Article de méthode

De l'imagerie in situ de Ca du système nerveux entérique

21.8K vues

⸱

DOI :

10.3791/52506

⸱

29 janvier 2015

 , 
1Department of Physiology, Michigan State University

Dans cet article

Résumé

Le système nerveux entérique (SNE) est un réseau de neurones et de glies situé dans la paroi intestinale qui contrôle les réflexes intestinaux. Ce protocole décrit des méthodes d’enregistrement de l’activité des neurones entériques et de la glie dans des préparations vivantes de SNE à l’aide de l’imagerie Ca2+.

Résumé

Les comportements réflexes de l’intestin sont contrôlés par le système nerveux entérique (SNE). Le SNE est un réseau intégratif de neurones et de cellules gliales dans deux plexus ganglionnaires logés dans la paroi intestinale. Les neurones entériques et la glie entérique sont les seuls types de cellules à l’intérieur des ganglions entériques. L’activité des neurones entériques et de la glie est responsable de la coordination des fonctions intestinales. Ce protocole décrit des méthodes d’observation de l’activité des neurones et de la glie dans le SNE intact en imageant les transitoires calciques intracellulaires (Ca2+) avec des colorants indicateurs fluorescents. Notre discussion technique porte sur les méthodes d’imagerie Ca2+ dans les préparations entières du plexus myentérique de l’intestin de rongeur. La charge en vrac de montures entières ENS avec un indicateur Ca2+ de haute affinité tel que Fluo-4 permet de mesurer les réponses Ca2+ dans des neurones individuels ou des cellules gliales. Ces réponses peuvent être évoquées de manière répétée et fiable, ce qui permet des études quantitatives à l’aide d’outils pharmacologiques. Les réponses Ca2+ dans les cellules de l’ENS sont enregistrées à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé d’une caméra CCD (dispositif à couplage de charge) refroidie. Les mesures de fluorescence obtenues à l’aide de l’imagerie Ca2+ dans des préparations entières offrent un moyen simple de caractériser les mécanismes et les conséquences fonctionnelles potentielles des réponses Ca2+ dans les neurones entériques et les cellules gliales.

Introduction

Le système nerveux entérique (SNE) est organisé en deux plexus ganglionated intégrées dans la paroi du tube digestif 1. Ces circuits de neurones par voie intramusculaire, le plexus myentérique (MP) et la sous-muqueuse plexus (SMP), sont composés de neurones et de cellules gliales entérique (figure 1) 2. Le député et SMP réglementent gastro-intestinaux (GI) des fonctions telles que la motilité intestinale et l'absorption épithéliale et la sécrétion, respectivement 3. Glie entérique sont situés à proximité de neurones dans les ganglions mais les populations de cellules gliales entériques existe également dans l'interconnexion des faisceaux de fibres et des portions extra-ganglionnaires de la paroi intestinale 3,4. Glie entériques on croyait à l'origine pour fournir qu'une aide nutritive pour les neurones. Cependant, des études récentes suggèrent fortement que les interactions neurone-glie sont essentiels pour les fonctions ENS 5,6. Par exemple, les données montrent que les cellules gliales entériques "écouter" à l'activité neuronale 7et de moduler les circuits neuronaux 6,8, protéger les neurones entériques du stress oxydatif et 9 sont capables de générer de nouveaux neurones entériques en réponse à des blessures 10,11. Le protocole présenté dans cette revue technique fournit une méthode simple et robuste pour examiner l'interaction complexe entre les neurones et les cellules gliales entériques utilisant in situ intracellulaire de Ca 2+ imagerie.

Ca 2+ est une molécule de signalisation omniprésente dans les cellules excitables et joue un rôle essentiel dans les événements de signalisation synaptiques dans le système nerveux 12. L'excitation des neurones ou des cellules gliales entériques provoque une élévation de la concentration en Ca2 + cytoplasmique soit par influx par Ca2 + Les canaux -permeable ou Ca 2+ libération de réserves de calcium intracellulaire. Imagerie Ca 2 + transitoires dans les neurones et les cellules gliales avec des colorants fluorescents est établi et technique largement utilisée pour étudier l'organisation et la dynamique des fonctionnellel'ENS 13-17. Ca de l'imagerie a été montré pour être un outil important dans l'étude de segments de tissu IG intactes pour élucider la propagation de l'excitabilité à travers les réseaux de stimulateur de la CPI et 18 intestin muscle lisse 19,20. Il permet aux chercheurs de sonder un large éventail de paramètres physiologiques et fournit des informations à la fois sur leur répartition spatiale et dynamique temporelle. Les cellules peuvent être efficacement colorées de manière mini-invasive en utilisant des indicateurs fluorescents membrane perméable et protocoles de coloration optimisés 21. Ceci offre la possibilité de contrôler un grand nombre de neurones et les cellules gliales dans des préparations entériques fonctionnellement conservés 14-16,22, ainsi que in vivo 23. -Monter entiers préparations de tissus sont en vrac chargés avec une haute affinité Ca 2+ colorant indicateur comme Fluo-4 qui augmente sa fluorescence lorsqu'il est lié à Ca 2+. Les variations de fluorescence sont enregistrées par une caméra CCD et analysées numériquement 6. L'avènement de Ca2 + a été l'occasion de surveiller neurones et cellules gliales interactions, la réactivité aux différents stimuli, et la participation de ces types de cellules dans les processus gastro-intestinaux en temps réel.

In situ de l'imagerie Ca a donné une grande perspicacité dans les mécanismes de signalisation des neurones entériques et de la glie et possède plusieurs avantages distincts par rapport aux modèles de culture cellulaire 6,24. Tout d'abord, in situ préparations maintenir l'environnement de la matrice native de neurones et cellules gliales et laissent l'essentiel de leurs connexions à cibler tissu intact. Deuxièmement, la génétique et la morphologie des cellules gliales entériques cultivées sont sensiblement modifiées par rapport à 6,24 in vivo. Troisièmement, de nombreuses interactions hétérotypiques sont perdus dans la culture de cellules primaires, ce qui limite l'évaluation des interactions entre les cellules. Bien que les cellules cultivées sont bien adaptés pour l'étude des propriétés fondamentales, leur usefulness pour étudier les interactions complexes entre les cellules gliales et neurones entériques est limité. Enquête interaction neurone-glie en utilisant une approche in situ est plus physiologiquement pertinente que les voies synaptiques demeurent intacts 25. Par rapport aux approches de culture cellulaire, une approche in situ offre de meilleures conditions pour comprendre systématiquement les interactions complexes entre les neurones et les cellules gliales entériques. En outre, l'organisation planaire du plexus ganglionated dans des préparations entières montage est idéal pour l'imagerie de fluorescence de Ca2 + intracellulaire transitoires et cette technique offre une approche simple pour évaluer l'activité des neurones-glie dans l'ENS.

Protocole

REMARQUE: Les procédures suivantes impliquant les tissus des animaux de laboratoire sont conformes aux directives de l'AVMA sur l'euthanasie des animaux de 2013 et ont été approuvés à l'avance par l'Université Michigan State IACUC.

1. Préparation des tissus

  1. Anesthésier des animaux de recherche dans une chambre contenant 2,5% d'isoflurane dans de l'oxygène ou en plaçant 3-5 ml d'isoflurane liquide sur un matériau absorbant sur le sol de la chambre, assurant une barrière physique qui empêche les animaux de tout contact direct avec l'isoflurane. Test de la profondeur de l'anesthésie en pinçant le coussinet plantaire.
    NOTE: La profondeur de l'anesthésie est jugée appropriée lorsqu'il n'y a pas réflexe de retrait de la patte postérieure. Une fois anesthésié appropriée, euthanasier la souris par dislocation cervicale
  2. Placez l'animal dans une position couchée et nettoyer la peau abdominale avec 70% d'éthanol. Utilisez une pince pour pincer la peau abdominale ligne médiane et à utiliser des ciseaux chirurgicaux de faire un support de 6 cml incision le long de la ligne blanche pour exposer organes digestifs internes.
  3. Utilisez une pince contondants pour localiser et d'exposer l'iléon à l'intérieur du péritoine. Couper le mésentère iléal / colon avec des ciseaux et commencer à démêler l'intestin.
  4. Une fois que la longueur de l'intestin est suffisamment démêlé, intercepte intestin distal de l'estomac et le caecum proximal pour une préparation d'iléon. Pour une grande préparation de l'intestin grêle, le côlon distal couper le caecum et proximale au rectum.
  5. Retirer rapidement le segment intestinal et le placer dans un bécher avec les médias DMEM / F12 complété avec le chlorhydrate de nicardipine 3 pm et 1 uM chlorhydrate de scopolamine (ci-après dénommé «médias») sur la glace. L'ajout de ces inhibiteurs facilite microdissection avec ensuite une imagerie en paralysant l'intestin muscle lisse.
  6. segment Cut d'intérêt (par exemple, le jéjunum, de l'iléon, le côlon distal ou proximal) fondée sur des marqueurs anatomiques établies. Typiquement utilize tissu de l'iléon distal ou le côlon distal. Cependant, utiliser la même procédure de base pour isoler, la charge et l'image neurones et de la glie myentériques dans toutes les régions intestinales.
  7. Retirer un petit segment (4-6 cm) du segment de l'intestin désiré et le placer dans une boîte de Pétri Sylgard revêtu rempli avec les médias réfrigérés.
  8. Fixez les extrémités proximales et distales du segment intestinal avec des épingles insectes et ouvrir le tube intestinal en faisant une ligne droite, la longueur couper le long de la frontière mésentérique.
  9. Tissu à plat sous une légère tension avec le côté de la muqueuse et soigneusement disséquer couche muqueuse en utilisant une pince fine (# 5 et # 5/45 travail mieux) et très fines ciseaux à ressort Pin.
    REMARQUE: La suppression de la muqueuse peut être très traumatisant pour l'ENS se est pas effectué correctement. Pour les préparations de qualité, prendre soin de limiter le retrait brusque de la muqueuse par déroulage ou grattage. La meilleure pratique consiste à soulever la muqueuse et couper en dessous avec des ciseaux fins.
  10. Coupez le tissu en petits préparations (environ 0,5 cm 2) et broches dans des plats d'imagerie (4 coins avec couche de muscle circulaire vers le haut) placé sur la glace avec des milieux frais.
  11. Disséquer soigneusement loin muscle circulaire par les taquineries dehors avec des pincettes fines pour exposer le plexus myentérique. Évitez un étirement excessif.
  12. Placez plat imagerie retour sur la solution de la glace et le changement du milieu frais.
  13. Préparez 2 ml de mélange d'enzymes par plat [Dispase 1 U / ml (4,48 mg / 8 ml), la collagénase de type II 150 U / ml (5,45 mg / 8 ml) dans les médias].
  14. Retirer les plats du glace et ajouter le mélange d'enzymes de l'étape 1.13.
  15. Incuber à température ambiante pendant plats 15 min avec 5% de CO2 / 95% d'air.
  16. Préparations de tissus laver les médias 3 fois et coins re-Pin.

2. Chargement Fluo-4 Dye

REMARQUE: Eviter photoblanchiment en travaillant avec la lumière limitée lors de la manipulation des colorants fluorescents et des tissus chargés de colorants indicateurs.

  1. Préparer 4 uM Fluo-4 solution de chargement.
    1. Ajouter 1,5 ml de milieu et 1,2 pi d'une probénécide stocks 250 mM à une aliquote de 1,5 pl de 4 mM Fluo-4 stock. 4 mM de fluo-4 mère est préparée en ajoutant 11,4 pi de Pluronic F-127 (20% dans le DMSO; supplémenté avec 0,25% Cremaphor EL) à 50 pg de Fluo-4 AM.
  2. Incuber préparations Fluo-4 dans la solution de charge pendant 45 min dans un incubateur obscurité à 37 ° C.
  3. Retirer de l'incubateur et laver préparations médias 3 fois.
  4. médias d'échange pour les médias contenant 200 uM probénécide et incuber 15 min à 37 ° C avant l'imagerie.
    NOTE: Le probénécide est un médicament qui inhibe les transporteurs de résistance multidrogue dans les neurones. L'addition de ce médicament inhibe la capacité des neurones à extruder colorants et améliore étiquetage neuronale. Chargement en masse de Ca 2+ colorants indicateurs, en l'absence de probénécide produit principalement gliale chargement de la cellule. L'addition de probénécide permet la visualisation de réponses neuronales et gliales.
  5. Préparer modification Kretampon de bs.
    1. Faire un tampon Krebs modifié de telle sorte que les concentrations finales (en mm) des composants sont comme suit: 121 NaCl, 5,9 KCl, 2,5 CaCl2, 1,2 MgCl2, 1,2 NaH 2 PO 4, 10 HEPES, 21,2 NaHCO 3, une pyruvique 8 glucose et acide (pH ajusté à 7,4 avec NaOH). Ajouter 3 uM nicardipine et 1 uM scopolamine à inhiber les contractions musculaires durant Ca 2+ imagerie et toute-monter dissections.

3. imagerie et d'analyse

REMARQUE: Utilisez au moins une plate-forme d'imagerie de base avec une source de lumière fluorescente, microscope, une caméra CCD de qualité et un logiciel d'acquisition appropriée. Varier l'addition d'autres composants en fonction de la source de lumière et de l'application spécifique. Une roue de filtre et l'obturateur doit être utilisé avec une source de lumière classique à arc au xénon. Cependant, les sources de lumière à LED et des systèmes d'éclairage ne nécessitent pas ces composants.

  1. Placez le recchambre au microscope ording et en utilisant un système de perfusion à écoulement par gravité avec plusieurs réservoirs de seringue chauffée à établir un taux de perfusion en continu de 3.2 ml / min de 37 ° C tampon Krebs. Assurez-vous que pour éviter la formation de bulles d'air à la fois dans la ligne d'entrée et d'aspiration reliée à un piège à vide.
  2. Apportez le plexus souhaités dans le foyer sous un éclairage sur fond clair. Évitez les tissus, ce qui peut conduire à la photo blanchiment surexposition.
  3. Examinez le Fluo-4 loading sein ganglions et sélectionnez ganglions sains pour l'imagerie. Ganglions malsains / endommagées présenteront autofluorescence ou ponctuée morphologie et ne doivent pas être utilisés pour l'imagerie.
  4. Une fois ganglion est sélectionné, détourner trajet de la lumière à la caméra et obtenir des images en direct avec le logiciel d'acquisition d'image. Assurez-vous que ganglion est en discussion et régler taux d'acquisition d'image et temps d'exposition.
    Note: l'image tarifs et les délais d'acquisition varient selon les événements enquêteurs souhaitent enregistrer. Pour la plupart des expériences, des imagessont traditionnellement acquis à 0,5-1 Hz pour les cellules gliales et jusqu'à 2-10 Hz pour les neurones, car les réponses des cellules gliales Ca ne sont pas aussi rapides que Ca 2 + transitoires dans les neurones.
  5. Commencez expérience et d'établir l'activité de base pendant 30 secondes.
  6. Appliquer médicaments préchauffées d'intérêt tels que les agonistes et antagonistes des récepteurs utilisant le système de perfusion d'écoulement par gravité à une vitesse de 2-3 ml / min. Suivre application de agonistes / antagonistes en revenant à une perfusion du tampon normal et permettre une période d'au moins 10 min de lavage / récupération.
    NOTE: Les heures d'application du médicament peut varier en fonction du composé particulier et de la conception expérimentale. En général, une application de 20 à 30 sec agoniste est suffisante pour activer G récepteurs couplés aux protéines dans les neurones et les cellules gliales. Cependant, les canaux ioniques ligand-dépendants (tels que les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine) nécessitent des temps d'application ne dépassant pas 5 à 10 sec. D'autres expositions de durée causeront ligand canaux ioniques à ceux-ci rapidementnsitize. Antagonistes devraient être appliquées pendant environ 3-15 min pour assurer le blocage complet de voies des récepteurs. Cependant, ce est une généralisation grossière et les enquêteurs devraient toujours optimiser tout médicament expérimental dans leur paradigme particulier.
  7. Arrêter l'enregistrement et vue film accéléré de l'expérience. Sélectionnez soigneusement les régions d'intérêt (de ROI) en utilisant le logiciel d'analyse d'image appropriée.
  8. Utilisez un logiciel de normaliser et de comparer ROI intensité fluorescente contre sa valeur initiale de base fluorescente. Les variations de fluorescence normalisée sont directement proportionnelles aux variations de [Ca2 +].
    1. Utiliser une modification d'un procédé décrit précédemment en utilisant 26 AF / F = ((F 1 - F 0) / F 0) ROI - ((F 1 - F 0) / F 0) de fond, où F1 est la fluorescence à ne importe quel donné Point et F0 est la fluorescence de base, pour améliorer la précision de l'évaluation. Cette modification aidesen réduisant le bruit de la variation de fluorescence dans des préparations de tissus qui présentent mouvement de la couche musculaire sous-jacent le plexus myentérique.

Résultats

Bonne utilisation de cette technique permet aux enquêteurs de mesurer avec précision intracellulaire de Ca 2+ [Ca2 +] i transitoires dans les neurones entériques et de la glie dans l'ensemble du montage des préparations de tissus. Un exemple représentatif d'un agoniste-évoqué Ca 2+ réponses dans les cellules gliales dans un ganglion mésentérique du côlon de la souris est montré dans la vidéo 1. Les résultats suivants sont destinés à illustrer certains résultats représentatifs que nous avons obtenus en utilisant cette méthode. Tout d'abord, la figure 2 illustre les résultats d'une expérience de mesure gliale entérique [Ca2 +] i change en réponse à une stimulation par l'ATP à l'intérieur du côlon Guinée porcs longitudinal plexus myentérique musculaire (LMMP préparations). Plus précisément, cette figure montre la méthode pour analyser correctement le protocole expérimental ci-dessus y compris le contour du ganglion et les astérisques indiquant l'emplacement des neurones entériques myentérique analysé. Ces résultats ont également illustrate la dose optimale de cent micromolaire ATP sur la mobilisation de [Ca 2+] i dans les cellules gliales myentérique cochon Guinée. Cette réponse peut être utilisé pour étalonner la stimulation des cellules gliales entériques et normaliser les réponses aux stimuli tester. Ensuite, la Figure 3 met en lumière comment sélectionner correctement régions d'intérêt (ROI) entourant les cellules gliales, montré avec entourant cercles jaunes. Ces résultats montrent également les changements de fluorescence souhaités dans des conditions basales et en réponse à des stimuli pharmacologiques. Enfin, la figure 4 montre les considérations spatiales pour choisir les cellules gliales et neurones entériques pour [Ca2 +] i réponses dans des préparations entières-monter.

figure-results-1
Figure 1. Organisation de l'ENS. L'ENS contient deux grands plexus ganglionated. Le plexus myentérique est situé entre le longitudinal couches musculaires et circulaires. Le plexus sous-muqueux est situé entre la muqueuse et la couche musculaire circulaire. L'ENS est exclusivement composée de neurones et cellules gliales entériques. faisceaux de fibres nerveuses relient les ganglions. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-results-2
Figure 2. entérique cellules gliales dans le cochon Guinée colique plexus myentérique répondre à l'ATP in situ. (A) Fluo-4 fluorescence dans un ganglion mésentérique (délimitée par la ligne pointillée) dans des conditions basales. Les flèches indiquent épais faisceaux de fibres interganglionic. (B) Lors de la stimulation avec 100 pmol / L ATP, les cellules gliales, mais pas les neurones, augmentent rapidement Fluo-4 fluorescence indiquant une augmentation de [Ca 2+] i. Notez que les cellules répondant sont petites et entourent les neurones beaucoup plus grandes (espaces sombres marquées par des astérisques). (C) des cellules gliales entériques répondre à l'ATP d'une manière dose-dépendante avec 1 mmol / L déclencher des réponses maximales 24. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.

figure-results-3
Figure 3. murin S-100 cellules GFP + dans le plexus myentérique du côlon répondent à l'ATP in situ. (A) S-100-GFP + cellules gliales (vert) dans un ganglion mésentérique du côlon de la souris (décrites par la ligne pointillée). Six régions d'intérêt (ROI) entourant les cellules gliales dans les ganglions sont présentés sous forme de cercles jaunes. Les flèches indiquent des faisceaux de fibres épaisses menant dans le ganglion. Astérisques dLieu de enote de deux neurones entériques. (B) Même ganglion montrant Rhod-2 fluorescence dans des conditions basales. (C) Suite à la stimulation avec 100 pmol / L ATP, les cellules gliales répondent à une augmentation [Ca 2+] i comme indiqué par l'augmentation Rhod- 2 fluorescence. (D) traces correspondant à chaque ROI montré dans l'A-C. (E) en moyenne réponse (moyenne ± SEM) des six ROI indiquées dans D 24. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-results-4
Figure 4. En imagerie in situ de la communication entérique neurone-glie à. (A) Des images représentatives (de pseudocolored) d'une expérience d'imagerie Ca 2+ où l'ensemble du montagepréparation du plexus myentérique a été contestée avec le neuronale agoniste du récepteur P2X7 BzATP (100 uM, 30 sec). Notez que l'agoniste neuronale entraîne une augmentation de Fluo4 fluorescence dans le neurone (A ') avant les cellules environnantes entériques gliales (A "). (B) Analyse de la variation de fluorescence au cours du temps dans les cellules gliales (bleu) et les neurones (rouge ) après l'application de l'agoniste neuronal, BzATP. (C) et les réponses neuronales gliales dans le tampon de BzATP normale (traits pleins) et dans un tampon contenant faible Ca 2+ et Mg 2+ (lignes en pointillés) de potentialiser récepteurs P2X7 13 neuronales. Se il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Vidéo 1. agoniste évoqué Ca 2+ réponse dans les cellules gliales entériques danssitu. Cette vidéo montre un ganglion mésentérique du côlon distal de la souris chargé avec le Ca de l'indicateur colorant, Fluo-4. L'agoniste des cellules gliales, ADP, est ajouté au bain lorsque cela est indiqué. ADP provoque une augmentation de la concentration intracellulaire de Ca 2+ dans les cellules gliales entériques comme observé par l'élévation transitoire de Fluo-4 fluorescence. Se il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.

Discussion

Les méthodologies décrites dans ce manuscrit fournissent une approche cohérente pour étudier efficacement les neurones et la glie entérique dans le SNE. Bien que l’imagerie des neurones et de la glie entérique en culture ait permis de mieux comprendre la fonction des cellules individuelles, l’étude de ces cellules dans leur environnement natif et multicellulaire est cruciale pour notre compréhension de leur physiologie et de leur physiopathologie. La microscopie à fluorescence est une technique cruciale pour évaluer les interactions multidirectionnelles des cellules dans le SNE. Le chargement des cellules de l’ENS avec des marqueurs fluorescents sélectifs et l’acquisition d’images avec la microscopie à haute résolution permettent des observations quantitatives de l’activité cellulaire dans l’ENS. L’imagerie d’échantillons de tissus vivants de l’ENS est réalisée relativement rapidement et génère de grandes quantités de données fonctionnelles et spatiales approfondies. Les préparations myentériques et du plexus sous-muqueux de souris utilisées dans ces expériences permettent des approches de manipulation moléculaire et génétique. L’imagerie Ca2+ dans les préparations à montage entier fournit un outil utile pour l’évaluation des interactions neurones-glies.

Dans les paradigmes expérimentaux avancés, plusieurs sondes peuvent être combinées pour obtenir des informations sur différents événements au sein des cellules. La microscopie à fluorescence peut enregistrer des images avec un contraste amélioré de molécules spécifiques, si un marqueur fluorescent approprié est utilisé. Fluo-4 a été choisi parce qu’il possède une large plage dynamique. Un temps d’incubation suffisant est essentiel lors de l’utilisation des colorants AM dans le SNA. Il peut être nécessaire d’ajuster la concentration et la méthode de chargement du colorant pour obtenir les meilleurs résultats. Les préparations idéales doivent être chargées avec suffisamment de colorant pour visualiser les changements de fluorescence, mais pas au point que le colorant chélate les ions cibles et interfère avec la signalisation intracellulaire. L’exposition à la lumière fluorescente doit être limitée pour éviter la phototoxicité dans les cellules et le photoblanchiment des colorants.

Les chercheurs doivent être prudents avec plusieurs étapes de cette expérience, en particulier la préparation de la solution et des tissus. Une attention particulière doit être portée lors du traitement et de la dissection du tissu ENS afin de maintenir les fonctions cellulaires. Le tractus gastro-intestinal contient plusieurs couches et variétés de tissus, ce qui pose des défis pour la dissection et la qualité de l’imagerie dans ces préparations à montage entier 27. De plus, les faisceaux de fibres d’interconnexion du MP sont plus larges et les ganglions sont plus grands que ceux du SMP 2. La densité neuronale du plexus myentérique est plus élevée par rapport à celle du plexus sous-muqueux 28. Des dissections lentes et imprécises auront des effets néfastes sur la qualité des préparations du plexus et donc sur le succès global des expériences. Par conséquent, des outils propres ou non endommagés, de la pratique et une dextérité manuelle sont essentiels à cette procédure.

Dans les préparations de tissus entiers, une attention particulière doit être prise lors du dessin des régions d’intérêt (ROI) pour évaluer correctement la cinétique et le degré de changement observé de l’intensité de fluorescence du type de cellule souhaité. Comme les ganglions sont situés sur une couche musculaire contractile, les artefacts de mouvement causés par la motilité intestinale sont une préoccupation majeure lors de l’imagerie in situ . Ainsi, la suppression de ces perturbations du mouvement par le réalignement des préparations tissulaires après l’incubation avec des enzymes et l’ajout d’inhibitions pharmacologiques (nicardipine/scopolamine) aux tampons permet une acquisition d’images claire et fiable. Outre les approches pharmacologiques et mécaniques visant à prévenir le mouvement des tissus, des études récentes illustrent l’application de méthodologies logicielles avancées et de caractéristiques de réponse du type cellulaire pour corriger le mouvement résiduel des tissus dans les enregistrements et améliorer la précision de l’analyse29. À l’exception de ces obstacles techniques, cette méthode fournit des conditions physiologiquement pertinentes pour évaluer les caractéristiques morphologiques et quantitatives des neurones et de la glie entérique dans le SNE.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation de la Pharmaceutical Research and Manufacturers Association of America (PhRMA) (à B. Gulbransen), de la subvention K12 HD065879 des National Institutes of Health (Building Interdisciplinary Research Careers in Women’s Health) (B. Gulbransen) et de fonds de démarrage de l’Université d’État du Michigan (B. Gulbransen).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
BubbleStop Chauffe-seringue  ;AutoMate Scientific10-4-35-G
CaCl2SigmaC3306
Collagenase, Type II, poudreGibco17101-015
DispaseSigma-Aldrich42613-33-2
Outils de dissectionRoboz  ;
DMSOSigma-AldrichD5879
Microscope à platine fixeOlympus  ;BX51WI
Fluo-4 AM colorantInvitrogenF-14201
GlucoseSigmaG8270
Épingles à insectesOutils scientifiques finsPin’s Minutien iQ
Logiciel d’imagerie de cellules vivantesAndorAndor iQ3
KClSigmaP3911
MgCl2SigmaM9272
NaClSigmaS9888
NaH2PO4SigmaS8282
NaHCO3SigmaS6014
Neo Caméra sCMOSAndorNeo 5.5 sCMOS
NicardipineSigmaN7510
Chambrede perfusion
Harvard ApparatusModel 720
Pluronic F-127  ;Sondes moléculaires InvitrogenP3000MP
ProbenecidP36400
ScopolamineSigmaS1013  ;
Sutter Lambda DG-4SutterDG-4
Sylgard  ;Dow Corning184
Régulateur de températureWarner InstrumentsTC-344C
Pompe péristaltique personnalisée

Références

  1. Furness, J. B. Types of neurons in the enteric nervous system. Journal of the Autonomic Nervous System. 81 (1-3), 87-96 (2000).
  2. Furness, J. B. The organization of the autonomic nervous system: peripheral connections. Neuroscience. 130 (1-2), 1-5 (2006).
  3. Pham, T. D., Gershon, M. D., Rothman, T. P. Time of origin of neurons in the murine enteric nervous system: sequence in relation to phenotype. Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 789-798 (1991).
  4. Nasser, Y., et al. Role of enteric glia in intestinal physiology: effects of the gliotoxin fluorocitrate on motor and secretory function. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 291, G912-927 (2006).
  5. Glial cells in the gut. Neurogastroenterology & Motility. 17 (6), 777-790 (2005).
  6. Broadhead, M. J., Bayguinov, P. O., Okamoto, T., Heredia, D. J., Smith, T. K. Ca2+ transients in myenteric glial cells during the colonic migrating motor complex in the isolated murine large intestine. J. Physiol. 590, 335-350 (2012).
  7. Gulbransen, B. D., Bains, J. S., Sharkey, K. A. Enteric glia are targets of the sympathetic innervation of the myenteric plexus in the guinea pig distal colon. J. Neurosci. 30, 6801-6809 (2010).
  8. McClain, J. L., et al. Ca2+ Responses in Enteric Glia Are Mediated by Connexin-43 Hemichannels and Modulate Colonic Transit in Mice. Gastroenterology. 146 (2), 497-507 (2014).
  9. Chandrasekharan, B., et al. Colonic motor dysfunction in human diabetes is associated with enteric neuronal loss and increased oxidative stress. Neurogastroenterology & Motility. 23 (2), e131-e126 (2011).
  10. Abdo, H., et al. Enteric glial cells protect neurons from oxidative stress in part via reduced glutathione. FASEB J. 24, 1082-1092 (2010).
  11. Aube, A. C., et al. Changes in enteric neurone phenotype and intestinal functions in a transgenic mouse model of enteric glia disruption. Gut. 55, 630-637 (2006).
  12. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nature Reviews Molecular cell biology. 1 (1), 11-21 (2000).
  13. Gulbransen, B. D., et al. Activation of neuronal P2X7 receptor-pannexin-1 mediates death of enteric neurons during colitis. Nat Med. 18, 600-604 (2012).
  14. Bayguinov, P. O., Hennig, G. W., Smith, T. K. Calcium activity in different classes of myenteric neurons underlying the migrating motor complex in the murine colon. J Physiol. 588, 399-421 (2010).
  15. Okamoto, T., Bayguinov, P. O., Broadhead, M. J., Smith, T. K. Ca(2+) transients in submucous neurons during the colonic migrating motor complex in the isolated murine large intestine. Neurogastroenterol Motil. 24 (8), 769-778 (2012).
  16. Kunze, W. A., Clerc, N., Furness, J. B., Gola, M. The soma and neurites of primary afferent neurons in the guinea-pig intestine respond differentially to deformation. J Physiol. 526, 375-385 (2000).
  17. Schemann, M., Michel, K., Peters, S., Bischoff, S. C., Neunlist, M. Imaging and the gastrointestinal tract: mapping the human enteric nervous system. Am J Physiol. 282, G919-G925 (2002).
  18. Hennig, G. W., et al. Visualization of spread of pacemaker activity in through ICC in guinea-pig antrum. Neurogastro Motil. 14, 575(2001).
  19. Stevens, R. J., Publicover, N. G., Smith, T. K. Induction and organization of Ca2+ waves by enteric neural reflexes. Nature. 399, 62-66 (1999).
  20. Stevens, R. J., Publicover, N. G., Smith, T. K. Propagation and neural regulation of calcium waves in longitudinal and circular muscle layers of guinea-pig small intestine. Gastroenterology. 118, 982-984 (2000).
  21. Jessen, K. R., et al. Astrocyte-like glia in the peripheral nervous system: an immunohistochemical study of enteric glia. Journal of Neuroscience. 3 (11), 2206-2218 (1983).
  22. Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9, 625-632 (2012).
  23. Gomes, P., et al. ATP-dependent paracrine communication between enteric neurons and glia in a primary cell culture derived from embryonic mice. Neurogastroenterology & Motility. 21 (8), e870-e862 (2009).
  24. Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Purinergic neuron-to-glia signaling in the enteric nervous system. Gastroenterology. 136, 1349-1358 (2009).
  25. Ren, J., Bertrand, P. P. Purinergic receptors and synaptic transmission in enteric neurons. Purinergic Signal. 4, 255-266 (2008).
  26. Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. Measurement of intracellular calcium. Physiol Rev. 79, 1089-1125 (1999).
  27. Dongcheng, Z., et al. Neural crest regionalisation for enteric nervous system formation: implications for Hirschsprung's disease and stem cell therapy. Developmental Biology. 339 (2), 280-294 (2010).
  28. Gershon, M. D. Behind an enteric neuron there may lie a glial cell. J Clin Invest. 121, 3386-3389 (2011).
  29. Boesmans, W., et al. Imaging neuron-glia interactions in the enteric nervous system. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, (2013).

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Imagerie calciquePréparation en montage entierColorant indicateur fluorescentMicroscopie de fluorescencePlexus myentériqueChargement au Fluo-4Stimulation pharmacologiqueAcquisition d'imagesActivité des cellules gliales
De l'imagerie in situ de Ca du système nerveux entérique
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.