Ciblé méthylation de l'ADN Analyse par séquençage de nouvelle génération

Résumé

Le séquençage d’amplicon au bisulfite (BSAS) est une méthode de quantification de la méthylation de la cytosine dans les régions génomiques ciblées d’intérêt. Cette méthode utilise la conversion au bisulfite associée à l’amplification par PCR des régions cibles avant le séquençage de nouvelle génération pour produire une quantification absolue de la méthylation de l’ADN à un niveau spécifique à la base.

Résumé

Le rôle des processus épigénétiques dans le contrôle de l’expression des gènes est connu depuis un certain nombre d’années. La méthylation de l’ADN au niveau des résidus de cytosine est particulièrement intéressante pour les études épigénétiques, car il a été démontré qu’elle est à la fois un régulateur durable et dynamique de l’expression des gènes. Les efforts visant à examiner les changements épigénétiques dans la santé et la maladie ont été entravés par le manque de méthodes à haut débit et quantitativement précises. Avec l’avènement et la popularisation des technologies de séquençage de nouvelle génération (NGS), ces outils sont maintenant appliqués à l’épigénomique en plus des méthodologies génomiques et transcriptomiques existantes. Pour les études épigénétiques de la méthylation de la cytosine où des régions d’intérêt, telles que des promoteurs de gènes spécifiques ou des îlots CpG, ont été identifiées et où il est nécessaire d’examiner un nombre important d’échantillons avec une grande précision quantitative, nous avons développé une méthode appelée séquençage d’amplicon au bisulfite (BSAS). Cette méthode combine la conversion au bisulfite avec l’amplification ciblée des régions d’intérêt, la construction de bibliothèques médiées par des transposomes et le NGS de paillasse. BSAS offre une méthode rapide et efficace pour l’analyse d’un maximum de 10 kb de régions ciblées dans un maximum de 96 échantillons à la fois, qui peut être effectuée par la plupart des groupes de recherche possédant des compétences de base en biologie moléculaire. Les résultats fournissent une quantification absolue de la méthylation de la cytosine avec une spécificité de base. BSAS peut être appliqué à n’importe quelle région génomique à partir de n’importe quelle source d’ADN. Cette méthode est utile pour les études de vérification d’hypothèses sur les régions cibles d’intérêt ainsi que pour la confirmation des régions identifiées dans les analyses de méthylation à l’échelle du génome, telles que le séquençage au bisulfite du génome entier, le séquençage au bisulfite à représentation réduite et le séquençage par immunoprécipitation de l’ADN méthylé.

Introduction

Il a été plus d'un demi-siècle, depuis le premier rapport de modifications de l'ADN d'origine naturelle sous forme de méthylation de cytosine ^1. La méthylation des cytosines est une base cytosine nucleotide modifié où la 5 ^ème carbone sur l'anneau de base a un groupe méthyle (5-mC), se produisant le plus fréquemment dans le dinucléotide CpG motif dans les génomes de mammifères. La présence fonctionnelle de 5-mC dans les promoteurs de gènes est généralement associée à la répression transcriptionnelle, tandis que l'absence est associée à une activité de transcription ^2.

D'énormes progrès ont été réalisés dans notre compréhension du rôle de la méthylation de l'ADN dans le développement ^3, transgénérationnelle propagation de profils épigénétiques ^4, la pathogenèse du cancer ^5,6, et un certain nombre d'autres domaines de recherche. Beaucoup de ces progrès sont venus au cours des dernières années que de nouvelles méthodes ont été développées pour le profil de méthylation de l'ADN ^7. Avec l'avènement etpopularisation de séquençage de prochaine génération (NGS) techniques il ya maintenant un certain nombre de méthodes pour le profil méthylation de l'ADN dans un génome entier ou de grandes régions d'un génome ^huit. Ces approches ouvrent la possibilité d'études de découverte qui permettent de quantifier les modèles et les différences de méthylation de l'ADN méthylation ADN. En plus de ces approches hypothèse génératrices, il existe un besoin important pour cible / ADN hypothèse de test méthodes méthylation de quantification.

Pyroséquençage, PCR spécifique de la méthylation et séquençage Sanger directe de l'ADN converti au bisulfite ont été les méthodes les plus utilisées pour l'analyse des régions ciblées (ce est à dire, une région promotrice d'un seul gène ou d'un îlot CpG) ^9-12. Toutes ces méthodes reposent sur ​​la conversion au bisulfite, une réaction de désamination chimique où la cytosine non méthylées sont converties en de de l'uracile, la cytosine méthylés tandis que de ^13,14 restent intacts. L'amplification par PCR de bisulfite-Résultats d'ADN converties en uracile de remplacement de la thymine avec ¹⁵ permettant la méthylation différentielle à lire comme une différence de base. Bien que très utile, les limites de ces méthodes comprennent faible précision quantitatives, faible longueur de lecture, faible capacité, et d'échantillon. Pour répondre à ces limitations nous avons développé une méthode que nous avons appelé bisulfite Amplicon séquençage (BSAS) ^16. L'objectif de cette méthode est d'être capable d'analyser des régions génomiques cibles d'intérêt dans un grand nombre d'échantillons avec une précision quantitative élevé.

BSAS utilise des éléments de méthodes existantes (conversion au bisulfite et l'amplification de la PCR spécifique à la région) et les combine avec une simple construction de la prochaine génération bibliothèque (transposome médiation) ¹⁷ et paillasse NGS ¹⁸ (Figure 1). Cette approche fournit un procédé de débit quantitatif plus élevé et à examiner la méthylation de la cytosine dans ne importe quelle région d'intérêt. Nous présentons ici laméthode en détail et décrire des approches pour le dépannage et vérification de la qualité du processus BSAS.

Protocole

1. Isolement de l'acide nucléique à partir du tissu

REMARQUE: Co-isolement de l'ADN et de l'ARN à partir du même échantillon de tissu offre la possibilité de recueillir l'ADN pour une analyse épigénétique et ARN appariées pour l'analyse de l'expression génique. L'exemple donné ici est une forme de la colonne de purification du tissu expérimental, mais des approches alternatives pour différents types d'échantillons ou d'autres méthodes d'isolement peut être utilisé. L'exigence principale est de l'acide nucléique hautement purifiée sans contaminer protéines ou des solvants organiques.

1. Sélectionnez un morceau de tissu frais congelé ou frais pour l'homogénéisation mécanique et placer sur la glace. Magasin ou un tissu de transfert à un fond rond microtube 2,0 ml.
2. Ajouter une bille de 5 mm en acier inoxydable à chaque tube contenant du tissu. Ajouter une quantité appropriée de tampon de lyse, basé sur les suggestions du fabricant de nombre de cellules ou le poids des tissus.
3. Homogénéiser le tissu en utilisant une homogénéisation mécanique au broyeur à billes30 Hz pendant 30 sec.
   REMARQUE: La fréquence et la durée de l'homogénéisation mécanique dépend du type de tissu. Tissus tendres seront complètement homogénéiser en utilisant les paramètres recommandés, alors que les tissus plus sévères nécessitent la mise en optimisation.
4. Effectuer l'isolement de l'ADN et de l'ARN en utilisant des colonnes de centrifugation de silice à la température ambiante suivant le protocole du fabricant.
   1. Elute ARN dans 50 ul d'eau sans RNase et lieu sur la glace. Utilisation de l'ARN pour l'analyse de l'expression des ARNm par PCR quantitative.
   2. Eluer l'ADN dans 100 ul de tampon TE. Répétez élution hors colonne d'ADN en utilisant l'éluant pour augmenter la concentration de l'ADN et le rendement. Utilisation pour la quantification de l'ADN ciblé de la méthylation.
5. Évaluer la qualité de l'ADN et de l'ARN en utilisant un spectrophotomètre standard pour absorbance à 230 nm, 260 nm, 280 nm et 320 nm.
   NOTE: A260 taux / A280 devrait être ~ 1,8 à 2 pour les ADN de haute qualité. A260 rapport qualité / A280 devrait être ~ 2 pour l'ARN de haute qualité. La présence d'un excès absorbance à 230 nm indicates contaminants de la procédure d'isolement.
6. Vérifier la qualité de l'ARN en utilisant en outre une puce d'électrophorèse capillaire selon les instructions du fabricant.
   REMARQUE: ARN de haute qualité aura un certain nombre d'intégrité de l'ARN (RIN)> 8. La présence de pics supplémentaires dans l'électrophorégramme en outre des pics d'ARNr indiquer une contamination de l'échantillon.
7. Quantification de l'ADN et de l'ARN par dosage par fluorescence selon le protocole du fabricant.
   NOTE: L'utilisation d'un dosage fluorométrique est plus sensible et spécifique pour la quantification des acides nucléiques que spectrophotométrie seul.
8. Magasin ADN et de l'ARN isolé à -80 ° C.

2. Identification cible et l'amorce de conception

1. Déterminer la région génomique (s) d'intérêt à analyser par BSAS sur la base de la séquence du génome de référence approprié. Les promoteurs de gènes de gènes exprimés de manière différentielle sont des objectifs communs de méthylation quantification.
2. Préparer un bisulfite in silico-convertgénome de référence pour l'alignement ed tard du séquençage lit en modifiant le fichier de séquence .fasta dans un éditeur de texte. Dans l'orientation 5'-3 ', remplacer les non-CpG avec de la cytosine (la figure 2) de la thymine.
3. Conception des ensembles d'amorces pour amplifier les régions d'intérêt de l'ADN converti au bisulfite.
   1. Sélectionnez et copiez la région non converti d'intérêt, dans l'orientation 5'-3 ', dans une PCR programme de conception d'amorce spécifique de bisulfite (Figure 3).
      REMARQUE: Un optimale au bisulfite PCR longueur d'amplicon est de 250 à 400 pb par amplicon que des fragments d'ADN et traitement au bisulfite, il est difficile pour amplifier grandes> 400 pb régions. Si, par exemple, une région de 1 kb présente un intérêt, de multiples paires d'amorces peuvent être conçues pour couvrir cette région. Conception amplicons d'être de la taille de pb égal pour la mise en commun facile. Évitez longueurs d'amplicon <250 pb, car ceux-ci peuvent être d'une longueur insuffisante pour la génération bibliothèque. Une longueur de l'amorce optimale pour BSAS est>20 points de base par amorce.
   2. Choisissez une gamme T _m de 55 à 65 ° C et une différence _m max de T entre amorces sens et antisens de 1-2 ° C.
   3. Sélectionner des paires d'amorces qui couvrent le mieux la région d'intérêt. Ne pas sélectionner des amorces qui contiennent des sites CpG ou directement à côté de sites CpG, car cela provoquerait biais dans les réactions PCR. Utilisez amorces PCR standard qui peuvent être commandés depuis ne importe quel nombre de fournisseurs académiques ou commerciales.
   4. Reconstituer amorces lyophilisées dans RNase / DNase eau libre à un stock de travail de 100 um.
4. Magasin amorces PCR à -20 ° C. Diluer 100 uM amorce stocks à 10 um stock de travail pour les réactions PCR.

3. Optimisation PCR spécifique bisulfite

NOTE: Pour conversion au bisulfite de l'ADN génomique, un certain nombre de différents kits commerciaux pour conversion au bisulfite sont disponibles. Sélectionnez le kit ou le protocole qui convient le mieux l'expérience prévue.

1. Utilisation entre 200 ng à 2 pg d'ADN génomique. Pour les expériences d'optimisation, exécuter plusieurs réactions de conversion afin d'avoir suffisamment de bisulfite converti ADN pour plusieurs réactions BS PCR.
2. Utilisation petites (par exemple, 10 ul) des volumes d'élution de l'ADN converti au bisulfite pour maintenir des concentrations élevées d'ADN.
   REMARQUE: 1-2 pi de l'ADN converti au bisulfite est suffisante pour les réactions PCR d'optimisation si une pg d'ADN génomique a été utilisé pour l'entrée de conversion.
3. Amplifier bisulfite ADN converti par PCR spécifique bisulfite. BS-réactions PCR nécessitent l'aide d'un Taq polymérase capable d'amplifier l'ADN converti au bisulfite.
   1. Assemblez la réaction suivante pour l'optimisation cible d'amplification d'un seul amplicon. Pour plusieurs échantillons, assembler des réactions dans une plaque PCR 96 puits.
      2x tampon de réaction de 25 ul
      0,5 ul de mélange dNTP
      5 pi 10 Forward Primer uM (finale 1 uM)
      5 ul de 10 uM amorce inverse(Finale 1 uM)
      2 ul de matrice d'ADN converti au bisulfite
      0,4 pi (5 U / ul) d'ADN polymerase
      12,1 eau libre de DNase ul (volume réactionnel final de 50 pi)
   2. Sceller plaque PCR avec l'adhésif approprié ou film thermo-scellé.
   3. Placez réaction dans un cycleur thermique approprié et utiliser les conditions de cyclage suivantes avec un couvercle chauffée:
      1. Effectuer une dénaturation initiale à 95 ° C pendant 10 min.
      2. Dénaturer à 95 ° C pendant 30 sec.
      3. Recuit pendant 30 secondes à la _Tm des amorces spécifiques des cours d'utilisation. Commencer à une température de recuit de quelques ° C au-dessous de la _Tm de l'amorce pour des réactions d'optimisation.
         NOTE: Les meilleurs températures de recuit peuvent également être déterminées en utilisant un cycleur thermique gradient de tester une gamme de températures.
      4. Effectuer une extension à 72 ° C pendant 30 secondes. Allonger le temps d'extension pour plus amplicons.
      5. Répétez les étapes 3.3.3.2-3.3.3.4 pour 35 cycles àtal pour l'optimisation initiale. Un plus grand nombre de cycles peuvent être nécessaires, mais doivent généralement être évité pour prévenir amplifications clonales qui créeront des artefacts de réaction.
      6. Effectuez une extension finale à 72 ° C pendant 7 min.
      7. Maintenir réactions à 4 ° C.
   4. Visualisez amplicons par électrophorèse PAGE. En variante, en utilisant une puce à ADN d'électrophorèse capillaire selon le protocole du fabricant.
      1. Mélanger 24 ul de la réaction PCR avec 6 pi de 5x colorant de charge sur la glace et le vortex.
      2. Faire 1 L de TBE 1x tampon de migration en mélangeant 200 ml de 5x TBE courir tampon et 800 ml de ddH ₂ O. Diluer échelle d'ADN à une concentration finale de 0,5 ug par puits dans ddH ₂ O et de colorant de charge.
      3. puits de charge avec 30 pi de réactions PCR ou échelle.
      4. Exécutez le gel à 200 V pour ~ 45 min. Arrêter le cycle de gel lorsque le premier front de colorant atteigne l'extrémité du gel.
      5. Colorer le gel avec 5 ug / mlbromure d'éthidium en mélangeant 5 ul de 10 mg / ml dans 100 ml de ddH ₂ O. Couvrir l'ensemble gel, et laisser incuber pendant ~ 5 min.
      6. Image du gel via une boîte de lumière UV ou imageur multimodal à une longueur d'onde d'excitation de 482 nm.
      7. En référence à l'échelle, la taille des amplicons PCR et déterminer la spécificité de la réaction par la recherche de plusieurs bandes autres que la taille de l'amplimère attendu (figure 4A et C).
   5. Lorsque les conditions optimales pour BS-PCR ne ont été déterminées, effectuez BS-PCR sur des échantillons expérimentaux.
      1. Purifier amplicons à partir d'amorces restantes et les autres composants de la réaction. Effectuer silice purification sur colonne, SPRI perle, ou à base de gel de nettoyage et de quantification.
      2. Amplicons Éluer de tampon TE 30 pi.
      3. Quantifier amplicons utilisant dosage fluorométrique utilisant les protocoles du fabricant.
      4. Se il ya plusieurs amplicons par échantillon, en commun eux à poids égal par volumemontants et conserver à -20 ° C.

4. NGS Bibliothèque préparation et Bibliothèque QC

REMARQUE: la préparation de la bibliothèque BSAS NGS utilise un protocole de médiation transposome simplifiée avec double indexation (Voir liste des matières pour plus de détails sur la bibliothèque sélection de kit de préparation). Cette méthode fournit une voie extrêmement rapide et à haut débit pour la construction bibliothèque qui a été validée et montre peu ou pas de biais dans les applications de séquençage bisulfite ^16,19. Double-indexation permet un multiplexage élevé d'échantillons que seule indexation. Autres styles de préparation bibliothèque peut être possible mais ne ont pas été testés.

1. Préparer bibliothèques END de amplicons BS PCR dans une plaque PCR 96 puits. Diluer amplicons à 0,2 ng / pl pour une masse d'entrée finale de 1 ng, ou 5 ul de la 0,2 ng / ul de dilution. Effectuer un nettoyage des bibliothèques générés en utilisant des billes SPRI. Utilisation de 50 à 90 ul de perles pour isoler SPRI w bibliothèquesvec ce protocole. Le volume de billes SPRI dépend de la taille cible de la bibliothèque et le nombre de cycle de réactions de séquençage souhaités.
   REMARQUE: Utilisez un agitateur de microplaques ou une plaque vortex pour remettre en suspension des perles.
   1. Éluer les bibliothèques et les billes hors de transférer une nouvelle plaque à 96 puits et sceller avec un film de scellement à chaud pour le stockage à -20 ° C.
2. Déterminer la taille et la concentration des bibliothèques (Figure 4B et D).
   1. Bibliothèques exécuté sur un ADN d'électrophorèse capillaire puce d'ensimage selon les protocoles du fabricant.
      1. Utilisation d'un dosage d'ADN par électrophorèse capillaire à haute sensibilité pour déterminer la taille moyenne des pics détectés de la bibliothèque et une estimation de molarité selon les protocoles du fabricant.
   2. Quantifier les bibliothèques par qPCR, utilisant des amorces conçues contre les séquences d'adaptation dans les bibliothèques générés et normes d'utilisation avec une concentration connue.
      1. Exécuter qPCR reactions sur un instrument en temps réel en utilisant les paramètres de quantification absolue selon les protocoles du fabricant.
      2. Utiliser la taille des bibliothèques et la quantification molaire de qPCR pour calculer les concentrations molaires des bibliothèques.
3. Diluer bibliothèques à 4 nm en utilisant 10 mM de Tris-Cl avec 0,1% de Tween-20 à pH 8,5. bibliothèques de magasins dans un 96 puits plaque PCR scellée avec un film de scellage à chaud à -20 ° C.

5. bibliothèques de séquençage en utilisant un séquenceur de paillasse

1. Dégeler et préparer des réactifs selon les instructions du fabricant.
2. Décongeler quatre bibliothèques nm sur glace.
3. Faire 1 ml de NaOH 0,2 N dans un tube de 1,5 ml.
4. Piscine 4 bibliothèques nM dans des quantités de volume égal, si plusieurs bibliothèques doivent être utilisés.
5. Diluer et de dénaturer bibliothèques regroupées selon les instructions du fabricant à la concentration souhaitée molaire final.
   1. Gardez dilué et dénaturerbibliothèque commun sur la glace jusqu'au moment de charger réactif sur la cartouche.
6. Générer une information d'index feuille d'échantillon contenant les noms d'échantillons et correspondant et spécifiez pour générer .fastq fichiers seulement.
   1. feuille d'échantillon de charge dans le dossier de la feuille d'échantillon correspondant sur le séquenceur.
7. Ajouter un total de 600 ul dilués et bibliothèque dénaturé à la cartouche de réactif dans le puits correspondant.
8. Exécutez les réactions de séquençage à terminaison.

Analyse 6. méthylation quantification de données

NOTE: Il ya plusieurs programmes disponibles pour l'analyse des données de l'END comprenant à la fois commerciaux et open source. Détails sur les programmes en cours d'exécution peuvent être trouvés avec chaque emballage spécifique. Instructions générales sont donnés à chaque étape avec les commandes spécifiques pour ce logiciel. (Voir liste des matières pour plus de détails sur les logiciels utilisés dans ce protocole).

1. Les fichiers importation en soi appropriéeéchelonnement analyse pipeline conservant scores de qualité (Qscores) pour une utilisation en lecture rognage. (Pour ce programme de exemple, sélectionnez "Importer" et sélectionnez la méthode de séquençage utilisée pour générer lit. Sélectionnez .fastq.gz lire les fichiers à importer, et de conserver Qscores à partir de fichiers en lecture .fastq coupe applications en décochant «se défaire qualité scores» sous la rubrique «Général Options '. Choisissez un emplacement pour le importée lectures et sélectionnez «Terminer».)
   1. Coupez et retenir lectures en utilisant les paramètres suivants dans un NGS analyse des données pipeline. (Pour ce programme sélectionnez 'trim séquences' sous 'END base Outils' et sélectionnez les lectures d'être taillés.)
      1. Conservez ne lit contenant scores ≥ Q30. (Pour ce programme sélectionnez «Couper l'aide des scores de qualité» et fixer la limite à 0,001.)
      2. Conserver lit seulement contenant ≤ 1 nucléotide ambiguë. (Pour ce programme, sélectionnez «Ajuster les nucléotides ambiguës et régler la'Nombre maximum d'ambiguïtés "à 1. Choisissez un emplacement pour enregistrer garni lit et sélectionnez« Terminer ».)
   2. Carte coupé lit à l'in silico bisulfite converti référence gène de 2,2. (Pour que le logiciel exemple sélectionner 'Carte Lit de Référence »sous la rubrique« END base Outils'. Sélectionnez garni indique être cartographiés et sélectionnez "Suivant". Sélectionnez la séquence de référence converti et sélectionnez «pas de masquage" sous "masquage de référence '. Sélectionnez' suivant '.)
      1. Attribuer une peine maximale pour l'inadéquation, insertions et suppressions. Réglez les paramètres tels que 100% de la longueur de lecture est nécessaire pour la carte d'identité de séquence avec 90%. Par exemple logiciels, attribuer un score de 3 pour inadéquations, insertions et suppressions. Attribuer un score de 1 pour la fraction minimum de la longueur de lecture mappé à la référence, et attribuer un score de 0,9 pour la fraction minimum d'identité entre cartographiée lire et référence.
      3. Pour la sortie d'alignement générer chaque échantillon dans un fichier indépendant. Par exemple logiciel, sélectionnez «Créer autonome lire mappages» sous «Options de sortie» et «Enregistrer» sous «la manipulation de résultats". Sélectionnez un emplacement pour enregistrer le mappage de lecture et sélectionnez «Terminer».
   3. Exécutez une variante appelant flux de travail sur le lit mappé. Pour le logiciel exemple, sélectionnez «probabiliste Variant Détection 'sous' Resequencing Analyse», sélectionnez le mappage de lecture à analyser et sélectionnez «Suivant». Sélectionnez «Ignorer matchs non-spécifiques» sous «Lire filtres» et sélectionnez «Suivant».
      1. Assurez-vous que la séquence est à un depe de ≥ 1,000 X en définissant la «couverture minimale» sous «Importance» pour 1000.
      2. Assurez-vous que la variante d'appel est présent à la fois avant et arrière lit. Par exemple logiciel, sélectionnez «Exiger la présence à la fois avant et arrière des stands» sous «filtres variante» et sélectionnez «Suivant».
      3. Export alignés, variante appelée données comme une table annoté. Par exemple logiciel, sélectionnez "Créer une table annoté» sous «Options de sortie" et sélectionnez un emplacement pour enregistrer le fichier de table de variantes. Sélectionnez «Terminer».
2. Calculer le pourcentage 5-mC utilisant les variantes de fréquences sites CpG annotés dans la région d'intérêt à partir du fichier de table de variantes. La fréquence de la cytosine à une référence C dans CG est le pourcentage 5-mC.
   REMARQUE: Lorsque vous utilisez la variante appelant algorithmes pour CpG hautement méthylés de remplacer cytosines CpG avec thymines. Cela identify cytosine de l'mappée comme variantes, résultant de la fréquence de cytosine en CpG de.
3. Déterminer l'efficacité de conversion au bisulfite (BSC) en calculant d'abord le pourcentage de C ne est pas dans les sites CpG dans la référence (C). Multiplier le pourcentage de non CpG C de par le nombre de mappé (T _mp) de totale T, et diviser par le nombre total de C mappé à la référence (C _MPT) de T. 100 moins la fréquence calculée est l'efficacité de conversion au bisulfite (BSC) de cette bibliothèque (équation 1).



Equation 1. bisulfite de rendement de conversion.
REMARQUE: Bien que les génomes de mammifères contiennent de très faibles quantités de non-CpG méthylation de cytosine (à l'exception éventuellement de cellules souches ^20), les génomes des plantes contiennent une quantité importante. Afin de déterminer l'efficacité de conversion au bisulfite dans ces référee génomes, une voie appropriée pour le séquençage est une partie du génome mitochondrial ou chloroplastique génome ou des gènes non méthylées connues présentes dans les génomes végétaux ²¹ et calcul de l'efficacité de conversion, comme décrit ci-dessus. L'efficacité de conversion au bisulfite devrait être ≥98% dans la plupart des cas, avec de l'inconverti C pouvant découler du non méthylation CpG.

Résultats

BSAS lectures correctement aligné à la séquence de référence convertie ressemblera Figure 5. Dinucléotides CpG peuvent être clairement identifiés et les états de méthylation peuvent être estimées en observant les appels de base sur les sites CpG dans le lit mappé. Par exemple, avec des commandes de méthylation, 0% méthylation se traduira par toutes les lectures mises en correspondance avec les sites CpG contenant (figure 5A) de T. 100% des contrôles de méthylation se traduiront par toutes les lectures mappé à lit contenant des sites CpG (figure 5B) de C.

La quantification de la fréquence de la cytosine (C / C + T) à des sites CpG donne la fréquence de méthylation dans l'échantillon d'origine. Une courbe étalon générée à partir de commandes représentant de méthylation du génome entier (n = 3 / taux de méthylation) montre la linéarité de la méthylation de quantification ainsi que la précision de quantification à chaque taux de méthylation (figure 6). A titre d'exemple de ce procédé, au total, de l'ARN et de l'ADN ont été co-iso culé des cervelet de souris et de la rétine (n = 4 / groupe). Expression rhodopsine, sélectivement exprimée dans les tissus de la rétine, a été mesurée en utilisant qPCR. L'expression a été détectée seulement dans la rétine (figure 7A). Utilisation BSAS, les niveaux de méthylation de CpG ont été quantifiés dans la région de promoteur de la rhodopsine. Les niveaux de méthylation cumulatifs à travers la région de promoteur était> 80% dans le cervelet par rapport à <15% dans la rétine (p <0,001, test t paramétrique) (Figure 7B). BSAS quantification avantages de méthylation spécifique du site de méthylation ainsi la quantification des niveaux de méthylation peuvent être comparés sur une base spécifique de CpG à travers une région génomique donnée. CpG niveaux de méthylation de tout le promoteur de la rhodopsine étaient significativement plus élevés dans les échantillons cérébelleux échantillons par rapport à la rétine (p <0,001, test t paramétrique sur chaque site CpG) (Figure 7c).

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Figure 1:. Schéma de la méthode BSAS Dans ce procédé, l'ADN génomique est converti au bisulfite de modifier les cytosines de unmethylation à uraciles. Par la suite, au cours de ces PCR uraciles sont modifiés pour thymines. Amplification par PCR est dirigé contre les régions d'intérêt et très enrichit pour seulement ces séquences. Les amplicons PCR résultants sont transformés en bibliothèques double indexées par un processus de tagmentation simple. Ensuite, les bibliothèques sont séquencés sur un séquenceur paillasse de la prochaine génération et le séquençage lectures sont mappés sur la converti in silico séquence de référence et pour cent de méthylation de la cytosine est déterminée d'une manière spécifique à la base.

Figure 2:. Dans silico conversion au bisulfite de région d'intérêt Toute région d'intérêt de toute référence génomique peut être sélecTed in silico pour conversion au bisulfite. Cytosines non-CpG sont remplacés par de la thymine dans la séquence de référence. Cytosines CpG restent cytosines converties au bisulfite dans la référence.

Figure 3:. Amorces placement Primer bisulfite PCR sont conçus contre une in silico bisulfite converti séquence de référence. Amorces doivent être conçus de sorte qu'ils ne se chevauchent pas dinucléotides CG ou conçus à côté de dinucléotides CG.

Figure 4: Exemples de amplicons de PCR de haute qualité et pauvres et les bibliothèques de séquençage traces de électrophérogramme représentatifs et son émission de gel (A) de amplicon idéal pour la génération de la bibliothèque de transposome médiation avec un seul haut.produit de concentration. (B) Bibliothèque généré à partir de ce amplicon montre une forte concentration et même la distribution de taille. (C) amplicons de PCR de mauvaise qualité peuvent être faible en taille, la concentration, et contient de multiples produits et / ou de dimères d'amorces. Ces amplicons de mauvaise qualité conduiront à (D) a échoué génération bibliothèque faible concentration et la distribution de faible taille.

Figure 5: Exemples de résultats de séquençage de contrôles de méthylation. (A) Dans silico converti séquençage de référence avec des sites CpG sur fond rouge. 0% de contrôle de méthylation mappé lit de la région indiquant thymines sélectionnés (la cupidité de surbrillance) de cartographie des sites CpG. Commande (B) 100% de méthylation mappé lit montrer (surbrillance bleue) la cartographie de cytosine sur les sites CpG.

Figure 6:. Méthylation quantification travers une série de contrôles de méthylation contrôles de méthylation du génome tout mélangé à des taux de méthylation (n = 3 / Ratio) de 0% à 100% ont été quantifiés en utilisant BSAS. Tracé de la quantification de prévu contre quantifiée démontre linéarité du contrôle de méthylation quantification. Dans tous les contrôles, il y avait une grande précision dans la méthylation de quantification.

Figure 7: Exemple de paires méthylation de l'ADN et l'expression du gène à partir de l'analyse des échantillons de tissus. (A) Rhodopsin relatif d'expression d'ARNm à partir du cervelet de la souris et du tissu rétinien. (B) la méthylation du promoteur Rhodopsin moyenne quantifiée par BSAS entre cérébelleux et de l'ADN de la rétine (*** p <0,001, test t paramétrique). C) spécifique de CpG à travers le site promoteur de la rhodopsine (-244 à 6, par rapport au site d'initiation de transcription [TSS]) dans le cervelet de souris et de l'ADN rétine.

Discussion

BSAS permet de concentré, la quantification précise de méthylation d'ADN avec des capacités de débit élevées à la fois dans le nombre d'échantillons, le nombre de cibles. En outre, cette génération bibliothèque à l'aide de tagmentation transposome médiation nécessite l'ADN d'entrée moins, est plus rapide et contient moins d'étapes que cisaillement traditionnelle et les techniques de ligature adaptateur ultérieures. Ces améliorations par rapport aux méthodes existantes permettent précise le niveau base de l'analyse de méthylation d'ADN de toute cible d'intérêt. En outre, BSAS fournit une nouvelle méthode de confirmation de régions d'intérêt (régions de méthylation de manière différentielle (DMR), îlots CpG, régions réglementaires) qui ont été identifiés à l'aide de génomes entiers bisulfite ²² ou capturer ²³ approches. En utilisant des approches de confirmation orthogonales et plus quantitativement méthodes précises améliore la rigueur analytique des études épigénomiques. La profondeur de lecture élevé atteint avec BSAS permet une quantification précise dans un intervalle de confiance étroit, rectsconsulting dans la quantification précise ^16. En outre, la capacité d'exécuter de nombreux échantillons en une seule expérience peut augmenter la taille de l'échantillon pour les confirmations de méthodes du génome entier, ce qui augmentera la puissance statistique; une faiblesse de nombreuses études épigénétiques actuelles. Surtout, BSAS fournit une quantification spécifique de méthylation CpG-base, ce qui permet la génération d'hypothèses vérifiables pour la recherche en épigénétique. Les hypothèses comme l'augmentation de la méthylation à un élément de réponse spécifique provoque une diminution de la liaison d'un facteur de transcription spécifique. BSAS, combinées avec les données d'expression d'ARNm couplés, fournit un procédé d'obtention à la fois la régulation épigénétique et l'expression de l'ARNm au sein d'une seule pièce de tissu ou population de cellules. Mesures paires de régulation et l'expression augmentent également la rigueur scientifique et l'impact des résultats.

Les étapes critiques au sein du protocole BSAS comprennent la conception primaire, l'optimisation de l'amplicon, et la génération de bibliothèque /QC. Biais PCR est introduit si amorces sont pas bien conçus et amplifient l'efficacité à différents ^8. L'utilisation de normes de méthylation, comme 100% et 0% cytosine méthylés normes générés par voie enzymatique, peut être utilisé pour déterminer le degré, le cas échéant, de partialité méthylation de quantification, et est un contrôle méthodologique appropriée lors de la quantification méthylation ^16. De même, il faut prendre soin lors de l'optimisation des réactions de PCR pour générer un seul amplicon de haute qualité. Si aucun amplicon est présent en utilisant les lignes directrices proposées décrites dans le protocole, des mesures d'optimisation comprennent l'augmentation du nombre de cycles PCR ou le montant d'entrée bsDNA. Se il ya des produits de PCR multiples, y compris des dimères d'amorces, des mesures d'optimisation comprennent quantité décroissante d'entrée bsDNA, diminuant les concentrations d'entrée molaires d'amorces PCR, la hausse des températures de recuit, ou en diminuant le nombre de cycles PCR. L'un ou une combinaison de ces procédures d'optimisation donne des résultats suffisants pour générer une seule higamplicon h-qualité. Alternativement, la refonte amorces est une bonne approche pour jeux d'amorces qui ne produisent pas un seul amplicon. Dans les régions où la refonte ne est pas approprié ou possible, dégénérer jeux d'amorces dont les deux peuvent travailler de la cytosine et la thymine de sites CpG dans amorces sens et de l'adénine et la guanine de sur les sites CpG dans amorces inverses. Cependant, ces jeux d'amorces doivent poursuite de l'optimisation pour se assurer qu'aucun biais PCR est en cours, un processus en dehors du champ d'application de ce protocole. bibliothèques de qualité sont extrêmement important pour le succès. Assurez-vous que QC mesures sont effectuées pour déterminer la taille, la qualité et la quantité des bibliothèques avant séquençage. Les réactions de séquençage sont sujettes à l'échec avec la participation des bibliothèques de faible qualité. Biais dans la méthylation quantification peut être atténué en veillant à ce que les fréquences de méthylation sont présents à la fois avant et arrière lit séquençage. De plus, les scores de qualité de l'alignement des bases de sites CpG devraient être ≥Q30 pour la haute confidence dans la quantification. Alors que d'autres ont montré précédemment peu ou pas de biais dans les réactions de tagmentation de bisulfite ADN converti ^19, assurant que les mesures décrites ci-dessus permet de confirmation de faible quantification biais de méthylation.

BSAS mesure actuellement méthylation des sites CpG, cependant, de futures extensions de cette méthode permettra mesures paires de CpG 5-HMC avec l'ajout d'étapes expérimentales distinction entre 5-mC et 5-HMC telles que l'introduction perruthénate de potassium avant la conversion au bisulfite ^24. Cela permettra d'accroître l'impact de l'utilité BSAS en permettant pour la méthylation jumelé, deux 5-mC et 5-HMC, et des données d'expression afin de déterminer les rôles régulation de l'expression des gènes de méthylation de l'ADN. Préparation de bibliothèque Transposome médiée par des amplicons PCR ne entraîne une diminution de la profondeur de séquençage aux extrémités des régions amplifiées. Par conséquent, les régions d'un grand intérêt devraient être conçus pour résider dans le milieu de amplicons. Commentjamais, parce que BSAS génère séquençage lire profondeurs de> 1000 X, la précision quantitative de 5-mC mesures près des extrémités des régions amplifiées reste élevé.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agilent 2100 Bioanlyzer	Agilent	G29393AA
Agilent RNA 6000 Nano kit	Agilent	5067-1511
Agilent Kit ADN Haute Sensibilité	Agilent	5067-4626
Typhoon 9200	Amersham/GE Healthcare Life Sciences
Agencourt AMPure XP - Purification PCR	Beckman Coulter	A63880	5 ml
Alimentation de base PowerPac	Bio Rad	164-5050
twin.tech plaque PCR 96  ;	Eppendorf	951020362	de thermoscellage semi-jupe
	Eppendorf	0030127838
Feuille de thermoscellage	Eppendorf	0030127854
Thermoscelleuse	Eppendorf	5390000.024
0.1-10 μ ; l Embouts	Eppendorf	0030073.002
2-200 μ ; l Pointes	Eppendorf	0030073.045
50-1 000 μ ; l Embouts	Eppendorf	0030073.100
MixMate  ;	Eppendorf	5353000.014
1,5 ml Tubes à microcentrifuger	Eppendorf	0030121.023
Centrifugeuse 5424	Eppendorf	5424000.010
2,0 ml Tube à microcentrifuger	Eppendorf	022363352
Nextera XT Kit de préparation d’échantillons d’ADN	Illumina	FC-131-1024	24 rxn
Nextera XT Index Kit	Illumina	FC-131-1001	24 indexes
MiSeq Desktop Sequencer	Illumina
MiSeq Reagent Kit v2	Illumina	MS-102-2002	300 cycles
KAPA SYBR FAST Kit universel qPCR	KAPA Biosystems	KK4824
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay	kit Life Technologies	P7589
Quant-iT RiboGreen Kit de dosage de l’ARN	Life Technologies	R11490
Système de PCR ProFlex à 96 puits	Life Technologies	4484075
Gel d’ADN Novex 6 % TBE	Technologies	EC6261BOX	Tampon
de fonctionnement Novex TBE		LC6675	5x (1 L)
Tampon d’échantillon à haute densité Novex Life Technologies		LC6678	5x (10 ml)
1 Kb Plus DNA	Ladder Life Technologies	10787-018
Xcell SureLock Mini-Cell	Life Technologies	EI0001
UltraPure 10 mg/ml Bromure d’éthidium	Life Technologies	15585-011
7900HT Système de PCR rapide en temps réel	Life Technologies	4329001	bloc de 384 puits
DynaMag-96 Side Skirted	Life Technologies	12027
SpectroMax M2 Multimode Lecteur de microplaques	Molecular Devices/VWR	89429-532
AllPrep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen	80204
Perles en acier inoxydable	Qiagen	69989	5 mm
CLC Genomics Workbench	Qiagen		Logiciel pour pipeline de méthylation
QIAQuick Kit de purification PCR	Qiagen	28104	50 rxn
TissueLyser II	Retsch/Qiagen	85300
Eau sans nucléase	Sigma	W4502
TRIS chlorhydrate	Sigma	PHG0002-100G
Tween-20	Sigma	P9416-50ML
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
384 puits à jupe complète, standard	Thermo Scientific	AB-1384
Absolute qPCR Seal	Thermo Scientific	AB-1170
EZ DNA Methylation-Lightning kit	Zymo Research	D5030	50 rxn
ADN polymérase ZymoTaq	Zymo Research	E2001	50 rxn