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Article de méthode

Enquête mât cellules sécrétoires granulés; de biosynthèse d'exocytose

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DOI :

10.3791/52505

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26 janvier 2015

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1Department of Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2Division of Allergy and Immunology, Department of Pediatrics, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, University of Cincinnati College of Medicine, 3Laboratory of Membrane Trafficking Mechanisms, Department of Developmental Biology and Neurosciences, Graduate School of Life Sciences, Tohoku University

Dans cet article

Résumé

L'objectif du présent Protocole est de développer une méthode qui permettra aux analyses de génomique fonctionnelle de la sécrétion des mastocytes. Le protocole est basé sur l'évaluation quantitative de la libération d'un gène rapporteur fluorescent cotrasfected avec le gène d'intérêt et des analyses en temps réel de la morphologie du granule sécrétoire.

Résumé

Mastocytes (MC) sont des cellules sécrétoires du système immunitaire qui accomplissent leurs fonctions physiologiques et pathologiques en libérant des médiateurs allergiques, inflammatoires et immunorégulateurs préformés et nouvellement synthétisés. Les médiateurs de MCs affectent plusieurs tissus et organes aboutissant à des réactions allergiques et immunitaires. La synthèse, le stockage et la libération des médiateurs MC sont très réglementés. Les médiateurs préformés sont emballés dans des granules sécrétoires cytoplasmiques (SG) qui fusionnent avec la membrane plasmique et libèrent leur contenu par exocytose régulée. Nous présentons un protocole basé sur la co-expression d'un gène d'intérêt avec un gène rapporteur qui est ciblée pour la GV et est libéré de manière régulée à côté des médiateurs endogènes SG. Le protocole permet haute résolution confocale quatre dimensions analyses de la MC SG et le suivi de leur calendrier de biogenèse d'exocytose déclenché. Ainsi, en utilisant ce protocole pour le dépistage de gènes entreEST pour leur impact phénotypique et fonctionnelle permet de déchiffrer les mécanismes moléculaires qui régissent la biogenèse et l'exocytose de la MC SG et l'identification des organismes de réglementation concernés. Ainsi, de nouvelles informations sur les mécanismes cellulaires qui représentent fonction MCs en matière de santé et de la maladie devraient être fournis.

Introduction

Mastocytes (MC) sont des cellules immunitaires qui sont les mieux connus pour leur implication dans des réactions allergiques et inflammatoires telles que l'arthrite, l'asthme, l'oesophagite à éosinophiles, la dermatite chronique et choc anaphylactique 1,2 ainsi que d'autres pathologies dont la maladie coronarienne et 3,5 le cancer 3,4. En outre, MCs jouent un rôle important dans l'immunité innée et adaptative, tant en défense de l'hôte contre les bactéries et les parasites et par la suppression de la réponse immunitaire, par exemple induire la tolérance 5,6 allogreffe.

MC proviennent de la moelle osseuse, le développement du CD34 + / CD117 + cellules progénitrices pluripotentes 7. Engagé moelle osseuse MC progéniteurs sont libérés dans la circulation sanguine et migrent dans les tissus périphériques de localisation principalement dans les tissus conjonctifs et les surfaces épithéliales 8. Maturation et différenciation terminale sont finalement atteints sous l'influence of cytokines au sein du milieu environnant de 8,9.

MCs peuvent être activés par un allergène (antigène, Ag), dont la rencontre entraîné la production d'immunoglobuline E (IgE) de type anticorps. La liaison d'une telle IgE aux récepteurs FceRI de la MC, suivie par une reticulation de cellule IgE liée à une nouvelle exposition à la même Ag, conduit à l'agrégation FceRI et l'initiation d'une cascade de signalisation qui aboutit à la dégranulation cellulaire [commentaire à 10,11] . MCs sont également activés, indépendamment des IgE, par neuropeptides 5,12, les toxines 13, bactérienne et antigènes viraux 14,15, un certain nombre de peptides chargés positivement collectivement dénommées sécrétagogues de base, cellules immunitaires et de cytokines 5,13,12,16 , 17. MCs sont également activés par beaucoup de leurs propres médiateurs libérés, qui amplifient encore la réponse inflammatoire.

MCs sont emballés avec des granules sécrétoires (SGS) qui contiennent immunomédiateurs réglementaires, y compris des amines vasoactives telles que l'histamine et de la sérotonine (chez les rongeurs), des protéoglycanes, des proteases telles que la tryptase et la chymase, facteur de croissance vasculaire endothéliale et de plusieurs cytokines et de chimiokines 8,9. Ces médiateurs sont "prêt à aller" et une fois MCs sont activées par un stimulus approprié, ces médiateurs sont libérés des cellules par exocytose régulée (de dégranulation) dans une affaire de secondes à quelques minutes 18,19. Cet événement initial est suivi de la synthèse de novo et la libération d'un large éventail de substances biologiquement puissants, y compris les metabolites de l'acide arachidonique, de multiples cytokines et de chimiokines 20,21,22. Libération de produits nouvellement synthétisés se produit indépendamment de presse SG. Collectivement, ces médiateurs initient précoce et la phase tardive réponses inflammatoires et allergiques. Par conséquent, la compréhension des mécanismes responsables de l'activation et de la dégranulation MC sont deux imp théorique et cliniqueOrtance.

La difficulté de manipuler génétiquement MCs primaires et de culture a entravé les tentatives pour élucider les mécanismes sous-jacents MC dégranulation qui sont encore mal résolus. Pour surmonter ce problème, nous avons développé un dosage à base rapporteur par co-transfection de la lignée cellulaire de la muqueuse de mât, rat leucémie basophiles (RBL) -2H3 (ci-après dénommé RBL) ou de moelle osseuse dérivés MCs (BMMCs) 30 avec un gène d'intérêt et neuropeptide Y (NPY) fusionné à DP monomère (mRFP), en tant que journaliste de SG.

NPY a déjà été démontré de récapituler le comportement des marqueurs de SG endogènes dans d'autres systèmes. En outre, parce que mRFP fluorescence est insensible au pH, l'expression de NPY-mRFP permet la visualisation des acides SG ainsi que l'évaluation quantitative de l'exocytose en utilisant des plaques à 96 puits et un lecteur de plaque à fluorescence. Nous avons montré que NPY-mRFP est livré à SGS acides de cellules RBL et BMMCs et est libérée par les cellulesd'une manière réglementée aux côtés de la cargaison de SG endogène (ce est à dire, β-hexosaminidase et la sérotonine) 30, 32. Ce protocole fournit une méthodologie basée imagerie à haute résolution qui permet de criblage de gènes d'intérêt pour leur phénotypique et fonctionnel incidence sur les caractéristiques de SG et la dégranulation dans des cellules RBL 32. Plus précisément, ce protocole permet un suivi en temps réel de MC SG et la quantification de leur zone de volume ou la taille, le nombre, la cinétique de l'assemblage, leur mouvement le long du cytosquelette de la cellule et leur fusion ultime avec la membrane plasmatique dans des conditions différentes. Par exemple, la sensibilisation des cellules avec DNP-IgE spécifique et déclencher les cellules avec un Ag multivalent (DNP de l'albumine de sérum conjugué) sous différentes perturbations (c.-à-knockdown de gènes d'intérêt, sur l'expression de gènes wt ou mutants, ou des manipulations pharmacologiques) et la comparaison aux cellules témoins.

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Protocole

1. Préparation de RBL Culture Cellulaire médias

  1. Mélanger 500 ml de milieu de Eagle modifié par Dulbecco faible taux de glucose (DMEM) avec 56 ml de sérum de veau fœtal (cela fait 10% de FBS), puis ajoutez 5,5 ml de pénicilline streptomycine (ce qui rend ~ 1% PEST).
  2. Filtrez les médias en utilisant 500-1000 ml Bottle-Top filtres à vide avec 0,22 um taille des pores et conserver à 4 ° C.

2. Culture de cellules RBL

  1. Cultiver les cellules RBL dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO2 à 37 ° C, dans des plaques ou flacons. Cellules RBL qui gagnent en plaques de 10 cm doivent être complétés par 10 ml de milieu et forment monocouche confluent de ~ 10 7 cellules / plaque.
  2. Lorsque la couche cellulaire se approche de la confluence, Réensemencement la culture à une densité inférieure.
    1. Retirer le milieu de culture à partir de la plaque / fiole à l'aide d'une pipette Pasteur stérile raccordée à vide.
    2. Rincer la monocouche cellulaire avec préchauffé (37° C) 0,25% de trypsine / EDTA qui couvre l'ensemble monocouche (le volume dépend de la taille de la plaque de culture / flacon; 2 ml pour 10 cm de plaque). Cela détacher les cellules.
    3. Sinon, laver la monocouche cellulaire avec tampon phosphate salin (PBS), retirez le PBS et ajouter préchauffé (37 ° C) de la trypsine / EDTA. Cette étape détache les cellules plus rapidement.
    4. Placer la plaque / fiole dans un incubateur à 37 ° C (pas plus de 10 min).
    5. Inspectez les cellules sous le microscope optique pour vérifier se ils ont détaché. Si les cellules ne se détachent au bout de 10 min, appuyez doucement sur la plaque / flacon.
    6. Ajouter moyen de la plaque de culture / flacon de suspendre les cellules (le volume du milieu doit être au moins 2 fois supérieur au volume de la solution de trypsine).
    7. Pellet les cellules par centrifugation pendant 3 minutes à 200 g à 25 ° C.
    8. Resuspendre les cellules dans un milieu. Diluer les cellules en 1h10 et épépiner dans une nouvelle boîte de culture. Incuber les cellules pendant 48 à 72 h, jusqu'à ce qu'ils REACh environ 90% de confluence.
    9. Répétez la même procédure (section 2.2.1-2.2.8) pour un maximum de trois mois (30 passages).

3. Préparation de transfection médias.

  1. Préparer une solution de 100 mM pH 7, solution 1 mM de Ca2 + et de la solution de l'acétate 100 mM d'acétate de Mg 2+ K Pipes.
  2. Diluer la solution 100 mM de K Pipes à pH 7 en utilisant 20 mM de milieu DMEM, ajouter la solution de 1 mM de Ca 2+ de l'acétate à une concentration finale de 10 uM et une solution 100 mM de Mg 2+ acétate à une concentration finale de 2 mM.
  3. Peser potassium glutamate et l'ajouter à la solution à une concentration finale de 128 mM, bien mélanger et maintenir à 4 ° C jusqu'à utilisation. Gardez les solutions restantes (ie., K-Pipes, Ca 2+ acétate, Mg 2+ acétate) à -20 ° C.

4. Transfection de cellules RBL

  1. Retirer le milieu de culture à partir de la plaque / fiole au moyen d'unpipette pasteur stérile connecté à vide.
  2. Rincer la monocouche cellulaire avec préchauffé (37 ° C) de la trypsine / EDTA qui devrait couvrir l'ensemble monocouche. Placer la plaque / fiole dans un incubateur à 37 ° C (pas plus de 10 min). Vérifiez si les cellules ont détaché en utilisant le microscope optique.
  3. Ajouter moyen de la plaque de culture / flacon de suspendre les cellules (le volume du support doit être au moins de 2 plus grande et plus que le volume de la solution de trypsine).
  4. Comptez le nombre de cellules en utilisant hémocytomètre.
  5. Pellet 1,5 × 10 7 cellules par centrifugation pendant 3 minutes à 200 x g à 25 ° C. Jeter le surnageant et ajouter 280 ul de milieu de transfection. Transférer le mélange de réaction dans 4 mm cuvette.
  6. Ajouter 20 pg de NPY-mRFP plasmide et soit 30 ug du contrôle plasmide vide ou un plasmide testé. Le volume final du mélange de réaction doit être de 300 ul.
  7. Placer immédiatement sur de la glace pendant 10 min. Essuyer la cuvette de l'eau résiduelle et procéder à une électroporation à 300 V pendant 9 ms.
  8. Pour les mesures de l'exocytose, Réensemencement les cellules immédiatement dans 24 des boîtes de culture tissulaire puits contenant 300 ul de milieu. Ajouter 8 ul du mélange de réaction (4 × 10 5 cellules) dans chaque puits. Ajouter cellules 4 × 10 5 non transfectées à des puits supplémentaires pour le contrôle. Préparer suffisamment de puits pour avoir au moins des puits en double pour chaque traitement pour chaque transfection.
  9. Par microscopie laps de temps, immédiatement Réensemencement les cellules dans un système de lamelle chambre borosilicate 8 puits contenant 80 ul de milieu. Ajouter 1,5 pi de mélange réactionnel (7,5 × 10 4 cellules) pour chaque chambre. (Essayez d'éviter d'utiliser les chambres au bord de la lamelle, les chambres au centre de la lamelle sont plus faciles à l'image).
    NOTE: Il est important, toutes les cellules de réponse de pas à un déclencheur et parfois la microscopie time-lapse est abrogée en raison de perte de concentration et de la dérive de la borosi de chambre 8 puitssystème de lamelle licate. Par conséquent, préparer au moins 8 chambres pour chaque traitement pour chaque transfection.
  10. Pour sensibiliser les cellules pendant l'activation médiée par FceRI, ajouter 1 ug / ml de DNP monoclonal de souris spécifique des IgE à la presse (incuber les cellules avec des IgE pendant au moins 2 h).
  11. Après 18 à 24 h utiliser un microscope à fluorescence pour confirmer que les cellules expriment les plasmides. Les excitation et d'émission des longueurs d'onde de la fluorescence mRFP sont: Xex 584, Xem 607 nm. NPY-mRFP devrait apparaître dans des structures vésiculaires qui correspondent aux SG. Si le second gène d'intérêt est fusionnée à un marqueur fluorescent utiliser un microscope à fluorescence pour confirmer la co-expression des deux plasmides dans les mêmes cellules. Par exemple, si le gène testé est fusionné à la GFP, Les longueurs d'onde d'excitation et d'émission de fluorescence de la GFP sont: Xex 488, Xem 507 nm. La protéine GFP étiqueté devrait apparaître dans les mêmes cellules qui expriment NPY-mRFP.
  12. Pour les mesures d'exocytose procéder to étape 5 et pour la microscopie laps de temps, passez à l'étape 6.

5. Mesure de NPY-mRFP exocytose

  1. Préparation du tampon Tyrode:
    1. Préparer une solution de 54 mM de KCl, 20 mM de MgCl2, 2,74 M de NaCl et 8 mM de NaH 2 PO 4 dans DDW. Bien mélanger et stocker à 4 ° C. Cette étape est la préparation de tampon 20x Tyrode.
    2. Préparer une solution de Hepes 20 mM pH 7, 1,8 mM CaCl 2, 1 mg / ml de BSA, 5,6 mM de glucose et de 1 à 20 dilution de Tyrode 20x dans DDW et bien mélanger. Cette étape est la préparation de tampon 1x Tyrode.
    3. Aliquoter le tampon 1x Tyrode et conserver à -20 ° C. Évitez congélation et décongélation répétée.
  2. Retirez le milieu de culture de la plaque à 24 puits et laver trois fois avec un tampon Tyrode. Préparer des cellules non stimulées en ajoutant un tampon Tyrode 200 pi aux puits témoins.
  3. Préparez 10 ul / puits de réactif d'activation concentré 20X [(par exemple, 1000 ng / ml DNP-BSA ou DNP-HSA (Ag), 200 uM de Ca 2+ ionophore (A23187 par exemple), et une combinaison de 20 uM ionophore Ca2 + et 1 000 nM 12-O- tétradécanoylphorbol-13-acétate (TPA)]. Si les réactifs sont conservés dans du DMSO, diluer les réactifs en concentration 20x dans le tampon de Tyrode contenant 1% de DMSO. Incuber à 37 ° C pendant 30 min.
  4. Retirez les surnageants de chaque puits avec soin pour une plaque de 96 puits, placer sur la glace et éviter de la lumière. (Les surnageants contiennent le peptide chimérique NPY-mRFP qui a été libéré par les cellules).
  5. Ajouter tampon Tyrode 200 pi contenant 0,5% de Triton X-100 à chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 10 min. (Cette étape est importante pour la préparation de lysats de cellules qui contiennent le restant de NPY-mRFP qui n'a pas été libéré par les cellules). Recueillir les lysats cellulaires et les transférer sur une plaque de 96 puits, placer sur la glace et éviter de la lumière.
  6. Mesurer la fluorescence des surnageants cellulaires et des lysats cellulaires en utilisant un Déessrence lecteur de plaque, en utilisant un 590-, 20 nm de bande passante excitation filtre et 635-, 35 nm filtre bande passante d'émission.
  7. Calculer le pourcentage de NPY-mRFP publié:
    NOTE: La mesure de lecteur de fluorescence unités de fluorescence arbitraires (AFU). AFU valeurs dépendent de la machine et de sa sensibilité et de l'efficacité de transfection.
    1. Réglez le autofluorescence des cellules RBL non transfectées comme vierges. Divisez la AFU de chaque surnageant à la fluorescence totale (AFU des surnageants + AFU du lysat correspondant) et multiplier par 100.

6. Time-lapse microscopie d'exocytose

  1. Graine 7,5 × 10 4 cellules de la / chambre transfectée dans un système de lamelle chambre borosilicate 8 puits. Après 18 à 24 h, éliminer le milieu de culture des chambres et laver trois fois avec un tampon Tyrode
  2. Ajouter 72 pi de tampon Tyrode à chaque chambre. Diluer les réactifs d'activation dans un tampon Tyrode à la concentration 10x.
  3. utiliser un microscope à fluorescence confocal équipé d'une chambre chauffée (37 ° C) et CO 2 de commande (4,8%) et un objectif 40X ou 63X. Activer les systèmes de microscope: lampe au mercure, un ordinateur, et des lasers. Assurez-vous que la chambre est chauffée à la bonne température avant de commencer l'expérience.
  4. Placez la chambre dans la chambre chauffée et assurez-vous que la chambre est correctement installé et stable.
  5. Allumez la lumière de fluorescence selon le fluorophore pertinentes et visualiser les cellules transfectées. Éteignez fluorescence fois une cellule d'intérêt est dans le domaine afin de minimiser le blanchiment et la cytotoxicité. Il est important que ce champ contiendra environ 3.2 cellules transfectées. Les cellules transfectées doivent être bien répartis mais ne se touchant pas les uns les autres.
  6. Réglez la puissance du laser (selon le microscope) pour minimiser le bruit et sursaturation ainsi que la toxicité, et régler le gain et le décalage de modifier le rapport signal sur bruit. Balayage rapide ouder à minimiser la durée d'exposition au laser (moyenne de 2).
  7. Ajuster la taille sténopé à un maximum, cela permet de diminuer la puissance du laser et de maintenir images porté pendant une longue période de temps. Si vous le souhaitez, définir les paramètres de la pile de Z à reconstruire l'image en trois dimensions, ajuster la taille sténopé à 1 unité aérée (UA) qui donne le meilleur rapport signal sur bruit et acquérir balayage successives de tranches optique confocal à deux dimensions dans le z -axes avec des tranches optiques ≤0.7 um.
  8. Réglez l'intervalle de temps entre chaque acquisition de 15 à 30 secondes et la durée d'acquisition totale de 15 min et commencer à acquérir des images. Après 5 minutes de pause acquisition de la série chronologique. Ajouter 8 pi de la gâchette 10x et continuer immédiatement l'acquisition.
  9. Enregistrer les images, effectuez déconvolution en utilisant un logiciel de déconvolution et de reconstruire les piles à images en trois dimensions et d'un film en utilisant un logiciel Imaris.

7. L'analyse d'images

  1. Importer les données à partir des images de séries chronologiques déconvolués qui ont été obtenues par le microscope à fluorescence confocale à Imaris logiciel. Ce logiciel lit plus de 40 fichiers microscopie. Si le logiciel ne peut pas lire les fichiers; convertir les fichiers au format TIF et l'importation.
  2. Pour ajouter des points de temps à la fin d'un ensemble de données ouverte appuyez sur Modifier -> Ajouter des points de temps et d'importer les nouveaux ensembles de données.
  3. Créer surface du canal mRFP utilisant l'option de l'assistant de surface. Choisissez l'algorithme par défaut. Choisissez le canal de NPY-mRFP. Marquez l'option de lissage pour réduire le bruit. Pour éviter la perte de petits détails de réduire le niveau de détail de la zone à 0,05 um.
  4. Réglez le seuil d'intensité. Nouvelle surface grise se affiche. Allez dans "Paramètres" et changer le style de "point central" à "Surface".
  5. Allez à l'onglet statistique dans les propriétés de l'objet sélectionné, sélectionnez l'onglet détaillée et la CUS de valeur spécifiqueh que l'intensité de fluorescence, volume, etc.
  6. Examiner les données et de confirmer que les valeurs sont compatibles avec les images. Par exemple, deux ou plus de granules adjacents peuvent être mesurés comme une plus grande granule. Pour quantifier la taille moyenne des granules diviser la taille des granules ont fusionné pour le nombre réel de granules.
  7. Exporter les ensembles de données désirées vers des fichiers Excel et analyser les données.
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Résultats

En raison de la faible efficacité de transfection des MCs, les manipulations génétiques sont peu susceptibles de laisser un impact sur les lectures de la sécrétion moyenne mesurée par SGS médiateurs endogènes. Néanmoins, en établissant la co-expression complète du gène rapporteur NPY-mRFP et le plasmide co-transfecté dans les mêmes cellules, suivi des résultats NPY-RGRF exclusivement dans le suivi de la population de cellules qui exprime le gène d'intérêt. Par conséquent, l'avantage de ce dosage par rapport aux ...

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Discussion

Nous décrivons une stratégie innovante qui combine la quantification des MCs exocytose et quatre (x, y, z, t) quantifications de dimension par imagerie de temps écoulé en trois dimensions des SG dans les cellules vivantes en utilisant un gène rapporteur pour l'exocytose. Cette technique permet le dépistage des familles de protéines pour leur impact sur la fonction MC tels que SGS de surveillance à partir dès leur sortie de l'appareil de Golgi travers leur maturation, l'acquisition de la compétence de l'e...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts financier.

Remerciements

Nous remercions le Dr U. Ashery pour le don de NPY-mRFP ADNc. Nous remercions les Drs. MJ Kofron, L. Mittleman, M. Shaharbani, et Y. Zilberstein pour son aide précieuse à la microscopie et analyse d'images. Nous remercions également le Dr Joseph Orly pour la lecture critique de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation israélienne des sciences, fondée par l'Académie israélienne des sciences (1139-1112 RS-E.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
DMEMSigma-AldrichD6046-500MLChaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation
Sérum de veau fœtalSoins de santé GE Sciences de la vieSH30071.01
Pénicilline-StreptomycineTechnologies
Membrane en acétate de cellulose, taille des pores 0,22  ; &mu ; mSigma-AldrichCLS430769-1EA
Boîtes de culture traitées pour culture tissulaire CorningSigma-AldrichCLS430167
Trypsine/EDTA Solution (TE)Life technologiesR001100Warm in 37 ° ; C bain-marie avant utilisation
TUYAUX sel dipotassiqueSigma-Aldrich108321-27-3  ;
Acétate de calcium hydratéSigma-Aldrich114460-21-8
Acétate de magnésium tétrahydratéSigma-AldrichM5661  ;
Sel de potassium de l’acide L-glutamique monohydraté (glutamate de potassium)Sigma-AldrichG1501
Cuvettes d’électroporation de 4 mmprojets de cellulesEP-104
GENE PULSER AVEC CONTRÔLEUR D’IMPULSIONS & CAPACITANCEBio rad
Verre de protection à chambreThermo scientific155411
24 puits, fond platSigma-AldrichCLS3524
Corning 96 plaquesde puits Sigma-AldrichCLS3367 ou CLS390
fluorescence de plaque à 96 puits - Infinite 200Tecan
Ionophore de calcium A23187Sigma-AldrichC7522Eviter de l’exposition directe à
la lumière 12-O-tétradécanoyl-13-acétate (TPA)CalbiochemP3766
anti-DNP monoclonal Igma-AldrichD8406  ;
DNP-BSA/ DNP-HASSigma-AldrichA6661Epreuve de l’exposition directe à la lumière
Triton-x-100Sigma-AldrichT8787
Microscope confocal fluorescent :
Zeiss LSM 510
LeicaSP5
Nikon A1 inversé
Logiciel ImarisBITLANE
Microsoft exel ou Prism ou autres logiciels
Autre réactif :
Chlorure de magnésiumMERK5833
Chlorure de sodiumMERK6404
Chlorure de calcium  ;MERK2382
Albumine sérique bovine  ;Sigma-AldrichA4503
GlucoseBDH Laboratories284515V
Phosphate monosodique  ;MERK5345
Eau
de la vieLecteur de d’analyse stérile

Références

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