Article de méthode

Un hydrogel construire et de fibrine-colle à base son approche et proposer Therapeutics dans un infarctus du myocarde murin modèle.

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DOI :

10.3791/52562

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14 juin 2015

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1Department of Bioengineering, University of Illinois at Urbana-Champaign

Dans cet article

Résumé

Ce protocole vise à atténuer la limitation de la mauvaise greffe cellulaire pour le traitement des infarctus du myocarde par cellules souches grâce à l’utilisation d’un système d’hydrogel et d’une colle à base de fibrine. Grâce à cette approche, le contact entre les cellules et les tissus après l’infarctus peut être maintenu, ce qui augmente le potentiel thérapeutique des agents bénéfiques sur le site de la lésion.

Résumé

Le modèle murin de l’IM est largement reconnu dans le domaine des maladies cardiovasculaires et a toujours été utilisé comme première étape pour tester l’efficacité des traitements in vivo1. Le protocole traditionnel et établi a été affiné pour minimiser les dommages causés à l’animal. Notamment, les couches du muscle pectoral sont arrachées plutôt que simplement coupées, et la thoracotomie est abordée de manière intercostale au lieu de casser les côtes lors d’une sternotomie, préservant ainsi l’intégrité de la cage thoracique. Avec ces changements, le stress global de l’animal est diminué.

Les thérapies à base de cellules souches visant à atténuer les dommages causés par les IM se sont révélées prometteuses au fil des ans pour leurs avantages pro-angiogéniques et anti-apoptotiques. Les approches actuelles de livraison de cellules à la surface du cœur impliquent généralement l’injection des cellules soit près du site endommagé, dans une artère coronaire ou dans le flux sanguin périphérique2-4. Bien qu’il se soit avéré que les cellules abritent le myocarde endommagé, leur fonctionnalité est limitée par leur mauvaise greffe sur le site de la lésion, ce qui entraîne une diffusion dans la circulation sanguine5. Ce manuscrit met en évidence une procédure qui permet de surmonter cet obstacle grâce à l’utilisation d’un patch d’hydrogel encapsulé dans des cellules. Le patch est fabriqué avant l’intervention chirurgicale et est placé sur le myocarde blessé immédiatement après l’occlusion de l’artère coronaire gauche. Pour faire adhérer le patch en place, de la colle de fibrine externe biocompatible est placée directement sur le patch, ce qui lui permet de sécher à la fois sur le patch et sur la surface du cœur. Cette approche fournit une nouvelle méthode d’adhésion pour l’application d’une construction thérapeutique délicate d’encapsulation cellulaire.

Introduction

Un infarctus du myocarde (IM) est défini comme l'interruption de sang à une région du cœur provoquée par l'occlusion d'une artère coronaire principale. Le dommage résultant d'un infarctus du myocarde est dû au remodelage du tissu cardiaque viable dans du tissu cicatriciel non fonctionnel, ce qui diminue la capacité du cœur ou, plus précisément, du ventricule gauche, à frapper correctement. Il en résulte une diminution du volume de sang qui peut être délivrée au corps avec chaque battement de coeur, connu sous le volume d'éjection systolique, et le pourcentage de sang qui est pompé hors du cœur avec chaque battement du coeur, dite fraction d'éjection 6. Ceux-ci, ainsi que d'autres fonctions diminué, augmente la pression sur le reste du cœur de maintenir une fonction adéquate. Souvent, cette souche accrue peut devenir si grave que cela provoque une deuxième crise cardiaque, un phénomène vu dans environ 10% des individus 7.

Bien que les pratiques médicales ont évolué pour traiterimmédiatement après un infarctus du myocarde, aucune technique a été développée pour arrêter, lente, ou inverser les effets secondaires négatifs de remodelage tissulaire. Thérapies par cellules souches ont émergé comme une avenue possible pour un tel traitement, cependant, en dépit de leur potentiel prometteur, les cellules souches ont pas fait ses preuves dans le cadre clinique. Une théorie pour leurs lacunes est l'incapacité à assurer que les cellules restent bénéfiques sur le site de l'infarctus assez longtemps pour générer des résultats favorables 5. Il a été démontré que pas plus de 24% des cellules qui sont simplement injecté dans le site de l'infarctus a survécu et est resté au endommagé le site un jour après l'accouchement 2. Une perspective possible pour aborder cette question de la rétention cellulaire est de développer des systèmes d'hydrogel biocompatibles qui encapsulent soit des cellules ou thérapeutiques, qui peuvent être livrés avec le site endommagé. L'hydrogel de choix dans ce protocole est un poly (éthylène glycol) diméthacrylate raison de son utilisation précédente dans l'encapsulation cellulaire procedures, cependant, toute hydrogel capable d'encapsulation peut être utilisé 8. La livraison de la pièce directement sur le site de la lésion assure un contact de cellule à tissu sur une longue période de temps, ce qui augmente la durée pendant laquelle les cellules peuvent fournir des facteurs bénéfiques pour le myocarde sous-jacent.

Un goulot d'étranglement à l'approche de patch est la difficulté d'adhérer le patch à la surface du cœur. De nombreux groupes ont surmonté ce à travers une variété de techniques, la plus répandue étant une suture simple de lier la construction à la surface du cœur 9,10. Cela a fait ses preuves dans un certain nombre de cas dans lesquels le produit de construction est fabriqué en un matériau plus rigide, mais échoue lorsque la tentative sur un système d'hydrogel, en raison de la concentration élevée en eau et de la nature fragile de la construction de patch. Pour surmonter cela, nous avons utilisé un système d'adhésif de la colle de fibrine externe qui imite la chimie de la formation de caillot. La colle de fibrine a été utilisé dans de nombreux cabinets médicaux, incLUDING larmes dura, fistules bronchiques, et la greffe de cornée, soulignant la biocompatibilité du produit comme un produit d'étanchéité de la plaie 11-13. En outre, la fibrine a été utilisé pour une variété de fins cardiaques, y compris le traitement chirurgical des ruptures ventriculaires gauche et pontages coronariens de l'artère, cependant, son utilisation comme colle d'adhérence pour un patch cardiaque n'a pas été couramment utilisé 14 à 17. Un simple formulation de thrombine et de fibrinogène se traduit par une colle biocompatible qui peut être placé directement sur l'extérieur d'une pièce cardiaque externe, en fournissant un système d'adhérence adéquate pour assurer patch pour interaction cardiaque.

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Protocole

La procédure est en pleine compatibilité avec le numéro de protocole IACUC 13302 et a été approuvé par la division des ressources animales.

1. Instrument Préparation

  1. Autoclave tous les instruments non jetables utilisés avant l'intervention chirurgicale pour assurer la stérilité.
  2. Stériliser les instruments utilisés plusieurs fois dans une session avec un stérilisateur à billes de verre entre les utilisations.

2. Préparation d'hydrogel

  1. Décongeler les cellules souches et de la plaque d'au moins 24 heures avant la création de la construction d'hydrogel.
  2. Préparer les correctifs un jour avant l'intervention chirurgicale en utilisant un appareil de stéréolithographie (ou un instrument similaire) qui a été décrit en détail dans les publications précédentes 8,18.
  3. Pour créer l'hydrogel, d'abord générer un design (CAD) modèle du patch désiré assistée par ordinateur et la conception exporter au format de stéréolithographie (STL).
  4. Créer une solution de pré-gel par dissolving de poly (éthylène glycol) diméthacrylate (PEGDMA) dans du PBS 1x stérile pour obtenir une solution à 20% p / v. En même temps, dissoudre le photoinitiateur 1- [4- (éthoxy-hydroxy-2) phényl] -2-hydroxy-2-méthyl-1-propane-1-one dans du DMSO. Ajouter le photo-initiateur à la solution finale à une PEGDMA en poids / volume de 0,5%. Directement avant réticulation, ajouter 100 ml de la densité souhaitée de cellules. Remarque: Une densité de cellules entre 2,0 x 10 5 -2,0 x 10 6 cellules / ml est recommandée.
  5. Introduire à la pipette la solution de pré-gel dans un plat au centre de la plate-forme SLA et exécuter le logiciel SLA avec la conception de la STL formaté précédemment téléchargée.
  6. Retirer les plaques de l'appareil et incuber les hydrogels O / N, dans Eagle modifié du milieu de Dulbecco (DMEM) supplémenté avec du sérum de 5% de fœtus bovin (FBS), 100 U / ml de pénicilline et 100 mg / ml de streptomycine afin de permettre pour les cellules à ajuster à l'environnement dans le patch.

3. Préparation des animaux et intubati oralessur

  1. Évaluer chaque souris avant la procédure pour assurer que l'animal est en bonne santé, tel que déterminé à partir de leurs habitudes de toilettage et les interactions avec leurs compagnons de cage. Note: 8-10 semaines vieilles souris C57BL / 6J femelles ont été utilisés pour cette procédure, cependant, tout âge de la souris ou de type peuvent être utilisés.
  2. Placez les animaux dans une chambre d'anesthésie et exposer à 5% isofluorane avec un 1 L / min 2 O soutien. Surveiller le niveau de l'anesthésie par pincement de l'orteil réflexe.
  3. Une fois que l'animal est correctement anesthésié, peser et de les placer sur le stand de l'intubation.
  4. Diriger une source de lumière vers la cavité thoracique de l'animal et utiliser une pince pour retirer la surface du larynx et d'exposer les cordes vocales. Guidez soigneusement un G angiocath 20 entre les cordes vocales, et insérer en douceur dans la trachée. Détecter l'insertion correcte par un mouvement mécanique de la cavité thoracique, une fois que le cathéter est raccordé au petit ventilateur animal.
  5. Réglez les paramètres de ventilation à THpoids e de l'animal sur la base des directives du fabricant.
  6. Une fois intubé, placer l'animal dans la position couchée sur un coussin chauffant pour prévenir l'hypothermie. Assurez-vous que le coussin chauffant ne dépasse pas 40 ° C. Si nécessaire, placer une barrière entre l'animal et le tampon de chauffage pour minimiser les risques de brûlures.
  7. Enlever les poils à partir du site chirurgical à travers l'utilisation d'une crème dépilatoire. Stériliser le site en 3 gommages alternées de bétadine et 75% d'éthanol pour assurer la stérilisation approprié. Placez un drap pour exposer tout le site chirurgical, et placez vétérinaire pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse au cours de la procédure.

4. Procédure chirurgicale

  1. La thoracotomie est réalisée sur le côté gauche de l'animal, par conséquent, faire une incision de la peau d'environ 1 cm à gauche du sternum, qui court le long du sternum.
  2. Utiliser des pinces pour séparer la couche musculaire sous-jacent à partir de la cage thoracique en deux étapes. Observer un delineligne d'exploita- qui représente les principaux muscles pectoraux de l'animal. Soulevez légèrement ce muscle, le séparer du muscle oblique externe sous-jacente et se rétracter en dedans. Ensuite, libérer le muscle oblique externe de la cage thoracique sous-jacente de la même manière, et rétracter latéralement, fournissant une vue dégagée de la deuxième, troisième, et quatrième nervures.
  3. Effectuez la thoracotomie entre les troisième et quatrième côtes. Soulevez doucement la quatrième côte et utiliser un cauterizer pour ouvrir la cavité thoracique entre les troisième et quatrième côtes. Placez rétracteurs à ouvrir davantage la cavité et d'exposer le coeur.
  4. Utilisez une pince à rompre le mince péricarde du cœur.
  5. Ligaturer l'artère coronaire gauche avec une suture en nylon monofilament 8-0. Placer la suture d'environ 4 mm de la pointe du cœur, directement au-dessous de l'extrémité inférieure de l'oreillette gauche. Déterminer le placement de suture appropriée par un blanchiment du myocarde ventriculaire et une augmentation de la taille de l'oreillette gauche après la suture a été liée.

5. Patch placement et de colle

  1. Gardez correctifs à 37 ° C et 5% de CO 2 conditions jusqu'à utilisation.
  2. Soulevez doucement le patch en utilisant une spatule indéterminée plat et placer doucement sur la surface du cœur, sur le site de l'infarctus.
    Remarque: Pour éviter de glisser hors du ventricule gauche, le patch peut être maintenu en place par le maintien de la légère contact en utilisant soit la spatule ou la pointe d'une paire de pinces.
  3. Préparer la colle en mélangeant un ratio de 4: 1 du fibrinogène à la thrombine. Mélanger la solution par pipetage répété jusqu'à ce qu'il commence à épaissir, habituellement dans 1 min après le début de la préparation.
  4. Une fois que la viscosité de la solution atteigne le niveau désiré, transférer rapidement d'environ 10 ml à la surface du patch. Remarque: Le temps de coagulation de la colle de fibrine est rapide, fournissant une petite fenêtre d'opportunité pour un transfert efficace de la colle.

6. Suture

  1. Effectuer toutes les sutures de fermeture en utilisant une suture en nylon 6-0 monofilament.
  2. Fermez la couche de nervure trois à quatre points de suture séparés individuels.
  3. Avant la fermeture complète de la couche intercostal, insérer une canule PE-10 dans l'incision à évacuer la cavité de la poitrine après la fermeture est complète et rétablir la pression intrapleurale correspondant.
  4. Fermez les muscles pectoraux trois à quatre points de suture séparés individuels.
  5. Sceller la couche de la peau avec une suture continue.
  6. Suite à la fermeture complète, fixer une seringue de 1,0 ml à l'extrémité de la canule et l'utiliser pour évacuer la cavité thoracique.
  7. Appliquer un adhésif tissulaire au site d'incision à renforcer le site de suture.

7. Traitement post-opératoire

  1. Envoyer des souris une injection de buprénorphine (0,05-1,0 mg / kg) et le carprofène (2,2 mg / kg) par voie sous- cutanée immédiatement après la ligature coronaire et moins 20 min avant le réveil. Administrer deux médicaments 6-8 h après la chirurgie, Et ensuite donner deux fois par jour pour un maximum de trois jours pour contrôler la douleur et la détresse.
  2. Surveiller en permanence les animaux jusqu'à conscient et toutes les heures pour la première 4 heures après la chirurgie. Effectuer un deuxième bilan de la nuit de la chirurgie (2-4 heures plus tard) d'administrer une deuxième dose d'analgésique.
  3. Surveiller les animaux tous les jours après le deuxième jour suivant la procédure, jusqu'à ce que les animaux semblent stables.

8. Analyse de la fonction cardiaque et histologie

  1. Effectuer Échocardiographes sur les souris 4 semaines après la procédure afin de déterminer l'étendue des dommages suite à la MI.
  2. Anesthésier la souris avec 4-5% d'isoflurane dans une chambre pour l'induction de l'anesthésie anesthésie par inhalation, puis 2% d'isoflurane au masque pour entretien de l'anesthésie.
  3. Dégagez la zone d'imagerie avec une crème dépilatoire et utiliser un petit échographie animale pour obtenir un balayage de l'échocardiographie 2D M-mode du coeur battant et enregistrer des paramètres asso fonctionnelleciées avec elle.
  4. Euthanasier les souris dans une chambre de dioxyde de carbone, puis recueillir les coeurs des animaux et les placer dans une solution de formol à 10% pendant 24 heures. Après 24 heures, transférer les cœurs à 70% d'éthanol et de garder à 4 ° C jusqu'à ce que le traitement des tissus.
  5. Traiter les cœurs et les intégrer dans des blocs de paraffine.
  6. Coupez 5 mm articles à travers la région ventriculaire du coeur, à partir de la pointe et se terminant à l'atrium.
  7. Stain tranches avec deux trichrome et hématoxyline Masson et aux taches de éosine utilisant des protocoles standards sectionné.

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Résultats

Au cours de l'intervention chirurgicale, la ligature de l'artère coronaire gauche peut être identifié par un net blanchiment en aval de l'artère occluse. Comme un test avant d'attacher le noeud, la suture peut être serré brièvement pour vérifier si elle est à l'endroit approprié. En outre, étant donné que l'occlusion de l'artère résultats dans presque instantanée diminution de la capacité de l'oreillette gauche à battre correctement, l'oreillette gauche va agrandir en réponse à un ref...

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Discussion

Avec cette approche pour le modèle MI murin, nous avons développé un système qui minimise les dommages aux zones non-myocarde qui sont associés à d'autres techniques MI murins. Ces domaines comprennent les dommages causés par une trachéotomie, la coupe de la couche musculaire et la rupture des nervures afin d'exposer la cavité de la poitrine. Nous croyons que ces changements améliorent les résultats globaux chirurgicales grâce au soin apporté à garder autan...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Ce travail a été financé par Grant US Army (W81XWH-08-1-0701) et une bourse de recherche de l'Hôpital Carle Fondation.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Ventilateur de souris Harvard modèle 687Appareil Harvard55-0001
Inintech Biosciences LLC Stérilisateur de billes de verre secFisher ScientificNC9531961
Microscope chirurgical Leica MZ6
Gemini GEM 5917
Pince délicate - Pointes de 0,4 mmscientifiquesfins inclinés11063-07
Écarteur Agricola - 3,5 cm SpreadFine Science Tools17005-04
Ciseaux à ressort - Lames droites de 2,5 mmFine Science Tools15000-08
Castroviejo Porte-aiguille - w/Lock Carbure de tungstène 14 cmFine Science Tools12565-14
Ciseaux à iris - Délicat Droit 10,5 cmFine Science Tools14060-10
Suture monofilament 8-0Ethicon8730P
Suture 6-0 SoieEthicon639G
ThrombinSigmaT7009
FibrinogèneSigmaF3879
Vetbond Adhésif Tissulaire3M1469SB
Kit de cautère Leica Outils

Références

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