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Article de méthode

Lymphocytes Isolation de la peau humaine pour Analyse phénotypique et

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DOI :

10.3791/52564

⸱

8 avril 2016

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Medical Immunology, Department of Laboratory Medicine, Radboud University Medical Centre, 2Department of Dermatology, Radboud University Medical Centre

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons un protocole permettant d’isoler efficacement les lymphocytes T résidents de la peau à partir de biopsies de peau humaine. Ce protocole produit un nombre suffisant de lymphocytes résidents de la peau humaine viables pour l’analyse cytométrique en flux et la culture ex vivo.

Résumé

La peau humaine a une fonction de barrière importante et contient diverses cellules du système immunitaire qui contribuent à l'homéostasie tissulaire et la protection contre les agents pathogènes. Comme la peau est relativement facile d'accès, il offre une plateforme idéale pour étudier les mécanismes de régulation immunitaire périphériques. cellules résidentes immunitaire en bonne santé conduite de la peau immunosurveillance, mais aussi jouer un rôle important dans le développement des troubles inflammatoires de la peau, comme le psoriasis. En dépit des idées émergentes, notre compréhension de la biologie sous-jacente diverses maladies de peau inflammatoire est encore limitée. Il est nécessaire pour les populations (unique) de cellules isolées de bonne qualité à partir d'échantillons de biopsie de la peau. Jusqu'à présent, les procédures d'isolement ont été gravement entravées par l'absence d'obtention d'un nombre suffisant de cellules viables. L'isolement et l'analyse subséquente ont également été affectés par la perte des marqueurs de la lignée de cellules immunitaires, en raison de la contrainte mécanique et chimique provoquée par les procédés actuels de dissociation pour obtenirsuspension cellulaire unique. Ici, nous décrivons une méthode modifiée pour isoler les cellules de la peau humaine saine et psoriatique impliquée T en combinant la dissociation mécanique de la peau en utilisant un dissociateur tissulaire automatisé et le traitement par la collagénase. Cette méthode conserve l'expression de la plupart des marqueurs de la lignée immunes telles que CD4, CD8, et Foxp3 CD11c lors de la préparation des suspensions de cellules isolées. Des exemples d'isolement réussi CD4 + des lymphocytes T et phénotypiques ultérieure et analyse fonctionnelle sont montrées.

Introduction

La peau, comme la principale interface entre le corps et l'environnement, fournit la première ligne de défense contre physique externe, chimiques et biologiques des insultes telles que la blessure, le rayonnement ultraviolet et les micro-organismes. La peau se compose de deux compartiments, l'épiderme et le derme, et contient une variété de cellules immunitaires , y compris les cellules de Langerhans, les macrophages, les cellules dendritiques (DCs), et environ 20 milliards de cellules T mémoire, près de deux fois le nombre présent dans l'ensemble du volume sanguin 1 , 2. Un nombre croissant de données soutient l'idée que la peau a des fonctions immunologiques essentielles, à la fois lors de l'homéostasie tissulaire et dans diverses conditions pathologiques. Les cellules immunitaires résidentes dans la peau normale sont pensés pour mener immunosurveillance 3 et ont été montré à jouer un rôle dans le développement de troubles inflammatoires tels que le psoriasis 4. Dans la peau lésionnelle psoriasique, CD4 + et CD8 + infiltrés cellules T étaient obsdé- laissées , et on a montré que le rapport entre le CD4 et CD8 varie en fonction de l'état de la maladie 5. Cependant, ces populations de cellules sont difficiles à étudier parce que les techniques existantes permettent l'isolement des seules cellules rares.

Les techniques actuellement largement utilisées pour l'isolement de la peau humaine des cellules T combinent mécanique dissociation de la peau avec un traitement enzymatique. Les biopsies de peau humaine sont largement émincées et incubées avec des enzymes comme la trypsine, la collagénase et / ou EDTA 6-8. Considérant que la peau est un tissu de la barrière qui est très résistant aux efforts de traction et de désagrégation mécanique, les méthodes établies d'isolement des cellules T produisent très peu de cellules, et même un nombre plus faible de cellules viables, ce qui rend culture ex vivo de cellules de ces populations cellulaires difficile et difficile.

Nous rapportons ici une méthode modifiée pour isoler les lymphocytes de la peau humaine psoriasique sain et impliqué en combinant mechanla dissociation ique de la peau en utilisant un dissociateur tissulaire automatisé au lieu de la méthode établie de hachage largement, avec une digestion enzymatique à l'aide de la collagénase. Divers sous-ensembles de cellules immunitaires viables, y compris les DC et les lymphocytes T ont été observées après la préparation d'une suspension à cellule unique. Il est important de l'expression des marqueurs de surface CD3, CD4 et CD8 a été bien conservée. Les cellules ainsi préparées sont prêts à être utilisés ex vivo dans des cultures cellulaires ou par cytométrie de flux. Ce protocole a été utilisé avec succès pour l'analyse de biopsies cutanées unique (4 mm) dérivées de la peau lésionnelle des patients atteints de psoriasis. Les résultats ont montré que les cellules T du patient de la peau résidente produites cytokines plus inflammatoires comme l' IL-17 et d' IFNy par rapport aux volontaires sains 9.

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Protocole

NOTE: Les biopsies cutanées provenant d'individus sains ont été obtenus à partir des restes de l'abdomen de la peau des individus subissant une chirurgie plastique facultative après accord oral ou écrit éclairé à usage scientifique. L'utilisation de la peau humaine a été approuvé et en conformité avec les règlements établis par les comités d'éthique médicale pour la recherche humaine du centre médical universitaire Radboud, Nijmegen, aux Pays-Bas et de l'Université d'Essen, en Allemagne.

1. Préparation de la cellule unique Suspensions de la peau humaine (travail stérile dans un flux d'armoire si la suite Culture cellulaire est requis)

  1. Préparer un milieu de culture cellulaire: RPMI 1640 + pénicilline / streptomycine (concentrations finales de 100 unités / ml et 100 pg / ml, respectivement) + pyruvate (0,02 mM) et du glutamax (0,02 mM), sans sérum ajouté.
  2. Préparer le milieu de culture complet: milieu de culture préparé à l'étape 1.1 + 10% de sérum humain rassemblé (HPS); stocker à 4 ° C. Apportez moyenne à 20 ° C ± 2 devant nousing.
  3. Obtenir la biopsie de la peau à l'aide d'un instrument de biopsie de poinçon rond 4mm et le garder dans RPMI1640 milieu de culture complet à 20 ° C ± 2 pour un maximum de 4 heures ou à 4 ° C ON. Traiter la biopsie dès que possible après leur arrivée au laboratoire.
    REMARQUE: un stockage prolongé de la peau aura une influence sur le rendement de la cellule et la viabilité des cellules.
  4. Etiqueter un tube de dissociation bleu-capped et ajoutez 5 ml de milieu de culture complet dans le tube étiqueté.
  5. Ajouter 2 ml de milieu de culture complet dans chaque puits (au total 3 puits) d'un 6 puits plaque de culture stérile. Utiliser des outils stériles pour placer la biopsie dans un seul puits, rincer, le déplacer vers un second puits et répétez cette étape une fois de plus, réalisant ainsi un total de trois rinçages.
  6. Transférez la biopsie bien rincés de la peau à une boîte de Petri stérile, ajouter 100 ul de milieu de culture complet sur le dessus de la biopsie, et soigneusement gratter le tissu adipeux sous-cutané à l'aide d'un scalpel stérile jetable en acier inoxydable.
    NOTE: Thest est une étape critique.
  7. Couper chaque biopsie de la peau en 4 morceaux plus petits sur une boîte de Pétri stérile. Des échantillons de transfert (jusqu'à quatre biopsies de 4 mm par tube) dans le tube de dissociation préparée contenant 5 ml de milieu de culture complet.
  8. Bien refermer les tubes avec le bouchon, et fixer la tête en bas sur le manchon du dissociateur de tissu automatisé. Assurez-vous que tout le matériau d'échantillon est situé dans la zone du rotor.
  9. Démarrer le processus de dissociation en exécutant le "_01 programme m_spleen" (un programme prédéfini fourni par la mémoire interne de l'instrument ou par la carte de programme accompagné) de dissocier la biopsie à la vitesse de rotation appropriée pour 56 sec.
  10. Après le traitement, détacher le tube de dissociation de la dissociateur et assurez-vous que tout le matériel dissocié est recueilli au fond du tube.
  11. Ajouter 150 ul collagénase IA (80 mg / ml) dans le tube de dissociation et incuber l'échantillon dans un bain d'eau agité à 37° C pendant 60 min. Ajouter 100 ul de DNase I (5 MU / ml) dans le tube de thedissociation, bien mélanger.
    Remarque: Une plus forte concentration de la collagénase ou de plus longue durée d'incubation va modifier la viabilité cellulaire.
  12. Fixez le tube de dissociation au manchon du dissociateur de tissu automatisé et exécuter le programme "m_ rate _01" de dissocier la biopsie une fois de plus.
  13. Placer une cellule de nylon tamis de 70 pm sur la partie supérieure d'un tube Falcon de 50 ml. Appliquer des matériaux d'échantillons dissociées à ce tamis cellulaire pour éliminer les amas de cellules / débris de tissu.
  14. Laver tamis cellulaire une fois avec 5 ml de milieu de culture complet. Centrifuger à 20 ° C ± 2 450 g pendant 10 min et le surnageant aspiré.
  15. Répétez l'étape de lavage une fois de plus. Remettre en suspension les culots de cellules dans 300 ul de milieu de culture complet. Les suspensions de cellules uniques sont prêts pour une analyse plus approfondie; poursuivre avec les protocoles de culture ex vivo de cellules ou une analyse par cytométrie en flux.
  16. En cas de nouvelle intracellular coloration des cytokines, stimulent les cellules avec du PMA (12,5 ng / ml), de l' ionomycine (500 ng / ml) et Brefeldine A (5 ug / ml) pendant 4 heures à 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur pendant 4 heures avant de procéder à l' écoulement analyse cytométrie.

2. polyclonaux Activation des cellules T de la peau-résident (Ex Vivo culture cellulaire)

  1. Aliquote de 100 ul suspensions unicellulaires (préparé à l'étape 1.15) dans une plaque à fond rond de 96 puits.
    NOTE: Pour chacun de 4 mm biopsie de la peau, les suspensions monocellulaires acquises peuvent être divisées en au moins deux puits d'une plaque de 96 puits.
  2. Ajouter des microbilles anti-CD28 anti-CD3 / Acm revêtues (25.000 billes par puits), une cytokine recombinante humaine rIL-2 (concentration finale de 25 U / ml) et de la rIL-1 ß (concentration finale de 50 ng / ml).
  3. Couvrir la plaque de culture avec un couvercle de plaque bien marqué, incuber dans 5% de CO 2, 100% d' humidité, 37 ° C incubateur. Changer le milieu lorsque la couleur moyenne devient jaune.
    NOTE: Une colonie de cellules claires peut être observée à partir du jour 8 de culture cellulaire.

3. Analyse de cytométrie en flux de primaire / Cultured cellules de la peau-résident T

  1. Préparer un tampon FACS: PBS + 0,2% de BSA.
  2. Transfert des cellules d'intérêt dans une plaque à 96 puits à fond en V. Centrifuger à 20 ° C ± 2, 450 g pendant 2 min, et aspirer le surnageant.
  3. Remettre en suspension le culot dans 100 pl de PBS. Centrifuger à 20 ° C ± 2, 450 g pendant 2 min, et aspirer le surnageant.
  4. cellules Stain avec 100 pi de eFluorescence780 préparés conjugués colorant de viabilité fixable (1: 1000 dilution en utilisant PBS) à 4 ° C pendant 30 min. Ajouter 100 pi de tampon FACS, centrifuger à 20 ° C ± 2, 450 g pendant 2 min, et aspirer le surnageant.
  5. Sélectionner requises mAb marqueurs de surface cellulaire, par exemple: CD45-BV421 (HI30, 01:20), CD3-DJE (UCHT1, 01:50), CD4 PC5.5 (1388,2, 1: 200), CD8-APC AlexFluo700 (B9.11, 1: 400), CD14-FITC (TUK4, 01h50), CD19-APC-AlexFluo750 (13-1191:50), CD56-PE (MEM-188, 1:50), CD25-PeCy7 (BC96, 01h50), CD11c-PeCy7 (BU15, 1:10), et CD1c-APC (AD5-8E7, 01:10), préparer le mélange en utilisant des mAb-tampon FACS en fonction de chaque facteur de dilution du mAb testés. Définir les paramètres de grille en utilisant le contrôle d'isotype d'anticorps avec l'échantillon non-tache.
  6. Ajouter 25 ul de prêt mAb-mélange dans chaque puits. Incuber 20 min à 20 ° C ± 2, protéger de la lumière.
  7. Ajouter 100 pi de tampon FACS, centrifuger à 20 ° C ± 2, 450 g pendant 2 min, et aspirer le surnageant.
  8. Pour les échantillons qui ne nécessitent que la surface cellulaire coloration, passez à l'étape 3.16.
  9. En cas de coloration intra-cellulaire de Foxp3:
    1. Préparer un tampon de fixation et de perméabilisation en mélangeant une partie de concentré avec 3 parties de diluants.
    2. Préparer le tampon de perméabilisation 1x: 1 partie de 10x perméabilisation tampon + 9 parties de H 2 O. stérilisée
  10. Granulés Remettre en suspension dans 100 pi de fixation et permeabilitampon portant, bien mélanger, et incuber à 4 ° C pendant 30 min.
  11. Ajouter 100 tampon de perméabilisation ul à chaque puits, centrifuger à 450 xg à température ambiante pendant 2 min, et aspirer le surnageant.
  12. Laver les cellules avec perméabilisation tampon une fois de plus.
  13. Sélectionnez mAb intracellulaires nécessaires, par exemple, Foxp3-eFluo450 (PCH101, 1h50), IL-17A-AlexFluo488 (eBio64DEC1, 01:50) et IFNy PeCy7 (4S.B3, 1: 400). Préparer le mélange mAb en utilisant un tampon de perméabilisation contenant 2% de sérum de rat normal en fonction de chaque facteur de dilution du mAb testés. Définir les paramètres de grille en utilisant le contrôle d'isotype d'anticorps avec l'échantillon non-tache.
  14. Ajouter 20 pi de prêt mAb-mélange dans chaque puits. Incuber à 4 ° C pendant 30 min, protéger de la lumière.
  15. Au bout de 30 minutes d'incubation, ajouter 100 ul de tampon de perméabilisation dans chaque puits. Centrifuger à 20 ° C ± 2, 450 g pendant 2 min, et aspirer le surnageant.
  16. Laver les cellules avec perméabilisation buffer une fois de plus. Remettre en suspension le culot dans 110 pl de tampon FACS, et des suspensions de cellules de transfert dans microFACS tube.
    NOTE: L'échantillon est prêt pour la mesure en utilisant 10 couleurs cytométrie en flux.
  17. Dans le cas du nombre de cellules exacte nécessaire, ajouter 10 pl de suspension uniforme bien mélangée de fluorosphères dans chaque échantillon immédiatement avant d'effectuer des mesures par cytométrie en flux.

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Résultats

Le protocole présenté ici donnera entre 2.200 ± 615 (moyenne ± SEM, la peau des volontaires en bonne santé) jusqu'à 178.000 ± 760 (moyenne ± SEM, la peau lésionnelle de patients atteints de psoriasis) lymphocytes viables de la peau humaine lors de l'utilisation d'un seul 4 mm biopsie de la peau.

Différents types de CD45 + cellules ont été identifiées dans une seule cellule suspensions dérivées de la peau des individus en bonne santé , y compris les lymphocytes T CD4

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Discussion

Ici, nous présentons un protocole pour isoler efficacement les cellules T résidentes de la peau à partir de biopsies de peau humaine. L'avantage de ce protocole est l'isolement d'un nombre relativement élevé de lymphocytes viables, et l'expression des marqueurs de surface appropriés. Les sous - ensembles de cellules identifiées sont:, les cellules CD11c + PED CD4 + et CD8 + et Foxp3 + CD25 +. Surtout, culture ex vivo des lymphocytes T isolés...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les biopsies cutanées de patients atteints de psoriasis ont été aimablement fournies par le Dr Andreas Koerber (département de dermatologie à l'Université d'Essen, Allemagne) après accord oral ou écrit éclairé à usage scientifique.

XH est également soutenu par NSFC 61263039 et 11101321 NSFC.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Poinçon de biopsie jetableKai EuropeBP-40F4 mm
Scalpels stériles jetablesDalhausen1100000510
douxTube MACS CMiltenyi Biotech130-093-237Capuchon bleu, utilisé comme tube de dissociation.
gentleDissociateur MACSMiltenyi Biotech130-093-235Dissociateur tissulaire automatisé. Utilisation du « programme spleen_01 » pour la dissociation de la biopsie cutanée.
Passoire à cellules  ;BD35235070 et micro ; m nylon
96 puits Plaque à fond en UGreiner Bio-One650180
RPMI 1640Life Technologies22409-015
Pyruvate de sodiumLife Technologies11360-039
GlutaMAXLife Technologies35050-061
Pénicilline/StreptomycineLife Technologies15140-122
Humain Sérum regroupé (HPS)
ISigma-AldrichC2674Type 1-A, adapté à la culture cellulaire
DNase ICalbiochem260913
PBSB Braun3623140
BSASigma-AldrichA4503-500G
Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780eBioscience65-0865-18Stader les cellules mortes avant la fixation cellulaire ; diluer avec du PBS à 1:1 000
Concentré de fixation/perméabilisationeBioscience00-5123-43
Diluant de fixation/perméabilisationeBioscience00-5223-56
Tampon de perméabilisation (10x)eBioscience00-8333-56
BV421 Clone de 563879 CD45 BD anti-humain: HI30 ; facteur de dilution 1:50
FITC Souris anti-humaine CD14DakoT0844Clone : TUK4 ; facteur de dilution 1:50
PE Souris anti-humaine CD56DakoR7127Clone : MOC-1 ; facteur de dilution 1:50
ECD Souris anti-humaine CD3Beckman - CoulterA07748Clone : UCHT1 ; facteur de dilution 1:50 pour la coloration de surface ; facteur de dilution 1:25 pour la coloration intracellulaire.
PC5.5 Souris anti-humaine CD4Beckman - CoulterB16491Clone : 13B8.2 ; facteur de dilution 1:200
PeCy7 Souris anti-humaine CD11cBeckman - CoulterA80249Clone : BU15 ; facteur de dilution 1:50
APC Souris anti-humaine CD1cMiltenyi Biotech130-090-903Clone : AD5-8E7 ; facteur de dilution 1:10
APC-AlexFluo700 Souris anti-humaine CD8Beckman - CoulterA66332Clone : B9.11 ; facteur de dilution 1:400
APC-AlexFluo750 Souris anti-humaine CD19Beckman - CoulterA94681Clone : J3-119 ; facteur de dilution 1:50
PeCy7 Souris anti-humaine CD25eBioscienceAD5-8E7Clone : BC96 ; facteur de dilution 1:50
PE Rat anti-humain CLAMiltenyi Biotech130-091-635clone : HECA-452 ; facteur de dilution 1 :
eFluo450 Rat anti-humain Foxp3eBIoscience48-4776-42Clone : PCH101 ; coloration intracellulaire ; facteur de dilution 1:50
AlexFluo488 Souris anti-human IL-17AeBioscience53-7179-42Clone : eBio64DEC17 ; coloration intracellulaire ; facteur de dilution 1:50
PeCy7 Souris anti-humaine IFNgeBioscience25-7319-41Clone : 4S. B3 ; coloration intracellulaire ; facteur de dilution 1:400
Flow-Count FluorospheresBeckman - Coulter7547053Billes de comptage, pour cytométrie en flux
Collagénase

Références

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  13. Hybbinette, S., Bostrom, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental dermatology. 8, 30-38 (1999).
  14. Hennino, A., et al. Skin-infiltrating CD8+ T cells initiate atopic dermatitis lesions. J Immunol. 178, 5571-5577 (2007).

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Réimpressions et autorisations

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