The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.
Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.
Le système nerveux entérique (SNE) est organisé en deux plexus ganglionated intégrées dans la paroi du tube digestif 1. Ces circuits de neurones par voie intramusculaire, le plexus myentérique (MP) et la sous-muqueuse plexus (SMP), sont composés de neurones et de cellules gliales entérique (figure 1) 2. Le député et SMP réglementent gastro-intestinaux (GI) des fonctions telles que la motilité intestinale et l'absorption épithéliale et la sécrétion, respectivement 3. Glie entérique sont situés à proximité de neurones dans les ganglions mais les populations de cellules gliales entériques existe également dans l'interconnexion des faisceaux de fibres et des portions extra-ganglionnaires de la paroi intestinale 3,4. Glie entériques on croyait à l'origine pour fournir qu'une aide nutritive pour les neurones. Cependant, des études récentes suggèrent fortement que les interactions neurone-glie sont essentiels pour les fonctions ENS 5,6. Par exemple, les données montrent que les cellules gliales entériques "écouter" à l'activité neuronale 7et de moduler les circuits neuronaux 6,8, protéger les neurones entériques du stress oxydatif et 9 sont capables de générer de nouveaux neurones entériques en réponse à des blessures 10,11. Le protocole présenté dans cette revue technique fournit une méthode simple et robuste pour examiner l'interaction complexe entre les neurones et les cellules gliales entériques utilisant in situ intracellulaire de Ca 2+ imagerie.
Ca 2+ est une molécule de signalisation omniprésente dans les cellules excitables et joue un rôle essentiel dans les événements de signalisation synaptiques dans le système nerveux 12. L'excitation des neurones ou des cellules gliales entériques provoque une élévation de la concentration en Ca2 + cytoplasmique soit par influx par Ca2 + Les canaux -permeable ou Ca 2+ libération de réserves de calcium intracellulaire. Imagerie Ca 2 + transitoires dans les neurones et les cellules gliales avec des colorants fluorescents est établi et technique largement utilisée pour étudier l'organisation et la dynamique des fonctionnellel'ENS 13-17. Ca de l'imagerie a été montré pour être un outil important dans l'étude de segments de tissu IG intactes pour élucider la propagation de l'excitabilité à travers les réseaux de stimulateur de la CPI et 18 intestin muscle lisse 19,20. Il permet aux chercheurs de sonder un large éventail de paramètres physiologiques et fournit des informations à la fois sur leur répartition spatiale et dynamique temporelle. Les cellules peuvent être efficacement colorées de manière mini-invasive en utilisant des indicateurs fluorescents membrane perméable et protocoles de coloration optimisés 21. Ceci offre la possibilité de contrôler un grand nombre de neurones et les cellules gliales dans des préparations entériques fonctionnellement conservés 14-16,22, ainsi que in vivo 23. -Monter entiers préparations de tissus sont en vrac chargés avec une haute affinité Ca 2+ colorant indicateur comme Fluo-4 qui augmente sa fluorescence lorsqu'il est lié à Ca 2+. Les variations de fluorescence sont enregistrées par une caméra CCD et analysées numériquement 6. L'avènement de Ca2 + a été l'occasion de surveiller neurones et cellules gliales interactions, la réactivité aux différents stimuli, et la participation de ces types de cellules dans les processus gastro-intestinaux en temps réel.
In situ de l'imagerie Ca a donné une grande perspicacité dans les mécanismes de signalisation des neurones entériques et de la glie et possède plusieurs avantages distincts par rapport aux modèles de culture cellulaire 6,24. Tout d'abord, in situ préparations maintenir l'environnement de la matrice native de neurones et cellules gliales et laissent l'essentiel de leurs connexions à cibler tissu intact. Deuxièmement, la génétique et la morphologie des cellules gliales entériques cultivées sont sensiblement modifiées par rapport à 6,24 in vivo. Troisièmement, de nombreuses interactions hétérotypiques sont perdus dans la culture de cellules primaires, ce qui limite l'évaluation des interactions entre les cellules. Bien que les cellules cultivées sont bien adaptés pour l'étude des propriétés fondamentales, leur usefulness pour étudier les interactions complexes entre les cellules gliales et neurones entériques est limité. Enquête interaction neurone-glie en utilisant une approche in situ est plus physiologiquement pertinente que les voies synaptiques demeurent intacts 25. Par rapport aux approches de culture cellulaire, une approche de situ offre de meilleures conditions pour comprendre systématiquement les interactions complexes entre les neurones et les cellules gliales entériques. En outre, l'organisation planaire du plexus ganglionated dans des préparations entières montage est idéal pour l'imagerie de fluorescence de Ca2 + intracellulaire transitoires et cette technique offre une approche simple pour évaluer l'activité des neurones-glie dans l'ENS.
The methodologies described in this manuscript provide a consistent approach to effectively study neurons and enteric glia in the ENS. Although imaging neurons and enteric glia in culture has yielded a wealth of insight into the function of individual cells, studying these cells in their native, multi-cellular environment is crucial for our understanding their physiology and pathophysiology. Fluorescence microscopy is a crucial technique for assessing multidirectional interactions of cells in the ENS. Loading cells of the ENS with selective fluorescent markers and image acquisition with high-resolution microscopy permits quantitative observations of cellular activity in the ENS. Imaging live tissue samples of the ENS is performed relatively quickly and generates large amounts of in-depth functional and spatial data. Mouse myenteric and submucosal plexus preparations used in these experiments allow for molecular and genetic manipulation approaches. Ca2+ imaging in whole-mount preparations provides a useful tool for the assessment of neuron-glia interactions.
In advanced experimental paradigms, several probes can be combined to obtain information about different events within the cells. Fluorescence microscopy can record images with enhanced contrast of specific molecules, if an appropriate fluorescent label is used. Fluo-4 was chosen because it possesses a large dynamic range. Sufficient incubation time is vital when using the AM dyes in ENS. Dye concentration and loading method may need to be adjusted to achieve best results. Ideal preparations should be loaded with sufficient dye to visualize changes in fluorescence but not so much so that the dye chelates the target ions and interferes with intracellular signaling. Exposure to fluorescent light should be limited to prevent phototoxicity in cells and photobleaching of dyes.
Investigators must be careful with several steps of this experiment, especially solution and tissue preparation. Particular care has to be taken during processing and dissection of ENS tissue in order to maintain cellular functions. The GI tract contains several layers and tissue varieties, which pose challenges for dissection and imaging quality in these whole-mount preparations 27. Furthermore, the interconnecting fiber tracts of the MP are wider and ganglia are larger than those of the SMP 2. The neuronal density of the myenteric plexus is higher compared to that of the submucosal plexus 28. Slow and imprecise dissections will have detrimental effects on the quality of the plexus preparations and thus the overall success of the experiments. Therefore, clean/undamaged tools, practice and manual dexterity are critical to this procedure.
In whole-mount tissue preparations, careful consideration should be taken when drawing the regions of interest (ROI) to correctly assess the kinetics and degree of observed change in fluorescence intensity of the desired cell type. As the ganglia are located on a contractile muscle layer, motion artifacts caused by gut motility are a primary concern during in situ imaging. Thus, suppressing these motion disturbances through re-pinning tissue preparations after incubation with enzymes and the addition of pharmacological inhibition (nicardipine/scopolamine) to buffers permits clear and reliable image acquisition. Aside from pharmacology and mechanical approaches to prevent tissue movement, recent studies illustrate the application of advanced software methodologies and cell type response characteristics to correct for residual tissue movement in the recordings and improve the accuracy of analysis 29. Barring these technical hurdles, this method provides physiologically relevant conditions to assess morphologic and quantitative characteristics of neurons and enteric glia in the ENS.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by grants from the Pharmaceutical Research and Manufacturers Association of America (PhRMA) Foundation (to B. Gulbransen), National Institutes of Health (Building Interdisciplinary Research Careers in Women’s Health) grant K12 HD065879 (B. Gulbransen) and start-up funds from Michigan State University (B. Gulbransen).
Name | Company | Catalog Number |
BubbleStop Syringe Heater | AutoMate Scientific | 10-4-35-G |
CaCl2 | Sigma | C3306 |
Collagenase, Type II, powder | Gibco | 17101-015 |
Dispase | Sigma-Aldrich | 42613-33-2 |
Dissection tools | Roboz | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 |
Fixed-stage microscope | Olympus | BX51WI |
Fluo-4 AM dye | Invitrogen | F-14201 |
Glucose | Sigma | G8270 |
Insect pins | Fine Science Tools | Minutien Pins |
iQ Live Cell Imaging Software | Andor | Andor iQ3 |
KCl | Sigma | P3911 |
MgCl2 | Sigma | M9272 |
NaCl | Sigma | S9888 |
NaH2PO4 | Sigma | S8282 |
NaHCO3 | Sigma | S6014 |
Neo sCMOS camera | Andor | Neo 5.5 sCMOS |
Nicardipine | Sigma | N7510 |
Perfusion chamber | Custom | |
Peristaltic pump | Harvard Apparatus | Model 720 |
Pluronic F-127 | Invitrogen | P3000MP |
Probenecid | Molecular Probes | P36400 |
Scopolamine | Sigma | S1013 |
Sutter Lambda DG-4 | Sutter | DG-4 |
Sylgard | Dow Corning | 184 |
Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344C |