Imagerie Ca locale<sup&gt; 2+</sup&gt; Signaux de cellules de mammifères cultivées

Résumé

Nous présentons ici des techniques d’imagerie des événements Ca²⁺ médiés par IP₃ locaux à l’aide de la microscopie à fluorescence dans des cellules de mammifères intactes chargées d’indicateurs Ca²⁺ ainsi qu’un algorithme qui automatise l’identification et l’analyse de ces événements.

Résumé

Cytosolique ions Ca ²⁺ réglementer de nombreux aspects de l'activité cellulaire dans presque tous les types de cellules, le contrôle des processus aussi variés que la transcription des gènes, excitabilité électrique et la prolifération cellulaire. La diversité et la spécificité de Ca ²⁺ signalisation dérive de mécanismes par lesquels Ca ²⁺ signaux sont générés pour agir sur des échelles de temps et d'espace différentes, allant des oscillations et des vagues large cellulaires survenant au cours des périodes de minutes à transitoires ^{Ca2 +} microdomaines locales (Ca ²⁺⁾ bouffées millisecondes durables. Les progrès récents dans électrons multipliés CCD (EMCCD) caméras permettent désormais pour l'imagerie des signaux Ca ²⁺ locaux avec une résolution spatiale de 128 x 128 pixels à des taux de> 500 cadres sec ^-1 (fps). Cette approche est très parallèle et permet la surveillance simultanée de centaines de chaînes ou d'autres sites feuilletées dans une seule expérience. (1 pe Cependant, les grandes quantités de données générées ca. Gbr min) de rendre l'identification visuelle et l'analyse de Ca ²⁺ locale événements impraticable. Ici, nous décrire et démontrer les procédures pour l'acquisition, la détection et l'analyse des IP locale ₃ médiée Ca ²⁺ signaux dans les cellules mammifères intactes chargés de Ca ²⁺ indicateurs utilisant à la fois grand champ épi-fluorescence (WF) et la réflexion interne totale fluorescence (FRBR) microscopie. En outre, nous décrivons un algorithme développé au sein de l'open-source environnement logiciel Python qui automatise l'identification et l'analyse de ces signaux locaux Ca ^2+. L'algorithme localise les sites de Ca ²⁺ de presse avec une résolution sous-pixel; permet d'avis utilisateur des données; et délivre séquences temporelles de signaux de rapport de fluorescence avec amplitude et données cinétiques dans un tableau Excel compatible.

Introduction

Les ions calcium (Ca2 ⁺⁾ régulent ubiquitaire un large éventail de processus biologiques, y compris l'expression des gènes, la sécrétion et des changements durables dans la plasticité synaptique ^1. Un moyen par lequel Ca ²⁺ peut agir de manière diversifiée est à travers les différentes configurations spatiales et temporelles de Ca ²⁺ signale une cellule peut générer. Par exemple, les élévations mondiaux dans cytosolique [Ca ^2+] déclenchement de la contraction dans le tissu musculaire lisse ² alors plus petit, élévations transitoires localisées (locales ^{Ca2 +)} microdomaines stimuler l'expression de gène essentiel pour l'apprentissage et la mémoire ^3.

Cytosolique libre [Ca ^2+] est maintenue à ~ 100 nM au repos, mais peut rapidement se élever à plusieurs micro-molaire suivante l'afflux de Ca2 ⁺ dans le cytosol par Ca ²⁺ canaux ioniques -permeable situés dans la membrane plasmique et par la libération de Ca ²⁺ intracellulaire de stores. Notre laboratoire se concentre sur le récepteur de l'inositol 1,4,5-triphosphate (IP ₃ R), qui forme un canal de libération ²⁺ Ca situé dans la membrane du réticulum endoplasmique (RE). Lors de la liaison à la fois de _IP3 et Ca2 ⁺ cytosolique à l'activation des sites du récepteur, le canal R IP ₃ se ouvre pour libérer Ca2 ⁺ séquestré dans la lumière du RE. La libération de Ca ²⁺ peut rester dans l'espace restreint à un petit groupe de IP ₃ Rs pour générer un microdomaine cytosolique locale de Ca2 ⁺ (Ca ²⁺ feuilletée ⁴⁾ ou, en fonction de la proximité des pôles voisins de IP ₃ Rs, peut propager dans une cellule en recrutant plusieurs sites feuilletées par un processus de Ca ²⁺ induite par Ca ²⁺ -release (CICR) ^5,6.

L'introduction d'indicateurs les colorants ^de petite molécule fluorescente Ca développé par Roger Tsien ^7, couplé avec la microscopie avancée Imaging techniques, a grandement facilité notre compréhension de Ca ²⁺ signalisation. Les progrès récents en caméras utilisées pour la microscopie permettent désormais pour l'imagerie transitoires locales Ca ²⁺ événements tels que bouffées avec une résolution spatiale et temporelle sans précédent. Actuellement disponibles caméras EMCCD permettent imagerie avec 128 x 128 pixels à 500 images> ^-1 sec (fps) et la nouvelle génération de semi-conducteur complémentaire à oxyde de métal (CMOS) caméras offrent une résolution de pixels, et la vitesse encore plus rapide au détriment de légèrement plus élevé des niveaux de bruit. En collaboration avec réflexion totale interne (FRBR) microscopie, il est maintenant possible d'une seule image Ca ²⁺ Les événements de canaux ^8,9. Cette approche permet l'imagerie de centaines de canaux / événements simultanément, tout en générant de grands ensembles de données (environ 1 Go par min) qui rendent le traitement manuel, l'identification visuelle et l'analyse impraticable et placer un fardeau sur le développement d'algorithmes automatisés.

Ici, nous présentons des procédures et des protocoles pour l'imagerie locales Ca ²⁺ signaux dans les cellules de mammifères en utilisant intactes fluorescentes Ca ²⁺ indicateurs. Nous démontrons en outre un algorithme développé dans l'environnement Python open-source qui automatise l'identification et l'analyse de Ca ²⁺ événements locaux imagés à la fois par la FRBR et large champ épi-fluorescence conventionnelle (WF) microscopie. Bien que nous décrivons ces approches dans le contexte de la PI ₃ -generated signaux ^{Ca2 +,} ils sont facilement prête pour étudier les changements locaux dans cytosolique [Ca ^2+] issues d'une variété de Ca ²⁺ canaux ioniques -permeable situés soit dans la surface ou membrane d'organites intracellulaires ^10/08.

Protocole

Nous présentons des procédures détaillées pour l'imagerie locales Ca ²⁺ événements dans les cellules SH-SY5Y neuroblastome humain. Ces procédures peuvent être adaptées à l'image de Ca ²⁺ intracellulaire des signaux dans de nombreux types cellulaires ^10/08.

1. Préparation des cellules

1. Culture des cellules à imager selon les instructions figurant sur le site Internet de leur fournisseur.
2. Quelques jours avant l'imagerie, les cellules de récolte cultivées dans un flacon de culture tissulaire en utilisant 1 ml de 0,25% de trypsine / EDTA (2-3 min). À la suite de détachement, ajouter un volume égal de milieu de culture pour inactiver la trypsine.
3. Effectuer une numération cellulaire en utilisant un hémocytomètre et de semences cellules dans des boîtes d'imagerie à fond de verre à une densité de 3-7 x 10 ⁴ cellules par boîte. Sélectionnez les cellules pour des expériences d'imagerie quand ils atteignent 60% de confluence (2-3 jours).

2. Préparation des solutions et réactifs

1. Préparer un Ca ²⁺ contenant tamponnée HEPESsolution de sel (Ca ²⁺ -HBSS), composée de (mM): NaCl 135, KCl 5,4, CaCl 2 _2, MgCl ₂ 1, HEPES 10, 10 et glucose; pH = 7,4 à la température ambiante (TA) avec NaOH. Préparer Ca ²⁺ -HBSS sans l'ajout de glucose et conserver à 4 ° C; ajouter à la solution de glucose immédiatement avant l'utilisation.
2. Solubiliser les formes de la Ca ²⁺ indicateur fluorescent Cal-520 (1 mM) infiltrant les membranes, ci-IP ₃ (200 uM), et EGTA (100 mM) dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) contenant 20% de Pluronic F-127. Aliquoter ces réactifs dans des tubes Eppendorf et magasin, à l'abri de l'humidité et de la lumière, à -20 ° C.

3. Les cellules de chargement avec infiltrant les membranes Cal-520, ci-IP ₃ et EGTA

1. Préparer le "tampon de chargement" par dilution de solutions mères de infiltrant les membranes Cal-520 et CI-IP ₃ à une concentration finale de 5 uM et 1 uM, respectivement, dans -HBSS Ca2 ^+.
2. Aspirer cumédias LTURE et rincer les cellules en remplaçant médias Ca ²⁺ -HBSS trois fois.
3. Retirer Ca ²⁺ -HBSS et incuber les cellules dans un tampon de chargement pendant 60 min à température ambiante dans l'obscurité.
4. Éliminer le tampon de chargement et rincer les cellules en remplaçant médias Ca ²⁺ -HBSS trois fois.
   1. Si vous le souhaitez, à cette étape, les cellules de charge avec EGTA / AM en diluant la solution mère à une concentration finale de 5 uM dans Ca ²⁺ -HBSS et puis incuber les cellules pendant 30-60 min à température ambiante dans l'obscurité. Après cette incubation, rincer les cellules trois fois avec Ca ²⁺ -HBSS avant de procéder à l'étape 3.5.
5. Incuber les cellules à Ca ²⁺ -HBSS de 30 min pour permettre la désestérification de réactifs chargés.
6. Immédiatement avant l'imagerie, remplacer le Ca2 ⁺ avec -HBSS "frais" Ca ²⁺ -HBSS afin d'éliminer tout colorant qui aurait fui dans le bain au cours de l'incubation finale.

4. Ca ²⁺ Acquisition d'image

1. Placer une petite goutte d'huile d'immersion sur l'objectif 100X APO FRBR (NA 1,49).
2. Monter le plat d'imagerie sur la scène du microscope inversé et amener les cellules au point en utilisant la lumière transmise. Il est important de fixer la capsule d'imagerie pour empêcher tout mouvement pendant l'enregistrement.
3. Illuminer les cellules avec un laser 488 nm afin d'exciter Cal-520 et collecter la fluorescence émise (λ> 510 nm) en utilisant une caméra EMCCD à grande vitesse.
   REMARQUE: Le logiciel qui fonctionne le microscope permet à l'utilisateur de traduire une lentille de focalisation permettant le faisceau laser à introduire soit à l'extrême bord de l'ouverture de retour objectif (de la FRBR excitation) ou plus au centre (pour l'excitation "WF").
4. Utilisation du logiciel EMCCD, réduire le champ d'imagerie des pleins 512 x 512 pixels afin de recueillir des données à la résolution temporelle nécessaire pour capturer locales Ca ²⁺ événements.
   REMARQUE: Par exemple, quad centreacquisition de 256 x 256 pixels accélère la vitesse d'acquisition à 66 fps. Il est également possible d'augmenter encore la fréquence d'images de la caméra EMCCD 500 fps en utilisant une fonction du mode de récolte isolé.
5. Configurer le logiciel pour enregistrer automatiquement quelques secondes de l'activité de base, offrir un flash UV aux cellules et continuer à enregistrer pour un autre 10 à 30 sec.
   REMARQUE: Un flash UV est fourni en utilisant une source de lumière à arc au xénon introduit à travers un miroir réfléchissant les UV dichroïque dans l'orifice arrière du microscope. La durée et l'intensité du flash UV est ajusté empiriquement pour évoquer une fréquence souhaitée des locaux Ca ²⁺ événements.
6. Enregistrer les fichiers que l'image des piles pour l'analyse hors ligne.

5. Analyse automatisée Ca ²⁺ Image

NOTE: Il est possible de visualiser, traiter et analyser les données capturées en utilisant de nombreux logiciels commerciaux. Cependant, nous avons développé un algorithme pour automatiser l'identification rapide d'uneanalyse de ^{Ca2 +} d de signaux locaux. Une description détaillée des filtres spatiales et temporelles utilisées dans cet algorithme, la génération des AF / F ₀ et l'identification / analyse des routines peut être trouvée dans ^11. Cet algorithme a été développé pour fonctionner sur la plate-forme open-source du logiciel Python, et peut être obtenu, avec l'échantillon de données expérimentales et les instructions d'utilisation détaillées, en envoyant un courriel de l'auteur correspondant (ismith@uci.edu).

1. Convertir des fichiers à importer dans l'algorithme écrite sur mesure pour le format de fichier de la multi-plan.
2. Localisez le dossier contenant l'algorithme d'analyse et double cliquez sur le run.exe.
3. Sélectionnez le fichier .tiff à analyser.
4. Choisissez les paramètres d'analyse dans la boîte de dialogue ouverte. Voir la figure 2A pour les paramètres par défaut pour les données d'échantillon.
5. Déterminer le niveau de noir à être décalée par rapport à la pile de l'image en déplaçant le curseur sur une partie du champ de vue qui ne nOT contient une cellule (voir la figure 2B) ou en saisissant manuellement un niveau de noir à l'aide de l'invite «Black Level Set '.
6. Observez quatre fenêtres sur l'écran après analyse par le logiciel (figure 2C-F). C est une image monochrome de repos fluorescence à partir de cellules en cours d'analyse. Les carrés blancs superposés sur cette image sont des lieux d'événements déterminés, que les positions barycentre de fonctions gaussiennes deux dimensions montés sur les événements.
7. Cliquez sur chaque lieu de l'événement ou appuyez sur les touches de curseur pour faire défiler les événements. En faisant ainsi l'arrière-plan soustrait, gaussien lissée changements de rapport de fluorescence (AF / F) ₀ à chaque mise à jour de ces sites dans la fenêtre D.
   REMARQUE: Rouge souligné les événements sont déterminés à provenir de ce site particulier et non pas de «purge-through 'de l'activité localisée à des sites adjacents. La trace bleue inférieure indique l'endroit où le signal de fluorescence sur le site choisi dépassé la détectionseuil, alors que la ligne noire identifie les événements provenant de ce site particulier (correspondant à la couleur rouge des événements mis en évidence).
8. Cliquer sur un événement en surbrillance rouge pour mettre à jour la fenêtre E qui affiche l'évolution temporelle de l'événement, et la fenêtre F qui présente le profil spatial de l'événement en moyenne sur son évolution dans le temps, ainsi que le profil spatial de la fonction gaussienne équipée.
9. Examiner manuellement les événements qui ont été identifiés à ce que les artefacts peuvent être rejetés de l'analyse. Supprimer ces événements en cliquant droit sur le rouge souligné événements.
   NOTE: Dans nos mains, flux de Ca2 ⁺ par des voies simples IP ₃ R évoque des signaux avec AF / F ₀ environ 0,11, sont donc susceptibles d'être de faux positifs des «événements» détectés sensiblement plus petites que cela.
10. Exporter des données en sélectionnant «Enregistrer sur Excel» ou exporter des données sur une base par cellulaire en dessinant autour de la cellule d'intérêt et en sélectionnant «Enregistrer CellR17 ;.
    Note: Les données sont enregistrées dans le même dossier que la pile de l'image originale.

Résultats

Figure 1A montre une image WF de repos Cal-520 fluorescence dans les cellules de neuroblastome SH-SY5Y humains également chargé avec ₃ ci-IP. L'exposition de ces cellules à un flash 100 UV msec à la photo-presse i-IP ₃ a suscité transitoires ^{Ca2 +} bouffées sur des sites discrets (relevées par les cercles blancs sur la figure 1A). traces de fluorescence mesurée à ces sites ont montré une phase de montée rapide en raison d'ouvertures de passage de ...

Discussion

Nous décrivons ici les protocoles pour l'imagerie locales Ca ²⁺ événements dans des cellules de mammifères cultivées en utilisant fluorescentes Ca ²⁺ indicateurs. En outre, nous décrivons un algorithme avec une interface utilisateur intuitive qui automatise l'identification et l'analyse des données acquises. La procédure décrite ici utilisent le Ca ²⁺ fluorescente indicateur Cal-520, mais beaucoup d'autres colorants Ca ²⁺ sensibles comme Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8 ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Neuroblastome humain SH-SY5Y cellules	ATCC	CRL-2266
Cal-520/AM	AAT Bioquest Inc.	21130
ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidène-6-O-(2-nitro-4,5-diméthoxy)benzyl-myo-Inositol 1,4,5-trisphosphate-Hexakis(propionoxyméthyl) Ester	SiChem	cag-iso-2-145-10
DMSO/20 % pluronic F127	Invitrogen	P-3000MP
EGTA/AM	Invitrogen	E-1219
Boîtes d’imagerie à fond de verre de 35 mm	MatTek	P35G-1.5-14-C