Le modèle murin de l’obstruction urétérale unilatérale irréversible (UUO) est présenté en même temps que le modèle de l’UUO réversible dans lequel l’obstruction urétérale est soulagée par anastomose de l’uretère sectionné dans la vessie. Ces modèles permettent l’étude de l’inflammation et de la cicatrisation rénales ainsi que le remodelage tissulaire.
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Article de méthode
Un modèle murin d'irréversible et réversible unilatérale obstruction urétérale
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’obstruction du rein peut affecter les reins natifs ou transplantés et entraîner des lésions rénales et des cicatrices. Nous présentons ici un modèle de néphropathie obstructive induite par une obstruction urétérale unilatérale (UUO), qui peut être soit irréversible (UUO), soit réversible (R-UUO). Dans le modèle UUO irréversible, l’uretère peut être obstrué pendant des périodes de temps variables afin d’induire une inflammation rénale de plus en plus sévère et une cicatrisation fibrotique interstitielle. Dans le modèle R-UUO réversible, l’uretère est obstrué pour induire une hydronéphrose, une dilatation tubulaire et une inflammation. Après une période de temps appropriée, l’obstruction urétérale est ensuite inversée chirurgicalement par anastomose de l’uretère sectionné précédemment obstrué de la vessie afin de permettre une décompression complète du rein et la restauration du flux urinaire vers la vessie. Le modèle UUO irréversible a été utilisé pour étudier divers aspects de l’inflammation et de la cicatrisation rénales, y compris la pathogenèse de la maladie et la mise à l’essai de thérapies anti-inflammatoires ou anti-fibrotiques potentielles. Le modèle le plus difficile de la R-UUO a été utilisé par certains chercheurs et offre un potentiel de recherche important car il permet d’étudier les processus inflammatoires et immunitaires et le remodelage tissulaire dans un rein blessé et cicatrisé après l’élimination du stimulus nuisible. Par conséquent, le modèle R-UUO offre aux chercheurs la possibilité d’explorer la résolution de l’inflammation rénale ainsi que des aspects clés de la réparation tissulaire. Ces modèles expérimentaux sont pertinents pour les maladies humaines, car les patients présentent souvent une obstruction des voies rénales qui nécessite une décompression et se retrouvent souvent avec une insuffisance rénale résiduelle importante qui n’a pas d’options de traitement actuelles et peut conduire à une insuffisance rénale terminale.
Introduction
L’objectif global du modèle expérimental décrit ici est d’induire une néphropathie obstructive par obstruction urétérale unilatérale (UUO), qui peut être soit irréversible (UUO), soit réversible (R-UUO). Un modèle simple et irréversible d’UUO est présenté dans lequel l’uretère gauche est obstrué de façon permanente par une ligature avec une suture ou par l’application d’un clip de ligature. Il en résulte une dilatation marquée de l’uretère associée à une réduction du débit sanguin rénal et de la filtration glomérulaire. L’histologie rénale met en évidence une dilatation tubulaire et une inflammation rénale interstitielle et une fibrose de plus en plus sévères. L’UUO irréversible est un modèle utile et a été adopté par de nombreux chercheurs dans l’étude de l’inflammation rénale et de la fibrose. 1-4 Bien que le modèle irréversible de l’UUO nécessite une certaine expertise chirurgicale, il est relativement simple et est souvent utilisé pour obtenir des informations sur la pathogenèse des lésions rénales interstitielles et la fibrose qui en résulte. Un modèle R-UUO moins fréquemment utilisé utilisant une modification de la méthode décrite à l’origine par Tapmeier et al. est également présenté. 5 Le modèle R-UUO a un grand potentiel futur pour l’étude des processus inflammatoires et immunitaires, de la régénération cellulaire et tissulaire ainsi que du remodelage tissulaire ultérieur après l’élimination d’un stimulus nuisible.
Le modèle R-UUO, plus difficile, a été utilisé par un nombre limité de chercheurs, certains groupes employant une technique chirurgicale significativement différente de celle décrite ici6,7, mais avec des résultats intéressants. Dans le modèle R-UUO présenté, l’uretère est ligaturé pour induire une obstruction urétérale complète pendant une période de temps suffisante pour induire le niveau de lésion et de fibrose souhaité : 7 jours d’UUO ont été choisis dans la méthode décrite ici. L’obstruction urétérale est inversée et le rein est laissé à décompresser pendant une période de temps déterminée par l’investigateur avant que les souris ne soient abattues et que le rein ne soit retiré pour analyse : 7 jours de décompression ont été choisis dans la méthode décrite ici, bien qu’une période plus longue ait été choisie si la résolution de l’inflammation et de la fibrose était étudiée. Bien que la méthode décrite ici nécessite une expertise chirurgicale importante, elle offre plusieurs avantages par rapport aux autres modèles R-UUO. L’application d’un tube en plastique à paroi souple sur l’uretère obstrué empêche une dilatation urétérale excessive, ce qui facilite la manipulation et l’anastomose ultérieures de l’uretère. De plus, dans le modèle R-UUO décrit, l’uretère est divisé, ce qui permet d’éliminer tout sédiment et débris urinaires résiduels. Cela confirme que la lumière restante de l’uretère est désobstruée et perméable avant l’anastomose de la vessie.
Les expériences intégrant à la fois les modèles UUO irréversibles et réversibles peuvent fournir aux chercheurs un aperçu puissant des mécanismes moléculaires et cellulaires des lésions et de la résolution et de la régénération ultérieures. Ainsi, le modèle de R-UUO décrit ici serait très pertinent pour les chercheurs intéressés par le remodelage tissulaire post-inflammatoire et la façon dont il peut être modulé.
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Protocole
Directives générales: expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et règlements imposés par les animaux (Scientific Procedures) de Loi 1986. Ce protocole et le protocole de vidéo qui l'accompagne sont à la fois un UUO standard et un R-UUO, qui peut être effectuée sur plusieurs souches de souris. Dans la vidéo d'accompagnement, les deux procédures sont effectuées sur des souris C57BL / 6 mâles âgées de 8 semaines les souris. Les données présentées dans la section des résultats représentatifs ont été obtenus auprès de sexe masculin souris FVB / n.
NOTE: Ce protocole et accompagner détails de la vidéo comment effectuer une UUO standard et R-UUO utilisant l'uretère gauche, mais les mêmes techniques peuvent facilement être appliqués à l'uretère droit.
1. Préparation des animaux et la laparotomie
- Effectuer toutes les procédures avec les instruments et consommables stériles (autoclave).
- Injecter chlorhydrate de kétamine (70 mg / kg) et du chlorhydrate de médétomidine (1 mg / kg) par voie intraperitoneale à anesthésierla souris. Remarque: La durée de l'anesthésie plan résultant est de 4 heures et pas d'anesthésie supplémentaire ne est nécessaire.
- Confirmer la profondeur de l'anesthésie par la perte des réflexes, par exemple pincement de l'orteil.
- Retirez tous les cheveux entourant la zone d'incision et de préparer la peau pour la chirurgie abdominale via l'application d'une solution diluée de chlorhexidine.
- Placez la souris sur un bloc chirurgical chauffé dans une position couchée et fixer les membres à l'aide de ruban adhésif pad à faible adhérence.
- Durant la procédure, surveiller la souris les signes de brûlures thermiques en raison du tampon chirurgical chauffé. Si possible, utilisez une source de chaleur non-électrique.
- Administrer un analgésique par injection sous-cutanée de chlorhydrate de buprénorphine (0,06 mg / kg) et appliquer du lubrifiant oculaire pour éviter un dessèchement de la cornée.
- Faire une laparotomie médiane et une incision de la linea alba avasculaire l'aide de ciseaux de tissu de séparation pour accéder à la cavité péritonéale.
- Drapé de la souris et insérer un colibrirétracteur dans l'incision.
2. unilatérale obstruction urétérale
- Utilisation de bourgeons de coton stérilisés exposer l'uretère gauche en déplaçant les intestins vers le côté droit de la cavité abdominale et les couvrir avec des rideaux humides.
- En utilisant des pinces angulaires isoler et soulever l'uretère gauche.
- Pour créer une obstruction urétérale, ligaturer l'uretère gauche deux fois avec 6 / O noir tressé de soie suture ne importe où entre la vessie et du bassinet du rein. Pour les expériences à long terme, utiliser suture absorbable pour toutes les chirurgies abdominales. En variante, une pince de ligature peut être appliquée à l'uretère.
- Pour isoler la vessie de l'uretère, diviser l'uretère entre les deux points de suture.
- Replacez soigneusement les intestins dans la cavité péritonéale.
- Suivez les étapes énumérées à la section 4 - récupération post-opératoire et des Soins de fermer l'incision et d'inverser l'anesthésie.
3. Préparation pour Reversible unilatérale obstruction urétérale
- Préparer une souris pour la chirurgie et d'isoler l'uretère gauche comme indiqué dans les étapes 1.1 à 2.2 ci-dessus.
- Pour créer une obstruction urétérale qui peut être inversée, ligaturer l'uretère gauche deux fois avec 6 / O noir tressé de soie suture près de la vessie. Laissez une extrémité de la suture supérieure tant que ce sera utilisé pour ancrer le tube en plastique à paroi souple en place autour de l'uretère.
- Faire une fente longitudinale sur une longueur de 5 mm de tube en plastique à paroi souple de manière à pouvoir être évasée ouverte pour lui permettre d'être appliqué à l'uretère. De préférence un tube en plastique à paroi souple en silicone, avec un diamètre interne de 1 mm et un diamètre externe de 2 mm, peut être utilisé.
- Placez le tube en plastique à paroi souple doucement autour de l'uretère. Se assurer que le fil de suture longue émerge du centre de la fente dans le tube une fois qu'il est fermé autour de l'uretère.
- Placez une longueur de 6 / O noire tressée suture de soie autour du tube à paroi souple enfermant l'uretère et cravateune fois. Maintenant, placer l'extrémité longue du fil de suture, émergeant du centre de la fente dans le tube, longitudinalement à travers le tube de telle sorte qu'il se trouve au-dessus de la suture attachée précédemment.
- Attacher le fil de suture autour du tube situé à deux reprises pour ancrer le tube et l'extrémité de fil de suture longue en place autour de l'uretère.
Remarque: Pour éviter la formation d'adhérences sur l'uretère et le tube en plastique à paroi souple, d'une solution de réduction de l'adhérence peut être appliqué à la zone autour du tube. - Replacez soigneusement les intestins dans la cavité péritonéale.
4. récupération post-opératoire et des Soins
- Fermez le péritoine avec point de feston utilisant 5 / O noire tressée suture de soie et de se rapprocher de la peau à l'aide des clips métalliques de la peau.
- Pour minimiser le risque d'infection post-opératoire, appliquez un antiseptique comme solution d'iode / alcool pour la peau abdominale.
- Partiellement anesthésie inverse avec le chlorhydrate d'atipamézole (2 mg / kg) sous-cutanée.
- Administrer des fluides par une injection sous-cutanée de 1 ml de solution saline chauffée.
- Surveiller la souris jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance.
- Laisser la souris pour récupérer dans une boîte chauffée maintenue à 29 ° C pendant 24 heures. Nourriture humide peut également être fournie pour encourager l'apport hydrique et de la nutrition.
- Laissez la souris pour récupérer pour induire un niveau souhaité de l'obstruction, généralement sept jours.
- Pour les expériences de reconstitution à long terme, fournir des analgésiques en cours. Si la souris est à récupérer pendant plus de sept jours, retirez les clips de la peau 7 jours après la chirurgie.
- Une fois le niveau de l'obstruction désiré a été induite, soit inverser la UUO, comme décrit ci-dessous, ou euthanasier la souris par dislocation cervicale et de recueillir les reins pour l'analyse de l'histopathologie.
5. réversible unilatérale obstruction urétérale
- Pour effectuer une R-UUO préparer une souris, qui a subi une préparation pour le R-UUO, pour une chirurgie tel que décrit dans les étapes 1De 0,1 à 1,7.
- Se il est présent, retirez les clips de la peau et de diviser ou de retirer les points de suture dans le péritoine pour accéder à la cavité abdominale. Remarque: Si l'uretère a été obstrué pendant long terme clips de la peau de l'expérience aurait dû être retiré sept jours suivant l'application.
- Préparer la souris et isoler l'uretère gauche de la manière décrite dans les étapes 1,8 à 2,2.
- En utilisant des pinces angulaires, libérer le tube en plastique à paroi souple de tout tissu de granulation qui peuvent avoir formé.
- Couper le fil de suture en tenant le tuyau plastique autour de l'uretère obstrué avec un scalpel et retirer le tube.
- Confirmez succès UUO en évaluant la présence d'hydronéphrose dans le rein gauche, le rein devrait également apparaître pâle.
- Diviser l'uretère entre les sutures.
- Passer la longueur restante de l'uretère, le rein attaché à, sur un petit morceau de gaze stérile. Il sera utilisé pour recueillir le sédiment urinaire et les cellules mortes qui se écouler de l'uretère unee bassinet une fois la suture sont enlevés.
- Diviser l'uretère ci-dessus, mais à proximité, la suture et permettre le rein se écouler sur la gaze. Laissez la suture inférieure, plus proche de la vessie, intacte. Il se agit de se assurer qu'aucune fuite urine provenant de la vessie et dans la cavité peritoneale.
- Une fois l'uretère et bassinet du rein ont été drainés, appliquez une longue 6 / O noire tressée suture de soie à la fin de la durée restante de l'uretère. Il sera utilisé pour aider l'uretère anastomose de la vessie réalisée plus tard.
- Suivez les étapes ci-dessous pour anastomoser la longueur restante de l'uretère dans la vessie:
- Mettre l'uretère tel qu'il se trouve en avant de sa position d'origine et se trouve sur le rein.
- Placer un unique 9 / O polyamide monofilament pointage suture 2 mm de l'extrémité de l'uretère de telle sorte qu'il émerge dans la direction de la vessie. Veillez à ce que la suture reste dans la couche musculaire et ne entre pas dans la lumière de l'uretère. Le wil pointage de suturel être utilisé pour ancrer l'uretère dans la vessie.
- Pour créer un canal à travers la vessie, passer une aiguille de 21G en diagonale à travers la vessie de telle sorte que sa sortie vers l'avant (ventrale) paroi de la vessie.
- Reste une aiguille à chas dans le biseau de l'aiguille 21G. Utilisez l'aiguille de 21G pour guider l'aiguille yeux à travers la vessie. L'aiguille à chas sera utilisé pour prendre l'uretère à travers la vessie.
- Faire passer le fil de suture 9 adhésivité / O, appliqué à l'uretère à l'étape 5.11.2, à travers la première incision dans la vessie et à travers la paroi de la vessie adjacente au point d'entrée. Une fois l'uretère est passé à travers la vessie ce sera liée à ancrer l'uretère à la vessie.
- Placer la longue 6 / O noire tressée suture de soie appliqué à la fin de l'uretère à l'étape 5.10 borgne à travers l'aiguille.
- Retirer délicatement l'aiguille yeux hors de la vessie tout en garantissant que l'uretère est également tiré à travers la vessie.
- Une fois l'uretère se dégage de the vessie retirer l'aiguille yeux et appliquer une pince à suture long à la fin de l'uretère pour empêcher la rétraction en arrière dans la vessie.
- Pour ancrer au sein de l'uretère dans la vessie, attacher le 9 / O polyamide monofilament amure suture, appliquée à l'étape 5.11.5.
- Appliquer sutures monofilament de liaison supplémentaires simples 9 / O de polyamide comme décrit dans les étapes 5.11.2 et 5.11.5 à deux endroits à travers le point d'entrée pour ancrer fermement l'uretère dans la vessie.
- Avec le dos de ciseaux ouverts, pousser la paroi de la vessie légèrement en arrière pour exposer davantage de l'uretère émergente.
- Diviser l'uretère-dessus de la longue suture située à l'extrémité de l'uretère. L'uretère doit se rétracter dans le corps de la vessie. Il est habituel d'observer l'urine se écoulant hors de l'ouverture dans la vessie, ce qui confirme la lumière de l'uretère ouverts.
- Fermez la sortie des plaies dans la vessie avec un polyamide suture monofilament 9 / O.
- Replacez soigneusement les intestins enla cavité péritonéale.
- Fournir des soins post-opératoire comme indiqué dans les étapes 4.1 à 4.8.
- Laisser la souris pour récupérer jusqu'à ce que le rein est décompressé, généralement sept jours.
- Au point de fin expérimentale, euthanasier la souris par dislocation cervicale et de recueillir les reins pour l'analyse histopathologique.
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Résultats
L'apparition des modifications rénales nettement suivante obstruction urétérale et il devient plus pâle et tendu à la palpation avec le temps (Figure 1). Il est de plus en plus la dilatation de l'urètre proximal à l'obstruction et le bassinet du rein. Le rein devient de plus en plus atrophique que la durée de néphropathie obstructive augmente avec obstruction prolongée entraîne un amincissement notable de la moelle et le cortex rénal. Après le renversement de l'obstruction de l'uretè...
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Discussion
L’obstruction du rein peut affecter les reins natifs ou transplantés et entraîner des lésions rénales et des cicatrices. Le modèle R-UUO est pertinent pour les maladies humaines, car les patients présentent souvent une obstruction des voies rénales secondaire à une hypertrophie de la prostate, des valves urétrales postérieures, etc., qui nécessite une décompression, les patients présentant généralement une insuffisance rénale résiduelle importante qui n’a pas d’options de traitement actuelles et peut éventuellement condu...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne ont pas des intérêts concurrents ou de divulguer contradictoires.
Remerciements
La présente étude a été financée par des subventions de Kidney Research UK (ST4/2011), du Cunningham Trust (CT11/14), du Mrs AE Hogg Charitable Trust for Kidney Research et du Renal Endowment Fund de la Royal Infirmary of Edinburgh.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Ciseaux de dissection émoussés | Outils de science fine | 14072-10 | |
| Ciseaux à ressort &ndash ; droits | Outils de science fine | 15000-10 | |
| Pince dentée | Outils de science fine | 11021-12 | |
| Pince coudée x 2 | Outils de science fine | 00649-11 | |
| Pince droite | Outils de science fine | 00632-11 | |
| Colibri Écarteur de fil de 3 cm | Fine Science Tools | 17000-03 | |
| Porte-aiguille Castroviejo avec serrure | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Applicateur de pince à enroulement | Fine Science Tools | 12031-07 | |
| Pinces de bobine de 7 mm | Fine Science Tools | 12032-07 | |
| Porte-micro-aiguille Castroviejo avec serrure | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| OPMI pico microscope | Carl Zeiss | S100 | |
| Heat électro pad | Cozee Comfort | n/a | |
| 6/O suture tressée en soie | Harvard Apparatus | 72-3287 | |
| 9/O Dafilon (polyamide) suture | B-Braun | G1111434 | |
| 5/O suture en soie tressée | Harvard Apparatus | 51-7680 | |
| Aiguille biseautée régulière, 1 pouce, 21G | Becton, Dickinson and Company | 305175 | |
| 1 ml d’embout de seringue | Becton, Dickinson and Company | 300184 | |
| Wypall Tampons en papier | Kimberley-Clark | L40 | Stérilisé (Autoclave) |
| Cotons-tiges | Johnson and Johnson | n/a | Stérilisé (Autoclave) |
| Champs unis | Guardian | CB03 | Tube |
| caoutchouc | Tube en silicone - diamètre intérieur 1,0 mm ; diamètre extérieur 2,0 mm ; épaisseur de paroi 0,6 mm | ||
| (Lacri-Lube) Paraffine douce blanche 57,3 %, huile minérale 42,5 % et alcools de lanoline 0,2 % | Allergan Ltd | 21956GB10X | |
| (Videne) Povidone iode 10 % | Ecolab Ltd | PL 04509/0041 | |
| (Vetalar V) Chlorhydrate de kétamine | Pfizer Animal Health | Vm 42058/4165 | 100mg/ml solution |
| (Domitor) Chlorhydrate de médétomidine | Orion Pharma | Vm 06043/4003 | 1mg/ml |
| (Vetergesic) Chlorhydrate de bupernorphine | Alsto Animal Health | Vm 00063/4002 | 0,3mg/ml |
| (Antisedan) Hydrochoride d’atipamézole | Orion Pharma | Vm 06043/4004 | 5mg/ml |
| (Adept) 4 % Icodextrin | Solution de réduction de l’adhérence | Baxter | |
| NaCl 0,9 % | Baxter | FKE1323 |
Références
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Réimpressions et autorisations
