Nous décrivons un protocole permettant d’isoler efficacement les lymphocytes T résidents de la peau à partir de biopsies de peau humaine. Ce protocole produit un nombre suffisant de lymphocytes résidents de la peau humaine viables pour l’analyse cytométrique en flux et la culture ex vivo.
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Article de méthode
Lymphocytes Isolation de la peau humaine pour Analyse phénotypique et
Dans cet article
Résumé
Résumé
La peau humaine a une fonction de barrière importante et contient diverses cellules du système immunitaire qui contribuent à l'homéostasie tissulaire et la protection contre les agents pathogènes. Comme la peau est relativement facile d'accès, il offre une plateforme idéale pour étudier les mécanismes de régulation immunitaire périphériques. cellules résidentes immunitaire en bonne santé conduite de la peau immunosurveillance, mais aussi jouer un rôle important dans le développement des troubles inflammatoires de la peau, comme le psoriasis. En dépit des idées émergentes, notre compréhension de la biologie sous-jacente diverses maladies de peau inflammatoire est encore limitée. Il est nécessaire pour les populations (unique) de cellules isolées de bonne qualité à partir d'échantillons de biopsie de la peau. Jusqu'à présent, les procédures d'isolement ont été gravement entravées par l'absence d'obtention d'un nombre suffisant de cellules viables. L'isolement et l'analyse subséquente ont également été affectés par la perte des marqueurs de la lignée de cellules immunitaires, en raison de la contrainte mécanique et chimique provoquée par les procédés actuels de dissociation pour obtenirsuspension cellulaire unique. Ici, nous décrivons une méthode modifiée pour isoler les cellules de la peau humaine saine et psoriatique impliquée T en combinant la dissociation mécanique de la peau en utilisant un dissociateur tissulaire automatisé et le traitement par la collagénase. Cette méthode conserve l'expression de la plupart des marqueurs de la lignée immunes telles que CD4, CD8, et Foxp3 CD11c lors de la préparation des suspensions de cellules isolées. Des exemples d'isolement réussi CD4 + des lymphocytes T et phénotypiques ultérieure et analyse fonctionnelle sont montrées.
Introduction
La peau, comme la principale interface entre le corps et l'environnement, fournit la première ligne de défense contre physique externe, chimiques et biologiques des insultes telles que la blessure, le rayonnement ultraviolet et les micro-organismes. La peau se compose de deux compartiments, l'épiderme et le derme, et contient une variété de cellules immunitaires , y compris les cellules de Langerhans, les macrophages, les cellules dendritiques (DCs), et environ 20 milliards de cellules T mémoire, près de deux fois le nombre présent dans l'ensemble du volume sanguin 1 , 2. Un nombre croissant de données soutient l'idée que la peau a des fonc....
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Protocole
NOTE: Les biopsies cutanées provenant d'individus sains ont été obtenus à partir des restes de l'abdomen de la peau des individus subissant une chirurgie plastique facultative après accord oral ou écrit éclairé à usage scientifique. L'utilisation de la peau humaine a été approuvé et en conformité avec les règlements établis par les comités d'éthique médicale pour la recherche humaine du centre médical universitaire Radboud, Nijmegen, aux Pays-Bas et de l'Université d'Essen, en Allemagne.
1. Préparation de la cellule unique Suspensions de la peau humaine (travail stérile dans un flux d'armoire si la suite Culture ....
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Résultats
Le protocole présenté ici donnera entre 2.200 ± 615 (moyenne ± SEM, la peau des volontaires en bonne santé) jusqu'à 178.000 ± 760 (moyenne ± SEM, la peau lésionnelle de patients atteints de psoriasis) lymphocytes viables de la peau humaine lors de l'utilisation d'un seul 4 mm biopsie de la peau.
Différents types de CD45 + cellules ont été identifiées dans une seule cellule suspensions dérivées de la peau des individus en bonne santé , y compris les lymphocytes T CD4
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Discussion
Ici, nous présentons un protocole pour isoler efficacement les cellules T résidentes de la peau à partir de biopsies de peau humaine. L'avantage de ce protocole est l'isolement d'un nombre relativement élevé de lymphocytes viables, et l'expression des marqueurs de surface appropriés. Les sous - ensembles de cellules identifiées sont:, les cellules CD11c + PED CD4 + et CD8 + et Foxp3 + CD25 +. Surtout, culture ex vivo des lymphocytes T isolés.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les biopsies cutanées de patients atteints de psoriasis ont été aimablement fournies par le Dr Andreas Koerber (département de dermatologie à l'Université d'Essen, Allemagne) après accord oral ou écrit éclairé à usage scientifique.
XH est également soutenu par NSFC 61263039 et 11101321 NSFC.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Poinçon de biopsie jetable | Kai Europe | BP-40F | 4 mm |
| Scalpels stériles jetables | Dalhausen | 1100000510 | |
| douxTube MACS C | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | Capuchon bleu, utilisé comme tube de dissociation. |
| gentleDissociateur MACS | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Dissociateur tissulaire automatisé. Utilisation du « programme spleen_01 » pour la dissociation de la biopsie cutanée. |
| Passoire à cellules ; | BD | 352350 | 70 et micro ; m nylon |
| 96 puits Plaque à fond en U | Greiner Bio-One | 650180 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 22409-015 | |
| Pyruvate de sodium | Life Technologies | 11360-039 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| Pénicilline/Streptomycine | Life Technologies | 15140-122 | |
| Humain Sérum regroupé (HPS) | |||
| I | Sigma-Aldrich | C2674 | Type 1-A, adapté à la culture cellulaire |
| DNase I | Calbiochem | 260913 | |
| PBS | B Braun | 3623140 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503-500G | |
| Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780 | eBioscience | 65-0865-18 | Stader les cellules mortes avant la fixation cellulaire ; diluer avec du PBS à 1:1 000 |
| Concentré de fixation/perméabilisation | eBioscience | 00-5123-43 | |
| Diluant de fixation/perméabilisation | eBioscience | 00-5223-56 | |
| Tampon de perméabilisation (10x) | eBioscience | 00-8333-56 | |
| BV421 Clone de 563879 CD45 BD anti-humain | : HI30 ; facteur de dilution 1:50 | ||
| FITC Souris anti-humaine CD14 | Dako | T0844 | Clone : TUK4 ; facteur de dilution 1:50 |
| PE Souris anti-humaine CD56 | Dako | R7127 | Clone : MOC-1 ; facteur de dilution 1:50 |
| ECD Souris anti-humaine CD3 | Beckman - Coulter | A07748 | Clone : UCHT1 ; facteur de dilution 1:50 pour la coloration de surface ; facteur de dilution 1:25 pour la coloration intracellulaire. |
| PC5.5 Souris anti-humaine CD4 | Beckman - Coulter | B16491 | Clone : 13B8.2 ; facteur de dilution 1:200 |
| PeCy7 Souris anti-humaine CD11c | Beckman - Coulter | A80249 | Clone : BU15 ; facteur de dilution 1:50 |
| APC Souris anti-humaine CD1c | Miltenyi Biotech | 130-090-903 | Clone : AD5-8E7 ; facteur de dilution 1:10 |
| APC-AlexFluo700 Souris anti-humaine CD8 | Beckman - Coulter | A66332 | Clone : B9.11 ; facteur de dilution 1:400 |
| APC-AlexFluo750 Souris anti-humaine CD19 | Beckman - Coulter | A94681 | Clone : J3-119 ; facteur de dilution 1:50 |
| PeCy7 Souris anti-humaine CD25 | eBioscience | AD5-8E7 | Clone : BC96 ; facteur de dilution 1:50 |
| PE Rat anti-humain CLA | Miltenyi Biotech | 130-091-635 | clone : HECA-452 ; facteur de dilution 1 : |
| eFluo450 Rat anti-humain Foxp3 | eBIoscience | 48-4776-42 | Clone : PCH101 ; coloration intracellulaire ; facteur de dilution 1:50 |
| AlexFluo488 Souris anti-human IL-17A | eBioscience | 53-7179-42 | Clone : eBio64DEC17 ; coloration intracellulaire ; facteur de dilution 1:50 |
| PeCy7 Souris anti-humaine IFNg | eBioscience | 25-7319-41 | Clone : 4S. B3 ; coloration intracellulaire ; facteur de dilution 1:400 |
| Flow-Count Fluorospheres | Beckman - Coulter | 7547053 | Billes de comptage, pour cytométrie en flux |
Références
- Clark, R. A., et al. The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin. J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).
- Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. Normal human dermis contains ....
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Réimpressions et autorisations
