Busulfan comme agent myélosuppressive pour générer de haut niveau stable de moelle osseuse chez des souris chimérisme

Résumé

Nous décrivons un protocole par lequel le conditionnement au busulfan permet de remplacer la moelle osseuse d’une souris receveuse par des cellules de moelle osseuse de souris donneuses exprimant de manière ubiquitaire une protéine fluorescente verte, en l’absence d’irradiation. Cette technique est utile pour étudier l’accumulation de cellules de moelle osseuse dans le système nerveux central.

Résumé

La greffe de moelle osseuse (BMT) est souvent utilisée pour remplacer le compartiment de la moelle osseuse (BM) des souris receveuses par des cellules BM exprimant un biomarqueur distinct isolé de souris donneuses. Cette technique permet d’identifier les cellules hématopoïétiques dérivées du donneur chez les souris receveuses et peut être utilisée pour isoler et caractériser les cellules du donneur à l’aide de diverses techniques biochimiques. La BMT repose généralement sur un conditionnement myéloablatif avec irradiation corporelle totale pour générer un espace de niche dans le compartiment BM des souris receveuses pour la greffe de cellules donneuses. Le protocole que nous décrivons ici utilise un conditionnement myélosuppresseur avec l’agent chimiothérapeutique busulfan. Contrairement à l’irradiation, qui nécessite l’utilisation d’installations spécialisées, le conditionnement du busulfan est effectué à l’aide d’injections intrapéritonéales de 20 mg/kg de busulfan jusqu’à ce qu’une dose totale de 60 à 100 mg/kg ait été administrée. De plus, l’irradiation myéloablative peut avoir des effets secondaires toxiques et nécessite une greffe réussie de cellules donneuses pour la survie des souris receveuses. En revanche, le conditionnement du busulfan à l’aide de ces doses est généralement bien toléré et les souris survivent sans le soutien des cellules du donneur. Les cellules BM du donneur sont isolées des fémurs et des tibias de souris exprimant de manière ubiquitaire la protéine fluorescente verte (GFP) et injectées dans la veine latérale de la queue de souris receveuses conditionnées. Le chimérisme de la BM est estimé en quantifiant le nombre de cellules GFP+ dans le sang périphérique après la BMT. Des niveaux de chimérisme >80 % sont généralement observés dans le sang périphérique 3 à 4 semaines après la greffe et restent établis pendant au moins 1 an. Comme pour l’irradiation, le conditionnement au busulfan et au BMT permet l’accumulation de cellules dérivées de BM de donneur dans le système nerveux central (SNC), en particulier dans les modèles murins de neurodégénérescence. Cette accumulation du SNC médiée par le busulfan peut être plus physiologique que l’irradiation corporelle totale, car le traitement au busulfan est moins toxique et l’inflammation du SNC semble être moins étendue. Nous émettons l’hypothèse que ces cellules peuvent être génétiquement modifiées pour administrer des traitements au SNC.

Introduction

Récemment, on s’est beaucoup intéressé aux rôles de la microglie et des cellules dérivées de la moelle osseuse (BMDC) dans le système nerveux central (SNC), tant au cours de la maladie qu’en cas de vieillissement normal. On sait maintenant que les microglies, les cellules immunitaires résidentes du SNC, se développent dans le SNC à la suite de l’entrée de progéniteurs myéloïdes primitifs au cours de l’embryogenèse¹. Les microglies conservent des aspects de leur lignée myélomonocytaire jusqu’à l’âge adulte. Bien que les preuves suggèrent que la contribution des BMDC au pool microglial est minime chez les animaux adultes en bonne santé¹, le rôle qu....

Protocole

REMARQUE: éthique Déclaration: Ce protocole a été examiné et approuvé par le Comité de l'Université Simon Fraser de protection des animaux (UACC; numéros de permis 1037K-12 et 1060K-03) et est en conformité avec le Conseil canadien de protection des animaux, le Guide NIH pour la directive du Conseil de la CEE soin et l'utilisation des animaux de laboratoire, et.

1. Considérations particulières

NOTE: Le busulfan est cytotoxique. Manipuler et éliminer conformément à la fiche de données de sécurité matériel et directives institutionnelles.

1. Effectuer toutes les techniques de manière aseptique da....

Résultats

L'administration de 60 à 100 mg / kg de busulfan est généralement bien toléré par les souris. Toutefois, les animaux perdent généralement du poids pendant la phase de conditionnement (~ 5-10%) et donc l'alimentation peut être complétée avec des friandises telles que les graines de tournesol irradiés pour encourager manger. Les niveaux de chimérisme de> 80% des cellules GFP + dans le sang périphérique et BM doivent être régulièrement réalisable à l'aide de 60 à 100 mg / kg de busulfan ^7. Notre l.......

Discussion

Busulfan conditionnement permet la génération de haut niveau BM chimérisme chez la souris avec des cellules hématopoïétiques qui sont facilement détectables. Ce conditionnement peut être effectué sans le besoin d'installations d'irradiation. En outre, la myélosuppression avec les doses de busulfan décrite dans le présent protocole est bien toléré, minimisant les effets secondaires toxiques causés par des doses myéloablatives d'irradiation, et donc peut être une technique plus approprié pour générer BM chimér.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Busulfex	Otsuka Canada Pharmaceutique Inc.	DIN 02240602	Diluer le busulfan à 3 mg/mL avec du PBS stérile juste avant l’utilisation. Le busulfan est cytotoxique. Manipulez et éliminez conformément aux fiches signalétiques et aux directives institutionnelles.
ACK Lysing Buffer	Life Technologies	A10492-01	D’autres tampons de lyse pourraient être substitués, mais les temps d’incubation pourraient devoir être ajustés en conséquence
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	12483-020