Article de méthode

Conception, Traitement de surface, Cellulaire Placage et culture des réseaux neuronaux modulaires Composé de circuits Fonctionnellement Inter-connectées

DOI :

10.3791/52572

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15 avril 2015

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1Department of Neurobiology, George S. Wise Faculty of Life Sciences, Tel-Aviv University, 2Department of Neuroscience and Brain Technologies, Istituto Italiano di Tecnologia, 3School of Electrical Engineering, Tel-Aviv University, 4School of Physics and Astronomy, Tel-Aviv University, 5Department of Informatics, Bioengineering, Robotics and System Engineering, University of Genova

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce manuscrit décrit un protocole de croître dans les réseaux modulaires in vitro consistant en l'espace confiné, circuits neuronaux fonctionnellement interconnectés. Un masque de polymère est utilisé pour motif une couche de protéines pour favoriser l'adhérence cellulaire sur le substrat de culture. Plaqués neurones poussent sur ​​les zones revêtues établissant des connexions spontanées et présentant une activité électrophysiologique.

Résumé

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Le cerveau fonctionne par l'activation coordonnée et la communication dynamique des assemblées de neurones. Une question majeure est de savoir comment ouvert un vaste répertoire de motifs dynamiques, qui sous-tendent les fonctions cérébrales les plus diverses, peut émerger d'une organisation topologique fixe et modulaire des circuits du cerveau. Par rapport aux études de circuits neuronaux in vivo qui présentent des difficultés expérimentales intrinsèques, les préparations in vitro offrent une possibilité beaucoup plus grande à manipuler et sonder les propriétés structurelles, dynamiques et chimiques des systèmes neuronaux expérimentales. Ce travail décrit une méthodologie expérimentale in vitro qui permet croissante des réseaux modulaires composés par les assemblées de neurones spatialement distincts, fonctionnellement interconnectés. Le protocole permet de contrôler les deux dimensions (2D), l'architecture du réseau neuronal à différents niveaux de complexité topologique.

Une structuration de réseau désiré peut êtreréalisé à la fois sur des lamelles régulières et substrat intégré tableaux micro-électrodes. Structures micro-usinées sont gaufrées sur une tranche de silicium et utilisés pour créer des pochoirs polymères biocompatibles, qui incorporent les caractéristiques négatives de l'architecture de réseau souhaitée. Les pochoirs sont placés sur des substrats de culture au cours de la procédure de revêtement de surface d'une couche moléculaire pour favoriser l'adhérence cellulaire. Après élimination des pochoirs, les neurones sont étalées et ils spontanément redirigées vers les zones revêtues. En diminuant la distance inter-compartiment, il est possible d'obtenir des circuits neuronaux isolées ou reliées entre elles. Pour favoriser la survie des cellules, les cellules sont co-cultivées avec un réseau neuronal de support, qui est situé à la périphérie de la boîte de culture. Des enregistrements électrophysiologiques et optiques de l'activité de réseaux modulaires respectivement obtenus à l'aide de substrats micro intégré réseaux d'électrodes et d'imagerie de calcium sont présentés. Bien que chaque module présente spontsynchronisations mondiaux aneous, l'apparition de synchronisation inter-module est réglementée par la densité de connexion entre les circuits.

Introduction

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Preuves expérimentales et théoriques soutiennent la possibilité que le cerveau fonctionne par l'activation coordonnée des agencements de piles 1-5, qui peut être considéré comme unités fonctionnelles dynamiques qui interagissent de façon transitoire avec l'autre, mise en forme et les différents états sous-jacents du cerveau. Modularité fonctionnelle dépend également et associé à l'organisation modulaire de la structure des circuits cérébraux 6,7. Comment la fonction et la structure des circuits cérébraux façonnent mutuellement est encore l'une des principales questions ouvertes en neurosciences. Afin de fournir une meilleure compréhension de cette question, il est important d'identifier les cadres expérimentales optimales où il est possible de répondre, au moins partiellement, ces questions. Depuis contrôlée manipulation de la dynamique spatio-temporelles des réseaux neuronaux dans des expériences in vivo est difficile, le développement de modèles in vitro de réseaux neuronaux est d'un grand intérêt en raison de leur acc facileessibility, la surveillance, la manipulation et la modélisation de 8,9. Au cours des dernières années, dans les technologies appuyées par des méthodes in vitro substrat de modelage avancées ont permis d'induire réseaux neuronaux pour développer une gamme de structures modulaires prédéfinis 3 et d'étudier les propriétés fonctionnelles des réseaux avec des topologies imposées 10. En particulier, les méthodes ont récemment été utilisés pour organiser des réseaux en imposant des contraintes 4,11 physique. En effet, pour étudier le lien entre la structure et la fonction dans les réseaux neuronaux et de fournir une représentation simplifiée mais plausibles d'interagir assemblées de neurones, les systèmes in vitro doivent fournir des sous-populations neuronales interconnectées. 2D cultures neuronales homogènes largement étudiés ne imposent pas de contraintes spatiales sur le câblage des circuits émergente auto-organisée. Par conséquent, une approche possible pour façonner assemblages de cellules interconnectées artificiellement est de positionner différentes populations neuronales dans naissainially zones distinctes. La distance entre ces zones ne empêche pas les assemblées inter connexions. Cette approche, tout en assurant un contrôle considérable sur la complexité du réseau, a été montré pour fournir un répertoire plus riche de modèles de synchronisation 6,7,12.

Afin de faciliter une culture reproductible des assemblées de neurones modulaires, un protocole d'assembler l'auto-organisation des réseaux neuronaux en groupes reliés par des axones et dendrites est présentée et décrite. La structure polymère pour le confinement physique des cultures de neurones a été créé à partir polydimtheylsiloxane (PDMS). PDMS est un élastomère largement utilisé pour des applications biomédicales en raison de sa biocompatibilité, la transparence et la 13 perméabilité aux gaz. Le PDMS est préparé et exclu de la micro-usiné SU8 2075 14,15 structures par spin-coating un PDMS liquides sur un «maître» comme décrit précédemment dans Jackman et al. 16 TIl a réalisé modelé réseaux neuronaux sont composés de modules interconnectés de taille différente et ils ont été obtenus avec succès sur les deux lamelles et Micro Arrays électrodes (AME) 17-20. La densité des connexions entre les modules peut changer les caractéristiques de la synchronisation du réseau, à partir d'un réseau entièrement synchronisée, typique des cultures homogènes, à des états transitoires de synchronisation entre modules.

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Protocole

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La procédure a été fait en conformité avec les normes NIH pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire et a été approuvé par le Comité de Tel-Aviv University animale soin et l'utilisation (nombre de permis - L-14-019).

1. Préparation d'instruments et PDMS

  1. Préparer la plaquette (Table des matières, ou commander la plaquette d'un laboratoire de microfabrication), un scalpel, et une paire de pinces à épiler - stérilisation ne est pas nécessaire.
  2. Assurez-poly-D-lysine (PDL) Solution selon l'une des conditions suivantes: 4 mg / ml dans du tampon borate 0,1 M, pH 8, et conserver à -20 ° C.
  3. Préparer PDMS pochoirs selon la procédure suivante:
    1. Préparer polydiméthylsiloxane (PDMS, élastomère de silicone) en mélangeant ensemble la base et l'agent de durcissement avec un rapport de 10: 1, puis mélanger les deux substances pendant environ 5 min.
    2. Place dans la chambre à vide à deux reprises pendant 15 min à chaque fois et de vérifier bulles ont disparu.
    3. QuandPDMS est prêt, préparer tournette: boutons d'azote ouverts pour permettre l'utilisation du gaz, placer la plaquette de silicium (figure 1A) sur spinner, et utiliser le vide pour l'empêcher de bouger.
    4. Verser PDMS sur plaquette et activer le spinner pendant 1 min à 1000 rpm (crée environ 100 um hauteur).
    5. Placez plaquette sur une plaque chaude à 100 ° C pendant 30 min.
    6. Lorsque le PDMS a durci, définir les frontières de l'pochoir avec PDMS, en utilisant une pipette Pasteur. Placez plaquette sur une plaque chaude à 100 ° C pendant 30 min.
    7. Lorsque les PDMS frontières ont durci, utiliser un scalpel pour couper les stencils selon les frontières et de décoller le pochoir de silicium de la plaquette (un PDMS carré contenant un seul motif).

2. Boîte de Pétri et lamelle Préparation

  1. Préparer 23 mm lamelles de verre carrée et nettoyez-les selon l'ordre suivant:
    1. Laver à l'eau distillée, 70% d'éthanol, et l'acétone.
    2. Laver avec de l'isopropanol et séchage rapide avec de l'azote.
  2. Placez motifs PDMS pochoirs sur la lamelle, et appuyez doucement pour vérifier qu'ils sont fermement attachés à la surface du verre. Placer dans la chambre à vide pendant 15 min.
  3. 1 ml de l PDL sur pochoir. Insérer la lamelle dans la chambre à vide à deux reprises pendant 20 min chaque fois, et laisser PDL O / N à sécher.
  4. Préparer boîte de Pétri pour créer un réseau de cellules de soutien:
    1. Couvrez la surface du plat (3,5 cm) avec 1 ml de PDL pour 2 h en RT. Retirer la chute PDL aide d'une pipette.
    2. Laver avec de l'eau distillée et laisser sécher. Placer une très petite goutte de la graisse de silicone sur chaque coin de la lamelle.
  5. Placez la lamelle sur le centre de la boîte de Petri (ie, les PDMS devraient être orientés vers le haut) et appuyez doucement pour vérifier l'attachement.
  6. Retirez délicatement PDMS de lamelle en utilisant une pince à épiler. Pour la stérilisation, exposer à illumination UV pendant 7 min.
le "> 3. Multi-Electrode Array (MEA) Préparation

  1. Clean MEA dans cet ordre (Table des Matières):
    1. Laver avec de l'eau sous l'eau courante et soniquer dans un détergent enzymatique concentré trois fois.
    2. Soniquer en eau distillée 3 fois.
    3. Laver avec de l'eau distillée (dans le capot, 1000 pointe du pi) pour 3 fois et le lieu sous UV pendant 30 min.
  2. Appuyer la préparation du réseau:
    1. Préparer le moule de réseau de soutien conçu.
      1. Verser PDMS dans une plaque à 12 puits (diamètre 22 mm).
      2. Lorsque le PDMS est durcie sortir du moule et l'aide d'un scalpel, découper un trou au milieu pour créer une forme d'anneau.
      3. Placez un moule de réseau de soutien conçue sur le centre de la MEA (figure 2A) et couvrir le reste de la surface avec PDL pendant 2 heures à la température ambiante.
    2. Retirer PDL utilisant pipette et laver avec de l'eau distillée.
    3. Retirer le moule et laisser sécher (figure 2A).
  3. Aligner à stencil MEA de la manière suivante:
    1. Placez pochoir sur micro manipulateur désigné. Utilisation d'un microscope inversé pour aligner avec précision la structure à motifs à des électrodes, et d'abaisser le gabarit jusqu'à ce qu'il soit placé sur la surface de la MEA (Figure 2B).
      Remarque: Le contact avec un MEA bien nettoyée fournit adhérence de concurrence entre les PDMS et l'AEM lui-même.
    2. Soulevez le micromanipulateur et, si nécessaire, utiliser des pinces d'appliquer une petite quantité de pression au-dessus des PDMS pour l'empêcher détacher de l'AEM.
    3. Appuyez doucement pochoir à la surface de la MEA, et d'utiliser un microscope pour vérifier qu'il est fermement attaché, et bien aligné. (Figure 2C-D).
  4. Passer MEA dans la chambre à vide pendant 15 min; mettre une goutte de 1 ml de PDL sur pochoir.
  5. Insérez dans la chambre à vide 2 fois pendant 20 min chacun. Laisser sécher PDL O / N dans l'incubateur.
  6. Avant de plaquage, enlever les pochoirs de PDMS AME et laver utilisant stérile water. Placer sous illumination UV pendant 7 min.

4. Dissection et de la culture

  1. Préparer cultures comme décrit dans Herzog et al. 2011 21.

5. Placage

  1. Calculer le nombre de cellules nécessaires pour le placage, en utilisant un hémocytomètre (densité optimale en fonction de la taille du circuit comme décrit dans la suite).
    1. Assurez-vous que la chambre de comptage (hémocytomètre) est propre et placer une lamelle sur elle (la consommation d'alcool pour nettoyer).
    2. Diluer 10 ul de la suspension de cellules dans 190 ul de milieu d'étalement (dilution 1:20).
    3. Charge 10 pi des cellules diluées sur le bord de la chambre de comptage et lentement pipeter les cellules permettant à la chambre à se remplir.
    4. En utilisant un microscope inversé, de visualiser la grille de hémocytomètre. Déterminer le nombre de cellules dans la chambre par comptage direct (cellules saines doivent être ronds). Compter les cellules au sein de la grande witho carréut ceux qui traversent les bords.
    5. Calculer la concentration de cellules:
      Nombre total de cellules / 1000 pi = Total cellules comptées × facteur de dilution x 10 4 (zone de l'hémocytomètre).
      Remarque: Par exemple, si le facteur de dilution est de 20 et le total des cellules comptées étaient 100:
      100 x 20 x 10 x 4 = 0,1 10 7 cellules / 1000 pi ou 1 x 10 6/100 pi. Afin de plaque 0,75 x 10 6 cellules, prendre 75 pi sur les cellules.
  2. Prendre le nombre de cellules nécessaires pour le placage par MEA unique ou boîte de Pétri, remettre en suspension les cellules pour empêcher l'agrégation, et la plaque entre eux au centre, sur le dessus de la zone de patternate (si nécessaire, il est possible de diluer les cellules dans le milieu) . Pour la MEA, déposer une goutte de 100 pl dans le milieu. Pour lamelle, placez une goutte de 1 000 pi au milieu.
  3. Incuber les cellules étalées à 37 ° C pendant 40 min. Ajouter à moyen placage pour les cellules étalées, jusqu'à 1ml par MEA et 2 ml par lamelle.
  4. Gardez à 37 ° C et, tous les quatre jours, diluer avec de milieu de croissance frais enrichi avec 0,5 Pen-Strep, 2% de B-27 et 0,75% glutamax.
  5. De 6/7 DIV, après avoir vu les connexions entre les îles, diluer moyenne avec 10 pl / ml FUDR (25 mg désoxyuridine + 62,5 mg uridine dans 12,5 ml de MEM (milieu essentiel minimum d'Eagle)) ou tout autre agent anti-mitotique pour empêcher gliale prolifération.

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Résultats

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Un SU8-2075 moule sur une tranche de silicium avec une épaisseur de caractéristique d'environ 100 um a été utilisée pour façonner le PDMS. Le motif est composé de plusieurs carrés de dimensions, avec une longueur de côté et la distance variant entre 200 et 700 um (figure 1B). La taille de la place a été choisi pour adapter le champ de vision d'un 10X (pour les îles avec une longueur de côté <800 um) et d'un objectif 20X (pour les îles avec une longueur de côté <400 um). Trois paramètres, à savoir ...

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Discussion

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Un protocole de croître réseaux neuronaux modulaires 2D in vitro composé de circuits fonctionnellement interconnectés est décrite. La procédure est basée sur un motif sur la couche adhésive cellulaire. Modélisation est réalisé avec PDMS pochoirs reproduire l'aspect négatif de l'architecture de réseau désiré. Pochoirs PDMS définissent les zones où la couche adhésive est déposée cellulaire. Une fois que les cellules sont étalées, ils assemblent spontanément aux îles recouvertes et l'auto-organisent en...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne ont rien à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par le projet BRIANBOW européenne (FP7 Jeunes Explorateurs, Les auteurs tiennent à remercier le Dr Jacopo Tessadori des commentaires utiles sur le manuscrit, et Silvia Chiappalone pour son aide dans la production des graphiques utilisés dans la vidéo.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
PDMS, Sylgard 184Dow Corning
Nalgene chambre à videThermo5305-0609
Poly-D-lysine PDLSigmaP7886
Graisse silicone - SILICAID 1010aidchim LtdH3375
Spin coaterLaurell - Technologies CorporationWS-650-23
Plaque de culture 12 puitsSigmaCLS3336
5-Fluoro-2'-désoxyuridineSigmaF0503
UridineSigmaU3003
MEA1060-Inv-BCSystèmes
TC02Systèmes
Pen Strep BiologicalIndustries Beit Haemek03-033-1C
B-27Gibco17504044
glutaMAXGibco35050-038
MEM Minimum Essential Medium-EagleBiological Industries Beit Haemek01-025-1B
Micro Electrode Arrays 4QMulti Channel Systems60-4QMEA1000iR-Ti-prmanuel de nettoyage : http:// www.multichannelsystems.com
Plaquette de siliciummicrochimiqueSU8-2075Protocole de préparation : http://www.microchem.com
multicanauxmulticanaux

Références

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Mots-clés

Pochoirs en PDMSr seaux de micro lectrodesimagerie calciquecircuits neuronauxculture in vitrointerconnexion fonctionnellestructuration de substrat

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