliser fraîchement préparées 10 uM solutions pour préparer 10 pi d'une solution à 1 M de TAR. Préparer de la même façon, séparément, 10 pi d'une cTAR 1 uM dans du tampon TNMg 1x. Chauffer chaque tube à 95 ° C pendant 5 min, puis laisser refroidir à la température ambiante pour que TAR et cTAR à assumer leurs structures tige-boucle-bosse.
    2. Préparer une solution de TAR uM hybride / cTAR comme témoin. Mélanger 1 ul de 10 uM TAR avec 1 ul de 10 uM dans cTAR TNMg 1x, dans un volume total de 10 ul. Dénaturer les oligonucléotides en chauffant le tube à 95 ° C pendant 5 minutes et laisser refroidir lentement à température ambiante pour que TAR se hybrider à sa séquence complémentaire cTAR et pour former le TAR double brin hybride / cTAR.
    3. Lorsque les solutions sont refroidis à la température ambiante, effectuer une centrifugation de courte rotation. Ajouter 3 pi de GLB SDS, une pipette each solution à l'intérieur du tube 3 fois et mettre le tube sur la glace. Gardez les échantillons de contrôle régulier sur la glace jusqu'à l'étape de chargement.
  3. La préparation des échantillons à analyser protéine NC et (12-55) l'activité de peptide NC
    1. Utiliser 2,5 ul de solution fraîchement préparée d'oligonucléotide 4 uM pour chaque échantillon. Toujours préparer un petit excédent de chaque solution pour éviter les erreurs de pipetage. Pliez 32,5 ul de 4 um solution de TAR et, séparément, des cTAR dans un tampon 1x TNMg tels que déclarés pour les contrôles préparation ci-dessus mentionnée (étape 3.2.1.).
    2. Diluer la solution mère de deux protéines NC et (12-55) NC peptide à 80 um solution avec de l'eau MilliQ.
    3. Lorsque des solutions goudron et cTAR sont refroidis à la température ambiante, effectuer une centrifugation à court spin de deux tubes et entamer la préparation des tubes échantillons.
    4. Préparer 12 ml tubes vides 0,5 autoclave. Placez trois rangées de quatre tubes dans le rack pour les échantillons de laboratoire. Chaque ligne indique respectivement les échantillons à analyser ee pleine longueur protéine NC, les échantillons sans protéines et les échantillons à analyser le (12-55) l'activité de peptide NC.
    5. Toujours remplacer les conseils à tout moment un réactif différent est utilisé.
    6. Ajouter dans chaque tube 2,5 pi de TAR plié et replié de 2,5 pi cTAR. Ajouter de l'eau traitée par DEPC 4 ul des échantillons pour l'analyse de NC et de (12-55) NC. Ajouter de l'eau traitée par DEPC 5 ul aux autres échantillons.
    7. Ajouter 1 pi de 80 pM ou NC 1 ul de 80 uM (12 à 55) pour les échantillons NC pour, respectivement, ou NC (12-55) analyse NC.
    8. Ajouter immédiatement 3 pi de GLB SDS aux échantillons min temps 0 (déclarés comme 0 'dans la figure 1), pipetage la solution à l'intérieur de chaque tube trois fois, et enfin mettre le tube sur la glace. Répétez cette étape pour tous les échantillons et les contrôles. Gardez les échantillons constante sur la glace jusqu'à l'étape de chargement.
    9. Après 15 min, 30 min et 1 heure d'incubation à la température ambiante, ajouter 3 pi de GLB SDS, une pipette la solution à l'intérieur each tube 3 fois et mettre le tube sur la glace. Répétez cette étape pour tous les échantillons et les contrôles, respectivement, et garder sur la glace jusqu'à ce que l'étape de chargement.
    10. Enlever le couvercle de l'appareil de gel. Charge 13 pi de chaque échantillon dans les puits formés comme décrit précédemment par coulée du gel avec un peigne de formation de puits. Charger les échantillons en suivant l'ordre indiqué dans la figure 1.
    11. Remettre le couvercle de l'appareil de gel. Attacher les fils de l'appareil de gel à l'alimentation électrique. Vérifiez que les électrodes sont branchés dans les emplacements corrects dans l'alimentation.
    12. Tournez sur la puissance et exécuter le gel pendant 2 heures et 30 minutes à une tension constante de 200 V, jusqu'à ce que le colorant a migré à 1,5 cm au-dessus du fond du gel.
  4. La préparation des échantillons pour analyser l'activité de l'anthraquinone sur NC et (12-55) NC
    1. Diluer la solution mère de composé 1. Préparer 10 ul de 500 uM, 250 uM, 50 uM, 5 uM de dilution du composé 1 dans de l'eau MilliQ.
    2. Préparer les échantillons de contrôle comme indiqué ci-dessus (paragraphe 3.2.).
    3. Utiliser 2,5 ul de solution fraîchement préparée d'oligonucléotide 4 uM pour chaque échantillon. Toujours préparer un petit excédent de chaque solution pour éviter les erreurs de pipetage. Pliez 27,5 ul de 4 um solution de TAR et, séparément, des cTAR dans un tampon TNMg 1x comme ci-dessus mentionné (étape 3.2.1.).
    4. Diluer la solution mère de deux protéines NC et (12-55) NC peptide à 80 um solution dans l'eau.
    5. Lorsque des solutions goudron et cTAR sont refroidis à la température ambiante, effectuer une centrifugation à court spin de deux tubes et entamer la préparation des échantillons.
    6. Préparer 20 ml tubes vides 0,5 autoclave. Placez deux rangées de 10 tubes chacun dans le rack pour les échantillons de laboratoire.
    7. Toujours remplacer les conseils à tout moment un réactif différent est utilisé.
    8. Ajouter tous les tubes de la première rangée avec 2,5 pi de TAR plié. Ajouter tous les tubes de la deuxième rangée avec 2,5 pi de cTAR plié.
    9. Ajouter 2 ul du composé approprié Une dilution (augmentation de la concentration des 5 uM à la dilution de 500 um) à TAR et à cTAR. Remplacer composé avec de l'eau dans les échantillons pour l'analyse de NC et (12-55) NC en l'absence de composé. Incuber les échantillons pendant 15 min à température ambiante.
    10. Après 15 minutes d'incubation, mélanger les échantillons cTAR (tubes de deuxième rangée) avec les échantillons correspondant TAR (tubes de première ligne).
    11. Ajouter 1 ul de 80 uM NC ou 1 pi de 80 uM (12-55) NC aux échantillons pour NC ou (12-55) l'analyse NC, respectivement.
    12. Après 15 minutes d'incubation, ajouter 3 pi de GLB SDS, une pipette chaque tube 3 fois et mettre le tube sur la glace. Répétez cette étape, respectivement, en utilisant les échantillons pour NC et (12-55) l'analyse NC. Gardez les échantillons constante sur la glace jusqu'à l'étape de chargement.
    13. Enlever le couvercle de l'appareil de gel. Charger 13 pi de chaque échantillon dans les puits. Charger les échantillons en suivant l'ordre indiqué dans la figureure 3B.
    14. Remettre le couvercle de l'appareil de gel. Attacher les fils de l'appareil de gel à l'alimentation électrique. Vérifiez que les électrodes sont branchés dans les emplacements corrects dans l'alimentation.
    15. Tournez sur la puissance et exécuter le gel pendant 2 heures et 30 minutes à une tension constante de 200 V, jusqu'à ce que le colorant a migré à 1,5 cm au-dessus du fond du gel.
  5. La préparation des échantillons: Mode Oligo-préincubation vs le mode NC-préincubation
    1. Diluer le composé Une solution mère. Préparer 10 pi des 500 uM, 250 uM, 50 uM, 5 uM de dilution du composé 1 dans de l'eau MilliQ.
    2. Préparer les échantillons de contrôle comme indiqué ci-dessus (paragraphe 3.2.).
    3. Utiliser 2,5 ul de solution d'oligonucléotide 4 uM pour chaque échantillon. Toujours préparer un petit excédent de chaque solution pour éviter les erreurs de pipetage. Pliez 27,5 ul de 4 um solution de TAR et, séparément, des cTAR dans un tampon TNMg 1x comme mentionné ci-dessus (étape 3.20,1.).
    4. Diluer la solution mère de deux protéines NC et (12-55) NC peptide à 80 um solution dans l'eau.
    5. Lorsque des solutions goudron et cTAR sont refroidis à la température ambiante, effectuer une centrifugation à court spin de deux tubes et entamer la préparation des échantillons.
    6. Toujours remplacer des conseils chaque fois réactifs sont modifiés ou si tout autre liquide ou solution contenue dans le tube de réaction est touché.
    7. De cette étape sur veillez à étiqueter clairement et séparer les échantillons pour les deux procédures de pré-incubation différents.
      1. Mode Oligo-préincubation
        1. Préparer 10 ml tubes vides 0,5 autoclave. Placez deux rangées de cinq tubes dans le rack pour les échantillons de laboratoire.
        2. Ajouter dans chaque tube de la rangée premiers 2,5 pi de TAR plié. Ajouter dans chaque tube de la deuxième rangée 2,5 ul pliée cTAR.
        3. Ajouter 2 ul du composé approprié Une dilution (augmentation de la concentration des 5 uM à la dilution de 500 um) à TAR et à cTAR.Remplacer composé avec de l'eau dans les échantillons pour l'analyse de NC en l'absence de composé. Incuber les échantillons pendant 15 min à température ambiante.
        4. Après 15 minutes d'incubation, prélever les échantillons cTAR (deuxième rangée) et les mettre avec les échantillons correspondant TAR (première rangée).
        5. Ajouter 1 pi de 80 pM NC à chaque échantillon et incuber les échantillons pendant 15 min à température ambiante.
        6. Après 15 minutes d'incubation, ajouter 3 pi de GLB SDS, une pipette chaque tube 3 fois et mettre le tube sur la glace. Gardez les échantillons constante sur la glace jusqu'à l'étape de chargement.
      2. NC préincubation mode
        1. Préparer 5 ml tubes vides 0,5 autoclave et placez-les dans le rack pour les échantillons de laboratoire.
        2. Ajouter dans chaque tube 4 ul du composé approprié une dilution (augmentation de la concentration de la 5 uM à la dilution de 500 M). Remplacer composé avec de l'eau dans les échantillons pour l'analyse de NC en l'absence de composé.
        3. Ajouter dans chaque tube 1 pl de 80 μ; M NC et incuber les échantillons pendant 15 min à température ambiante.
        4. Mélanger 15 pi de TAR plié avec 15 pi de cTAR plié dans un tube et utiliser cette solution TAR + cTAR à l'étape suivante.
        5. Après 15 min d'incubation, ajouter à chaque échantillon 5 ul de la solution de mélange TAR cTAR + et incuber les échantillons pendant 15 min à température ambiante.
        6. Après 15 minutes d'incubation, ajouter 3 pi de GLB SDS, une pipette chaque tube 3 fois et mettre le tube sur la glace. Gardez les échantillons constante sur la glace jusqu'à l'étape de chargement.
          NOTE: De l'étape 3.5.8 sur une analyse peut être effectuée avec tous les échantillons (CV) de 3.5.7.
    8. Enlever le couvercle de l'appareil de gel. Charger 13 pi de chaque échantillon dans les puits. Charger les échantillons en suivant l'ordre indiqué dans la figure 4.
    9. Remettre le couvercle de l'appareil de gel. Attacher les fils de l'appareil de gel à l'alimentation électrique. Vérifiez que les électrodes sont branchés dans les emplacements corrects dans le suppl de puissancey.
    10. Tournez sur la puissance et exécuter le gel pendant 2 heures et 30 minutes à une tension constante de 200 V, jusqu'à ce que le colorant a migré à 1,5 cm au-dessus du fond du gel.

4. Retrait du gel et gel coloration

  1. Après électrophorèse, éteignez l'alimentation et débrancher les fils électriques. Fermez le robinet d'eau du système de refroidissement et de débrancher les tuyaux du noyau.
  2. Retirer le couvercle, et, si le système a été refroidi, retirez le noyau de refroidissement et jeter le tampon des deux chambres.
  3. Démontez doucement le sandwich de gel de l'appareil et retirez tous les colliers des plaques de verre. Pour enlever le gel des plaques, pousser l'une des entretoises sur le côté des plaques et tournez doucement pour tirer vers le haut et loin de la plaque de verre supérieure. Saisissez deux coins du gel et soulevez-le doucement pour le retirer du verre.
  4. Placer le gel dans un récipient approprié avec la solution de coloration des acides nucléiques souhaitée pour30-45 min en remuant.
  5. Après coloration, le gel mis sur un système d'imagerie par transillumination pour détecter des acides nucléiques signal de fluorescence dans le système de gel.

Résultats

La figure 1 montre un résultat représentatif de l'essai Nucleocapsid recuit Mediated électrophorèse (NOM), effectué i) avec la protéine recombinante pleine longueur, ii) sans la protéine, ce est à dire le mélange cTAR + TAR et l'incubation jusqu'à 1 heure à température ambiante, et iii ) le même essai réalisé avec (12-55) NC, un peptide synthétique ne ayant pas les 11 acides aminés du domaine N-terminal. Le TRE pré-pliée et cTAR ont été mélangés et la formation d'heteroduplex recuit du TRE / cTAR a été contrôlée en présence de la pleine longueur recombinant NC (voies gauche de la figure 1), en l'absence de protéine (pistes au centre de la figure 1 ), et en présence des (12-55) NC (peptides tronqués voies de droite sur la figure 1). Les contrôles sont: croisés cTAR, TAR pliées et recuites hybride (TAR / cTAR), obtenu par dénaturation thermique des structures de manière stable pliées de TAR à cTAR suivie par leur annealin lenteg. 14

La capacité de NC pour dénaturer deux séquences d'acide nucléique stables dans l'hélice heteroduplex étendue est clairement évidente: la pleine longueur de protéine NC conduit immédiatement à la formation de la TAR / cTAR hybride: 0 »indique le temps minimal passant entre l'addition de NC pour les échantillons et addition de tampon de chargement de gel, ce qui stoppe la réaction; formation complète est déjà atteint après 15 'temps d'incubation. L'augmentation de l'intensité de l'hétéroduplex recuit est parallèle à la diminution de l'intensité des oligonucléotides cTAR TAR et pliées. La formation d'heteroduplex est obtenu également en présence de la forme tronquée, ce est à dire le (12-55) NC, confirmant l'activité biologique du peptide synthétique. En l'absence de la protéine ou du peptide de la formation d'heteroduplex est pas respecté, et le goudron et les oligonucleotides cTAR ne se anneler à la température ambiante dans l'hétéroduplex (figure 1). Entoutes les expériences, la formation rapide des intermédiaires instables (les «complexes intermédiaires» à la figure 1) qui diminuent au fil du temps est observée, en conformité avec le mécanisme proposé d'échange de brin à travers les épingles de cTAR et TAR jusqu'à ce que les acides nucléiques repliement correct. 17

Un dépannage possible de l'expérience est le manque de SDS dans le tampon de chargement de gel. En l'absence de SDS dans le GLB le résultat de la réaction est représenté sur la figure 2 et par rapport à l'issue de GLB + SDS. Le TAR pré-plié et cTAR étaient mélangés et incubés pendant 3 heures à température ambiante d'pendant 3 heures à 37 ° C avec le pleine longueur protéine NC recombinant. Après incubation, les échantillons ont été divisés en deux: d'une moitié du tampon de charge de gel sans SDS (GLB) a été ajoutée, tandis que l'autre moitié était GLB avec SDS (SDS GLB). Les échantillons ont été chargés sur le gel, et la position des bandes d'acides nucléiques a été visualisée après que le gel de fonctionner parcolorant coloration. Lorsque NC était présent mais les échantillons ont été chargé avec GLB, toutes les bandes des acides nucléiques ont été décalées vers le haut: ce est prévu et indique une forte liaison entre la protéine et les acides nucléiques. Les résultats avec GLB SDS sont présentés dans l'extrême droite du gel: l'addition de SDS dénature les protéines et libère les acides nucléiques du complexe stable avec la protéine, ce qui permet la comparaison avec les contrôles.

Le dosage de nom est utilisé pour évaluer la capacité de filetage intercalateurs pour stabiliser des structures dynamiques d'acide nucléique et d'inhiber NC activité chaperon. 14 intercalateurs Threading sont des molécules aromatiques planaires substitués par des chaînes latérales volumineuses situées sur les sites opposés du système de cycle, comme l'anthraquinone représentés sur la figure 3A. 18 Ces agents intercalants sont en mesure de fil à travers la double hélice des acides nucléiques, localiser finalement leurs chaînes latérales dans chaque sillon de la doublehélice. 19,20

La figure 3B montre les résultats de l'essai NOM en présence du composé 1, un agent intercalant de filetage connu, 18 en présence de pleine longueur NC ou du peptide tronqué. Dans les deux cas, la formation de l'hybride TAR / cTAR par NC est réduite en augmentant la concentration de l'agent intercalant, tandis que, en même temps, la quantité de goudron libre et augmente cTAR. La forme tronquée de la protéine dépourvue de la queue N-terminale (12-55NC) est plus sensible à l'inhibition de son activité: cette différence a été vérifiée avec les composés testés à ce jour.

Le dosage de nom peut être réalisé de deux manières, soit par pré-incubation du composé d'essai avec NC, puis on ajoute les oligonucleotides pliées (mode NC-préincubation), ou en pré-incubant le composé d'essai pendant 15 min avec les substrats d'acides nucléiques pliées , suivi par l'addition de NC et une nouvelle incubation pendant 15 min (oligo-prmode eincubation). Bien que le temps total d'incubation est le même dans les deux modes, la préincubation avec les oligonucléotides pliées avant l'addition du NC permet plus de temps pour l'enfilage des intercalants dans l'acide nucléique repliée. Il en résulte une stabilisation plus forte de leurs structures dynamiques et plus facile en une inhibition des activités chaperonnes CN. L'analyse de l'essai de NOM dans les deux modes améliore donc les différences dans le mécanisme d'action des inhibiteurs de NF, comme représenté sur la figure 4: lorsque le composé 1 a été analysée par leur nom dans le mode d'oligo-préincubation (figure 4, voies à gauche) il montre une inhibition puissante de recuit NC-médiée, alors que l'inhibition observée est beaucoup plus faible dans le mode NC-préincubation (figure 4, voies à droite). Se il vous plaît noter que pour la détermination des concentrations inhibitrices Pendant le filtrage séries de composés apparentés avec ce dosage et dans ces conditions, chacun EXPERIment doit être effectuée au moins en triple, avec des concentrations très rapprochées (en particulier autour de la valeur IC 50). 14

figure-results-1
Figure 1:. NOM dosage avec pleine longueur et avec le NC (12-55) NC TAR Plié et cTAR, chaque 1 uM tronqué, ont été incubées avec recombinant NC ou avec (12-55) NC (oligos / NC = 1 / 8) de 0 min, 15 min, 30 min et 1 h. TAR cTAR et incubées en l'absence de protéine (0 min, 15 min, 30 min et 1 h) ont été utilisés comme témoin négatif. TAR plié, plié cTAR hybride et le TRE / cTAR obtenus après dénaturation thermique suivie d'un recuit in vitro ont été utilisés comme témoins. Les réactions ont ensuite cessé d'utiliser GLB SDS. Les échantillons ont été séparés sur un gel de Polyacrylamide à 12% dans 1 x TBE; Après électrophorèse des acides nucléiques sur le gel ont été colorées et détecté sur un transilluminateur.

figure-results-2
Figure 2:. Effet de SDS dans le tampon de chargement de gel (GLB) lors de l'analyse TAR / cTAR recuit par NC TAR et cTAR, préplié dans TNMg 1x, ont été incubées avec pleine longueur recombinantes NC (oligos / NC = 1/8) pour 3 h à la température ambiante ou à 37 ° C. GLB GLB ou SDS ont ensuite été ajoutés aux échantillons incubés avec NC. Contrôles: TAR, cTAR et TAR hybride recuit / cTAR (chacun 1 uM). L'électrophorèse a été effectuée en utilisant un gel de Polyacrylamide à 12% dans du TBE 1x; Après électrophorèse des acides nucléiques sur le gel ont été colorées et détecté sur un transilluminateur. Ce chiffre a été modifié depuis Figure S4:. Sosic, A. et al Conception, synthèse et l'évaluation biologique de goudron et de liants cTAR que le VIH-1 inhibiteurs de la nucléocapside MedChemComm 4, 1388-1393, doi:. 10.1039 / c3md00212h (2013) .

"> figure-results-3
Figure 3: (A) la structure chimique du filetage intercalant 1. (B) Effet de filetage intercalant une évalués par NOM dosage. Plié TAR et cTAR, chaque 1 uM, ont été incubées en présence de concentrations indiquées du composé avec une pleine longueur NC ou avec le (12-55) NC, chaque 8 uM. TAR plié, plié cTAR et de la TAR hétéroduplex étendue / cTAR ont été utilisés comme témoins. Les réactions ont ensuite cessé d'utiliser GLB SDS. Les échantillons ont été séparés sur un gel de Polyacrylamide à 12% dans 1 x TBE; Après électrophorèse des acides nucléiques sur le gel ont été colorées et détecté sur un transilluminateur.

figure-results-4
Figure 4: Oligo-préincubation par rapport modes NC-préincubation: effets sur NOM dosage Oligo-préincubation mod.e: TAR pliée et repliée cTAR, chaque 1 uM, ont été pré-incubées avec les concentrations indiquées du filetage intercalant une pendant 15 minutes, puis pendant encore 15 min en présence de la pleine longueur NC (8 uM) NC-de préincubation. Mode: les concentrations indiquées du filetage intercalant 1 ont été pré-incubé avec la pleine longueur NC (8 uM) pendant 15 min, puis pendant encore 15 min en présence de TAR plié et replié cTAR, chaque 1 uM. TAR plié, plié cTAR et de la TAR hétéroduplex étendue / cTAR ont été utilisés comme témoins. Toutes les réactions ont finalement cessé d'utiliser GLB SDS. Les échantillons ont été séparés sur un gel de Polyacrylamide à 12% dans 1 x TBE; Après électrophorèse des acides nucléiques sur le gel ont été colorées et détecté sur un transilluminateur.

Discussion

NAME est un test qui permet d'évaluer rapidement l'inhibition de l'activité de chaperon de la protéine de nucléocapside du VIH-1, une cible intéressante pour la recherche de nouveaux médicaments anti-VIH. NC annèle rapide et à des acides nucléiques de température ambiante dont pliage stable exigerait autrement dénaturation thermique à haute température suivi d'un recuit prudent. Le dosage peut être effectué soit avec pleine longueur NC ou avec le tronquée (12-55) NC: dans les deux cas, les deux acides nucléiques (ARN et sa copie d'ADN complémentaire) sont recuits rapidement. Ceci est cohérent avec l'observation de la littérature avec le tronc NC peptide: recuit est initiée par la fusion efficace de la tige de cTAR suivie par interaction de la boucle apicale complémentaire, qui est un faible site de liaison de NF, avec la séquence complémentaire de TAR boucle apicale, de se retrouver à travers plusieurs intermédiaires instables à l'hybride recuit étendu. 21

NC est une prot très stableein et quelques problèmes lors de NOM performant peuvent se produire. Il est très important cependant pour ajouter SDS fraîchement préparés dans le Gel Loading Buffer utilisé pour arrêter la réaction: si cela ne est pas atteint, le gel ne sera pas montrer les bandes d'acides nucléiques dans les positions correctes. En fait, NC est une protéine de liaison d'acide nucléique, de sorte que de visualiser correctement TAR / cTAR heteroduplex par électrophorèse sur gel de SDS doit être présent dans le tampon de chargement de gel pour dénaturer la protéine et le libérer de son complexe étanche avec les acides nucléiques. Ce est aussi un possible dépannage de l'expérience, ce est à dire la formation de bandes décalées pendant la course au gel. Cet effet est particulièrement évident lorsque la pleine longueur NC a été utilisé, comme dans la figure 2, et est liée à la présence de la queue N-terminale fortement basique, ayant un effet d'agrégation solide sur les acides nucléiques.

La présence de la queue de base terminal effectue la réaction de recuit plus difficile d'être inhibé, comme le montrentn à la figure 3 en utilisant le composé 1, un filetage intercalant représentant, soit une intercalant particulièrement efficace à stabiliser les structures tige-boucle de goudron et de cTAR. En fait, ce type d'interaction avec des acides nucléiques est favorisée lorsque des renflements et des boucles interrompent la continuité de la double hélice, ce qui permet un enfilage plus facile de les substituants volumineux dans les paires de bases. Stabilisation de TAR et cTAR par ces liants d'acides nucléiques a été préalablement analysé par la détermination de l'augmentation de la température de fusion des deux oligonucleotides. 14 En outre, l'augmentation de la température de fusion est en corrélation avec l'inhibition de l'hybridation catalysée par le VIH-1 NC, conduisant à la formation réduite de la TAR hétéroduplex / cTAR et indiquant que intercalants filetage constituent une classe intéressante de liants pour des structures dynamiques de l'ARN tel que l'élément TAR. 14

Le mécanisme d'action invoquée pour ces compounds peut encore être validé en effectuant le test in NOM différents formats de rechange, comme représenté sur la figure 4: dans le cas des agents intercalants de l'inhibition de recuit heteroduplex est améliorée lorsque le médicament est incubé avec les deux oligos pliées. Composés agissant avec mécanisme d'action différent, comme liants directs de la protéine NC, seraient moins touchés par les différents mode de pré-incubation. NOM test effectué dans les deux méthodes peuvent donc être utilisés pour cribler des bibliothèques de composés pour l'identification d'inhibiteurs NC, et aussi pour évaluer le mécanisme d'action présumé des réponses positives lors de la recherche pour les médicaments anti-VIH ciblées au NC. De toute évidence, l'utilisation de ces seules techniques lors réclamé un mécanisme spécifique d'action des inhibiteurs identifiés NC ne est pas suffisant, et d'autres tests biochimiques appropriés sont nécessaires pour soutenir l'hypothèse de travail. 14

Enfin, il faut souligner que NOM utilise trèsenzymes purifiées, soit recombinaison ou de synthèse, ce qui donne des informations précieuses sur l'inhibition "in vitro" de NC par les composés testés. Ce est la "force et la faiblesse" de l'essai: NOM peut ainsi compléter criblage virtuel et modélisation moléculaire approches dans les étapes préliminaires de programmes de découverte de médicaments, permettant de construire et d'analyser rapidement les relations structure-activité et éventuellement réorienter la conception de synthèse et de drogues. Cependant, comme d'autres dosages biochimiques utilisés dans des projets de développement de médicaments dans le VIH, NOM ne donnera pas d'informations sur les effets des inhibiteurs putatifs dans les cellules infectées par le virus.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par Ministero degli Affari Esteri (MAE, DRPG, Unità per la cooperazione scientifica e tecnologica, Grant : PGR Italy-USA) et par MIUR, Progetti di Ricerca di Interesse Nazionale (Grant : 2010W2KM5L_006).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
cTAR, oligo-ADN 29-mer. Dessalé. HPLC purifié.Metabion International AGStockez la solution stock à -20 ° ; C  ;
TAR, ARN oligo-mère 29. Dessalé. HPLC purifié.  ;   ;Metabion International AGStocker l’aliquote de stock à -80 ° ; C  ;
(12-55)NC peptideEspiKem srlStocker la solution mère à -20 ° ; C
Tubes de 1,5 mlEppendorf0030 120 086Autoclave avant utilisation
Tubes de 0,5 mlEppendorf0030 121 023Autoclave avant utilisation
Biosphere Filter Tips 0.1-10 µ ; lSarstedt701,130,210
Embouts filtrants pour la biosphère 2-20 & micro ; lSarstedt70,760,213
Infos filtres pour la biosphère 200  ; et micro ; lSarstedt70,760,213
Filtre à seringue 0,22  ; et micro ; mBiosigma srl51,798
ÉthanolCarlo Erba414631
Dodécylsulfate de sodiumSigma-Aldrich71725-50G
Sulfoxyde de diméthyleSigma-AldrichD8418-1L
Chlorure de sodiumSigma-Aldrich71376-1KG
Acide boriqueSigma-AldrichB0252-2.5KG
Acide éthylènediaminetétraacétiqueSigma-AldrichE5134-500G
Perchloratede magnésium Sigma-Aldrich222283-100GStocker le 1  ; M à -20  ; ° ; C
GlycérolSigma-Aldrich49770-1L
Bleu de bromophénolGE Soins de santé Sciences de la vie17-1329-01
N,N,N&prime ;,N&prime ; -TétraméthyléthylènediamineSigma-AldrichT9281-100ML
Persulfate d’ammoniumSigma-AldrichA7460-500GPréparez la solution à 10 % fraîchement avant utilisation
Acrylamide-bis solution prête à l’emploi 40 % (19:1)Merck Millipore1006401000Le polyacrylamide est hautement neurotoxique : porter des gants pendant la coulée
de gel Tris ultrapurApplichemA1086, 1000
Eau traitée DEPCAmbionAM9922
Centrifugeuse 5415REppendorf22,621,408
Spectromètre NanoDrop 1000Spectromètre Thermo Scientific
UV-VIS Lambda 20Perkin Elmer
Protean II xi CellBio-Rad165-1803
Alimentation de base PowerPacBio-Rad164-5050
SybrGreen II Coloration au gel d’ARNLonza50523Effectuez la dilution 1/10 000 dans TBE 1x. Rangez-le dans l’obscurité à 4 ° ; C pendant deux semaines.
Système d’imagerie Geliance 600Perkin Elmer

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