De l'imagerie in situ ^de Ca du système nerveux entérique

Le système nerveux entérique (SNE) est organisé en deux plexus ganglionated intégrées dans la paroi du tube digestif ^1. Ces circuits de neurones par voie intramusculaire, le plexus myentérique (MP) et la sous-muqueuse plexus (SMP), sont composés de neurones et de cellules gliales entérique (figure 1) ^2. Le député et SMP réglementent gastro-intestinaux (GI) des fonctions telles que la motilité intestinale et l'absorption épithéliale et la sécrétion, respectivement ^3. Glie entérique sont situés à proximité de neurones dans les ganglions mais les populations de cellules gliales entériques existe également dans l'interconnexion des faisceaux de fibres et des portions extra-ganglionnaires de la paroi intestinale ^3,4. Glie entériques on croyait à l'origine pour fournir qu'une aide nutritive pour les neurones. Cependant, des études récentes suggèrent fortement que les interactions neurone-glie sont essentiels pour les fonctions ENS ^5,6. Par exemple, les données montrent que les cellules gliales entériques "écouter" à l'activité neuronale ⁷et de moduler les circuits neuronaux ^6,8, protéger les neurones entériques du stress oxydatif et ⁹ sont capables de générer de nouveaux neurones entériques en réponse à des blessures ^10,11. Le protocole présenté dans cette revue technique fournit une méthode simple et robuste pour examiner l'interaction complexe entre les neurones et les cellules gliales entériques utilisant in situ intracellulaire de Ca ²⁺ imagerie.

Ca ²⁺ est une molécule de signalisation omniprésente dans les cellules excitables et joue un rôle essentiel dans les événements de signalisation synaptiques dans le système nerveux ^12. L'excitation des neurones ou des cellules gliales entériques provoque une élévation de la concentration en Ca2 ⁺ cytoplasmique soit par influx par ^{Ca2 +} Les canaux -permeable ou Ca ²⁺ libération de réserves de calcium intracellulaire. Imagerie Ca ^{2 +} transitoires dans les neurones et les cellules gliales avec des colorants fluorescents est établi et technique largement utilisée pour étudier l'organisation et la dynamique des fonctionnellel'ENS ^13-17. Ca ^de l'imagerie a été montré pour être un outil important dans l'étude de segments de tissu IG intactes pour élucider la propagation de l'excitabilité à travers les réseaux de stimulateur de la CPI et ¹⁸ intestin muscle lisse ^19,20. Il permet aux chercheurs de sonder un large éventail de paramètres physiologiques et fournit des informations à la fois sur leur répartition spatiale et dynamique temporelle. Les cellules peuvent être efficacement colorées de manière mini-invasive en utilisant des indicateurs fluorescents membrane perméable et protocoles de coloration optimisés ^21. Ceci offre la possibilité de contrôler un grand nombre de neurones et les cellules gliales dans des préparations entériques fonctionnellement conservés ^14-16,22, ainsi que in vivo ^23. -Monter entiers préparations de tissus sont en vrac chargés avec une haute affinité Ca ²⁺ colorant indicateur comme Fluo-4 qui augmente sa fluorescence lorsqu'il est lié à Ca ^2+. Les variations de fluorescence sont enregistrées par une caméra CCD et analysées numériquement ^6. L'avènement de Ca2 ⁺ a été l'occasion de surveiller neurones et cellules gliales interactions, la réactivité aux différents stimuli, et la participation de ces types de cellules dans les processus gastro-intestinaux en temps réel.

In situ ^de l'imagerie Ca a donné une grande perspicacité dans les mécanismes de signalisation des neurones entériques et de la glie et possède plusieurs avantages distincts par rapport aux modèles de culture cellulaire ^6,24. Tout d'abord, in situ préparations maintenir l'environnement de la matrice native de neurones et cellules gliales et laissent l'essentiel de leurs connexions à cibler tissu intact. Deuxièmement, la génétique et la morphologie des cellules gliales entériques cultivées sont sensiblement modifiées par rapport à ^6,24 in vivo. Troisièmement, de nombreuses interactions hétérotypiques sont perdus dans la culture de cellules primaires, ce qui limite l'évaluation des interactions entre les cellules. Bien que les cellules cultivées sont bien adaptés pour l'étude des propriétés fondamentales, leur usefulness pour étudier les interactions complexes entre les cellules gliales et neurones entériques est limité. Enquête interaction neurone-glie en utilisant une approche in situ est plus physiologiquement pertinente que les voies synaptiques demeurent intacts ^25. Par rapport aux approches de culture cellulaire, une approche in situ offre de meilleures conditions pour comprendre systématiquement les interactions complexes entre les neurones et les cellules gliales entériques. En outre, l'organisation planaire du plexus ganglionated dans des préparations entières montage est idéal pour l'imagerie de fluorescence de ^{Ca2 +} intracellulaire transitoires et cette technique offre une approche simple pour évaluer l'activité des neurones-glie dans l'ENS.

REMARQUE: Les procédures suivantes impliquant les tissus des animaux de laboratoire sont conformes aux directives de l'AVMA sur l'euthanasie des animaux de 2013 et ont été approuvés à l'avance par l'Université Michigan State IACUC.

1. Préparation des tissus

1. Anesthésier des animaux de recherche dans une chambre contenant 2,5% d'isoflurane dans de l'oxygène ou en plaçant 3-5 ml d'isoflurane liquide sur un matériau absorbant sur le sol de la chambre, assurant une barrière physique qui empêche les animaux de tout contact direct avec l'isoflurane. Test de la profondeur de l'anesthésie en pinçant le coussinet plantaire.
   NOTE: La profondeur de l'anesthésie est jugée appropriée lorsqu'il n'y a pas réflexe de retrait de la patte postérieure. Une fois anesthésié appropriée, euthanasier la souris par dislocation cervicale
2. Placez l'animal dans une position couchée et nettoyer la peau abdominale avec 70% d'éthanol. Utilisez une pince pour pincer la peau abdominale ligne médiane et à utiliser des ciseaux chirurgicaux de faire un support de 6 cml incision le long de la ligne blanche pour exposer organes digestifs internes.
3. Utilisez une pince contondants pour localiser et d'exposer l'iléon à l'intérieur du péritoine. Couper le mésentère iléal / colon avec des ciseaux et commencer à démêler l'intestin.
4. Une fois que la longueur de l'intestin est suffisamment démêlé, intercepte intestin distal de l'estomac et le caecum proximal pour une préparation d'iléon. Pour une grande préparation de l'intestin grêle, le côlon distal couper le caecum et proximale au rectum.
5. Retirer rapidement le segment intestinal et le placer dans un bécher avec les médias DMEM / F12 complété avec le chlorhydrate de nicardipine 3 pm et 1 uM chlorhydrate de scopolamine (ci-après dénommé «médias») sur la glace. L'ajout de ces inhibiteurs facilite microdissection avec ensuite une imagerie en paralysant l'intestin muscle lisse.
6. segment Cut d'intérêt (par exemple, le jéjunum, de l'iléon, le côlon distal ou proximal) fondée sur des marqueurs anatomiques établies. Typiquement utilize tissu de l'iléon distal ou le côlon distal. Cependant, utiliser la même procédure de base pour isoler, la charge et l'image neurones et de la glie myentériques dans toutes les régions intestinales.
7. Retirer un petit segment (4-6 cm) du segment de l'intestin désiré et le placer dans une boîte de Pétri Sylgard revêtu rempli avec les médias réfrigérés.
8. Fixez les extrémités proximales et distales du segment intestinal avec des épingles insectes et ouvrir le tube intestinal en faisant une ligne droite, la longueur couper le long de la frontière mésentérique.
9. Tissu à plat sous une légère tension avec le côté de la muqueuse et soigneusement disséquer couche muqueuse en utilisant une pince fine (# 5 et # 5/45 travail mieux) et très fines ciseaux à ressort Pin.
   REMARQUE: La suppression de la muqueuse peut être très traumatisant pour l'ENS se est pas effectué correctement. Pour les préparations de qualité, prendre soin de limiter le retrait brusque de la muqueuse par déroulage ou grattage. La meilleure pratique consiste à soulever la muqueuse et couper en dessous avec des ciseaux fins.
10. Coupez le tissu en petits préparations (environ 0,5 cm ²⁾ et broches dans des plats d'imagerie (4 coins avec couche de muscle circulaire vers le haut) placé sur la glace avec des milieux frais.
11. Disséquer soigneusement loin muscle circulaire par les taquineries dehors avec des pincettes fines pour exposer le plexus myentérique. Évitez un étirement excessif.
12. Placez plat imagerie retour sur la solution de la glace et le changement du milieu frais.
13. Préparez 2 ml de mélange d'enzymes par plat [Dispase 1 U / ml (4,48 mg / 8 ml), la collagénase de type II 150 U / ml (5,45 mg / 8 ml) dans les médias].
14. Retirer les plats du glace et ajouter le mélange d'enzymes de l'étape 1.13.
15. Incuber à température ambiante pendant plats 15 min avec 5% _de CO2 / 95% d'air.
16. Préparations de tissus laver les médias 3 fois et coins re-Pin.

2. Chargement Fluo-4 Dye

REMARQUE: Eviter photoblanchiment en travaillant avec la lumière limitée lors de la manipulation des colorants fluorescents et des tissus chargés de colorants indicateurs.

1. Préparer 4 uM Fluo-4 solution de chargement.
   1. Ajouter 1,5 ml de milieu et 1,2 pi d'une probénécide stocks 250 mM à une aliquote de 1,5 pl de 4 mM Fluo-4 stock. 4 mM de fluo-4 mère est préparée en ajoutant 11,4 pi de Pluronic F-127 (20% dans le DMSO; supplémenté avec 0,25% Cremaphor EL) à 50 pg de Fluo-4 AM.
2. Incuber préparations Fluo-4 dans la solution de charge pendant 45 min dans un incubateur obscurité à 37 ° C.
3. Retirer de l'incubateur et laver préparations médias 3 fois.
4. médias d'échange pour les médias contenant 200 uM probénécide et incuber 15 min à 37 ° C avant l'imagerie.
   NOTE: Le probénécide est un médicament qui inhibe les transporteurs de résistance multidrogue dans les neurones. L'addition de ce médicament inhibe la capacité des neurones à extruder colorants et améliore étiquetage neuronale. Chargement en masse de Ca ²⁺ colorants indicateurs, en l'absence de probénécide produit principalement gliale chargement de la cellule. L'addition de probénécide permet la visualisation de réponses neuronales et gliales.
5. Préparer modification Kretampon de bs.
   1. Faire un tampon Krebs modifié de telle sorte que les concentrations finales (en mm) des composants sont comme suit: 121 NaCl, 5,9 KCl, 2,5 _CaCl2, 1,2 _MgCl2, 1,2 NaH ₂ PO _4, 10 HEPES, 21,2 NaHCO _3, une pyruvique 8 glucose et acide (pH ajusté à 7,4 avec NaOH). Ajouter 3 uM nicardipine et 1 uM scopolamine à inhiber les contractions musculaires durant Ca ²⁺ imagerie et toute-monter dissections.

3. imagerie et d'analyse

REMARQUE: Utilisez au moins une plate-forme d'imagerie de base avec une source de lumière fluorescente, microscope, une caméra CCD de qualité et un logiciel d'acquisition appropriée. Varier l'addition d'autres composants en fonction de la source de lumière et de l'application spécifique. Une roue de filtre et l'obturateur doit être utilisé avec une source de lumière classique à arc au xénon. Cependant, les sources de lumière à LED et des systèmes d'éclairage ne nécessitent pas ces composants.

1. Placez le recchambre au microscope ording et en utilisant un système de perfusion à écoulement par gravité avec plusieurs réservoirs de seringue chauffée à établir un taux de perfusion en continu de 3.2 ml / min de 37 ° C tampon Krebs. Assurez-vous que pour éviter la formation de bulles d'air à la fois dans la ligne d'entrée et d'aspiration reliée à un piège à vide.
2. Apportez le plexus souhaités dans le foyer sous un éclairage sur fond clair. Évitez les tissus, ce qui peut conduire à la photo blanchiment surexposition.
3. Examinez le Fluo-4 loading sein ganglions et sélectionnez ganglions sains pour l'imagerie. Ganglions malsains / endommagées présenteront autofluorescence ou ponctuée morphologie et ne doivent pas être utilisés pour l'imagerie.
4. Une fois ganglion est sélectionné, détourner trajet de la lumière à la caméra et obtenir des images en direct avec le logiciel d'acquisition d'image. Assurez-vous que ganglion est en discussion et régler taux d'acquisition d'image et temps d'exposition.
   Note: l'image tarifs et les délais d'acquisition varient selon les événements enquêteurs souhaitent enregistrer. Pour la plupart des expériences, des imagessont traditionnellement acquis à 0,5-1 Hz pour les cellules gliales et jusqu'à 2-10 Hz pour les neurones, car les réponses ^des cellules gliales Ca ne sont pas aussi rapides que Ca ^{2 +} transitoires dans les neurones.
5. Commencez expérience et d'établir l'activité de base pendant 30 secondes.
6. Appliquer médicaments préchauffées d'intérêt tels que les agonistes et antagonistes des récepteurs utilisant le système de perfusion d'écoulement par gravité à une vitesse de 2-3 ml / min. Suivre application de agonistes / antagonistes en revenant à une perfusion du tampon normal et permettre une période d'au moins 10 min de lavage / récupération.
   NOTE: Les heures d'application du médicament peut varier en fonction du composé particulier et de la conception expérimentale. En général, une application de 20 à 30 sec agoniste est suffisante pour activer G récepteurs couplés aux protéines dans les neurones et les cellules gliales. Cependant, les canaux ioniques ligand-dépendants (tels que les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine) nécessitent des temps d'application ne dépassant pas 5 à 10 sec. D'autres expositions de durée causeront ligand canaux ioniques à ceux-ci rapidementnsitize. Antagonistes devraient être appliquées pendant environ 3-15 min pour assurer le blocage complet de voies des récepteurs. Cependant, ce est une généralisation grossière et les enquêteurs devraient toujours optimiser tout médicament expérimental dans leur paradigme particulier.
7. Arrêter l'enregistrement et vue film accéléré de l'expérience. Sélectionnez soigneusement les régions d'intérêt (de ROI) en utilisant le logiciel d'analyse d'image appropriée.
8. Utilisez un logiciel de normaliser et de comparer ROI intensité fluorescente contre sa valeur initiale de base fluorescente. Les variations de fluorescence normalisée sont directement proportionnelles aux variations de [Ca2 ^+].
   1. Utiliser une modification d'un procédé décrit précédemment en utilisant ²⁶ AF / F = ((F ₁ - F ₀₎ / F ₀₎ ROI - ((F ₁ - F ₀₎ / F ₀₎ de fond, où F1 est la fluorescence à ne importe quel donné Point et F0 est la fluorescence de base, pour améliorer la précision de l'évaluation. Cette modification aidesen réduisant le bruit de la variation de fluorescence dans des préparations de tissus qui présentent mouvement de la couche musculaire sous-jacent le plexus myentérique.

Bonne utilisation de cette technique permet aux enquêteurs de mesurer avec précision intracellulaire de Ca 2+ [Ca2 +] i transitoires dans les neurones entériques et de la glie dans l'ensemble du montage des préparations de tissus. Un exemple représentatif d'un agoniste-évoqué Ca 2+ réponses dans les cellules gliales dans un ganglion mésentérique du côlon de la souris est montré dans la vidéo 1. Les résultats suivants sont destinés à illustrer certains résultats représentatifs que nous avons obtenus en utilisant cette méthode. Tout d'abord, la figure 2 illustre les résultats d'une expérience de mesure gliale entérique [Ca2 +] i change en réponse à une stimulation par l'ATP à l'intérieur du côlon Guinée porcs longitudinal plexus myentérique musculaire (LMMP préparations). Plus précisément, cette figure montre la méthode pour analyser correctement le protocole expérimental ci-dessus y compris le contour du ganglion et les astérisques indiquant l'emplacement des neurones entériques myentérique analysé. Ces résultats ont également illustrate la dose optimale de cent micromolaire ATP sur la mobilisation de [Ca 2+] i dans les cellules gliales myentérique cochon Guinée. Cette réponse peut être utilisé pour étalonner la stimulation des cellules gliales entériques et normaliser les réponses aux stimuli tester. Ensuite, la Figure 3 met en lumière comment sélectionner correctement régions d'intérêt (ROI) entourant les cellules gliales, montré avec entourant cercles jaunes. Ces résultats montrent également les changements de fluorescence souhaités dans des conditions basales et en réponse à des stimuli pharmacologiques. Enfin, la figure 4 montre les considérations spatiales pour choisir les cellules gliales et neurones entériques pour [Ca2 +] i réponses dans des préparations entières-monter.

Figure 1. Organisation de l'ENS. L'ENS contient deux grands plexus ganglionated. Le plexus myentérique est situé entre le longitudinal couches musculaires et circulaires. Le plexus sous-muqueux est situé entre la muqueuse et la couche musculaire circulaire. L'ENS est exclusivement composée de neurones et cellules gliales entériques. faisceaux de fibres nerveuses relient les ganglions. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. entérique cellules gliales dans le cochon Guinée colique plexus myentérique répondre à l'ATP in situ. (A) Fluo-4 fluorescence dans un ganglion mésentérique (délimitée par la ligne pointillée) dans des conditions basales. Les flèches indiquent épais faisceaux de fibres interganglionic. (B) Lors de la stimulation avec 100 pmol / L ATP, les cellules gliales, mais pas les neurones, augmentent rapidement Fluo-4 fluorescence indiquant une augmentation de [Ca 2+] (C) des cellules gliales entériques répondre à l'ATP d'une manière dose-dépendante avec 1 mmol / L déclencher des réponses maximales 24. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.

Figure 3. murin S-100 cellules GFP + dans le plexus myentérique du côlon répondent à l'ATP in situ. (A) S-100-GFP + cellules gliales (vert) dans un ganglion mésentérique du côlon de la souris (décrites par la ligne pointillée). Six régions d'intérêt (ROI) entourant les cellules gliales dans les ganglions sont présentés sous forme de cercles jaunes. Les flèches indiquent des faisceaux de fibres épaisses menant dans le ganglion. Astérisques dLieu de enote de deux neurones entériques. (B) Même ganglion montrant Rhod-2 fluorescence dans des conditions basales. (C) Suite à la stimulation avec 100 pmol / L ATP, les cellules gliales répondent à une augmentation [Ca 2+] i comme indiqué par l'augmentation Rhod- 2 fluorescence. (D) traces correspondant à chaque ROI montré dans l'A-C. (E) en moyenne réponse (moyenne ± SEM) des six ROI indiquées dans D 24. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. En imagerie in situ de la communication entérique neurone-glie à. (A) Des images représentatives (de pseudocolored) d'une expérience d'imagerie Ca 2+ où l'ensemble du montagepréparation du plexus myentérique a été contestée avec le neuronale agoniste du récepteur P2X7 BzATP (100 uM, 30 sec). Notez que l'agoniste neuronale entraîne une augmentation de Fluo4 fluorescence dans le neurone (A ') avant les cellules environnantes entériques gliales (A "). (B) Analyse de la variation de fluorescence au cours du temps dans les cellules gliales (bleu) et les neurones (rouge ) après l'application de l'agoniste neuronal, BzATP. (C) et les réponses neuronales gliales dans le tampon de BzATP normale (traits pleins) et dans un tampon contenant faible Ca 2+ et Mg 2+ (lignes en pointillés) de potentialiser récepteurs P2X7 13 neuronales. Se il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Vidéo 1. agoniste évoqué Ca 2+ réponse dans les cellules gliales entériques danssitu. Cette vidéo montre un ganglion mésentérique du côlon distal de la souris chargé avec le Ca de l'indicateur colorant, Fluo-4. L'agoniste des cellules gliales, ADP, est ajouté au bain lorsque cela est indiqué. ADP provoque une augmentation de la concentration intracellulaire de Ca 2+ dans les cellules gliales entériques comme observé par l'élévation transitoire de Fluo-4 fluorescence. Se il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.