Génération d'une épaisseur en trois dimensions équivalent de peau et automatisé Blessant

Résumé

L’objectif de ce protocole est de construire un équivalent tridimensionnel de la peau de pleine épaisseur, qui ressemble à une peau naturelle. Grâce à un dispositif de plaie automatisé spécialement conçu, des plaies précises et reproductibles peuvent être générées en cas de maintien de la stérilité.

Résumé

Les modèles in vitro constituent une alternative rentable et éthique pour étudier les processus de cicatrisation des plaies cutanées. De plus, en utilisant des cellules humaines, ces modèles reflètent mieux la situation des blessures humaines que les modèles animaux. Bien que les modèles bidimensionnels soient largement utilisés pour étudier des processus tels que la migration cellulaire et la prolifération, des modèles plus complexes sont nécessaires pour acquérir des connaissances plus approfondies sur la cicatrisation des plaies. Outre un système de modèle approprié, la génération de plaies précises et reproductibles est cruciale pour garantir des résultats comparables entre les différentes séries d’essais. Dans cette étude, la génération d’une peau tridimensionnelle de pleine épaisseur équivalente à la cicatrisation des plaies étudiée est montrée. La partie dermique des modèles est composée de fibroblastes dermiques humains intégrés dans un hydrogel de collagène de type I en queue de rat. Après l’inoculation avec des kératinocytes épidermiques humains et la culture subséquente à l’interface air-liquide, un épiderme multicouche se forme au-dessus des modèles. Pour étudier le processus de cicatrisation des plaies, nous avons également développé un dispositif de plaie automatisé, qui génère des plaies standardisées dans une atmosphère stérile.

Introduction

La peau est le plus grand organe du corps. Il crée une barrière entre l'environnement extérieur et les organes internes. En outre, la peau protège le corps contre la perte de liquide, influences de l'environnement, des blessures et des infections et aide à réguler la température corporelle ^1. Grâce à sa situation exposée, la peau est souvent affectée par un traumatisme mécanique, thermique ou chimique. Bien que la peau est généralement capable d'auto-réparation, de multiples facteurs locaux tels que l'infection, l'oxygénation, et la suffisance veineuse peuvent conduire à la guérison des plaies. La cicatrisation des plaies peut également être perturbé par des facteurs systémiques que l'obésité, l'alcoolisme, le tabagisme, les médicaments, la nutrition et les maladies telles que le diabète. ²

Le processus de la cicatrisation peut être divisé en trois phases: (i) la phase inflammatoire, (ii) la prolifération et de la (iii) la phase de remodelage. Après une blessure de la peau, une cascade complexe de signal commence, conduisant à la fermeture de la plaie. ³Après une blessure, la plaie saigne et un caillot de sang se forme. Fibroblastes se déplacent dans le caillot de sang et le remplacer par un nouveau tissu qui est ensuite remodelé au fil des ans.

La compréhension actuelle de la réparation cutanée processus biologiques sous-jacent est limitée. Petits modèles animaux et de porcs ont été utilisées pour étudier la cicatrisation des plaies. Cependant, ces résultats ne peuvent être directement transmises à l'homme en raison des différences spécifiques à l'espèce. En plus de ces modèles in vivo, certains aspects de la cicatrisation des plaies peuvent être étudiés en simulant une situation de la plaie par l'intermédiaire de rayer in vitro des cultures monocouches à base sur des lignées cellulaires immortalisées ou des cellules primaires. ⁴ Ces modèles de grattage sont très normalisées, mais ne reflètent pas suffisamment la la physiologie complexe in vivo. ⁵ Outre les modèles en deux dimensions, les équivalents en trois dimensions peau humaine ont été développés pour la recherche dermatologique. La partie cutanée de ces modèles sont geexonéré en utilisant divers échafaudages comprenant derme décellularisées, ⁶ hydrogels de collagène, ^7,8 glycosaminoglycanes ⁹ ou de matériaux synthétiques. ¹⁰ L'utilisation de ces équivalents de peau, le rôle des interactions épithélium-mésenchyme ^11, la ré-épithélialisation, la diaphonie cellulaire entre les fibroblastes et les kératinocytes et la influence de différents facteurs de croissance peut être étudiée. En outre, ces modèles sont utiles pour acquérir de nouvelles connaissances sur la façon dont les fibroblastes migrent dans la zone blessés et comment les facteurs chimiotactique influencent la régénération des tissus. ¹²

Non seulement la génération du modèle de cicatrisation de la plaie elle-même est difficile, mais également pour établir une plaie hautement standardisée en un modèle est problématique. Techniques communes visant à créer des blessures sont des tests à gratter, ^{13, 14} brûlures bande abrasion, ¹⁵ blessure thermique, ¹⁶ ampoules d'aspiration, de l'azote liquide ^{17, 18, ​​19} lasers scalpels, ¹⁸ mailleurs ⁶ et poinçons de biopsie. ²⁰ La plupart de ces méthodes ont les mêmes pièges. Blessures mises en œuvre manuellement sont difficiles à normaliser et à reproduire entre plusieurs tests. Taille, forme et la profondeur de la plaie varient entre les études et donc nuisent à la qualité des données de recherche. L'utilisation de laser pour blessure défini de la peau peut être relativement facile à normaliser mais conduit à une situation imitant des brûlures. La chaleur appliquée par laser peut provoquer la dénaturation des protéines, l'agrégation des plaquettes ou des navires constriction, ce qui peut conduire à des tissus nécrosés.

Dans une autre approche, nous avons développé un dispositif automatisé de blessure (AWD), ce qui nous permet de générer plaies cutanées définis et précis dans des conditions stériles. Blessant paramètres, comme la profondeur et la vitesse de pénétration ainsi que les révolutions de la tête de forage peuvent être réglementés. Dans cette étude, nous avons combiné l'AWD avec la pleine épaisseur équivalents développés en interne de la peau (ftSE) qui sont comparables à un protocole publié par Gangatirkar et al. ⁸ La couche dermique de l'équivalent de peau est constitué de fibroblastes dermiques humains (HDF), qui sont noyés dans un collagène I hydrogel. Sur la couche dermique, kératinocytes épidermiques humains (HEK) sont ensemencées. Dans les deux semaines à l'interface air-liquide du hek accumuler un épiderme composé de plusieurs couches de cellules vitales et un stratum corneum. Outre la génération de ce modèle, cette étude montre l'utilisation de la traction intégrale pour créer blessures bien précises à FTSE.

Protocole

NOTE: Le protocole est conçu pour la production de 24 équivalents de pleine épaisseur de la peau. Fibroblastes dermiques et les kératinocytes épidermiques humains ont été isolés à partir de biopsies de la peau selon un protocole précédemment publié. ^21,22 consentement éclairé a été obtenu au préalable et l'étude a été approuvé par le comité d'éthique institutionnels sur la recherche humaine de Julius-Maximilians-Université de Würzburg (voter 182 / 10).

1. Production de composants cutanée

1. Dissoudre le collagène avec de l'acide acétique à 0,1% à une concentration finale de 6 mg / ml. Pour la solution de neutralisation du gel, mélanger 232,5 ml 2x DMEM, 7,5 ml de sérum de veau foetal, 7,5 ml de 3 M HEPES, 2,5 ml de sulfate de chondroïtine (5 mg / ml). Conserver la solution de neutralisation de gel et de solution de collagène sur la glace. Calculer 500 pi de gel par équivalent insert / peau.
   NOTE: Comme la solution de gel de neutralisation sera mélangé avec deux parties d'une solution de collagène prépare double du montant de collagène.
2. Placez 24 insertions dans une plaque à 24 puits.
3. Reprendre fibroblastes dermiques humains (HDF) dans 10 ml de DMEM, centrifugeuse pendant 5 min à 270 xg et compter les cellules. Extraire la quantité nécessaire de HDF (5 x 10 ⁴ cellules par 500 pi gel de collagène) et centrifuger les cellules pendant 5 min à 270 x g.
4. Eliminer le surnageant et remettre en suspension avec précaution dans le HDF 4 ml refroidis solution de neutralisation du gel sans produire de bulles d'air. De cette étape assurez-vous de travailler aussi vite que possible pour éviter la solidification prématurée des gels de collagène.
5. Remettre en suspension de la solution avec 8 ml d'une solution de collagène.
6. Prenez le collagène cellules-mélange avec un plusieurs étapes-pipette et remplir rapidement 500 pi de mélange dans chaque insert. Incuber les gels pendant 20 minutes dans un incubateur (37 ° C, 5% CO ₂₎ à gélifier les gels.
7. Immerger les gels dans 2 ml de milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) + 10% de sérum de veau foetal (FCS) par puitset incuber pendant 24 heures dans un incubateur (37 ° C, 5% CO _2).

2. Ajout de kératinocytes épidermiques humains (HEK)

1. Retirez milieu après 24 h. Dissoudre protéine humaine de la fibronectine avec de l'eau ultra-pure à une concentration finale de 50 pg / ml. Couvrir chaque derme équivalent avec 25 pi de solution de fibronectine. Incuber les gels pendant 30 minutes dans un incubateur (37 ° C, 5% CO _2).
2. Dans le même temps, remettre en suspension le hek dans 10 ml KGM-2 et régler la concentration de cellules de 1 x 10 ⁶ cellules / ml avec KGM-2 prêt + 5% de FCS. Seed 1 x 10 ⁵ Hek sur chaque gel. Incuber les gels pendant 45 minutes dans l'incubateur (37 ° C, 5% CO ₂₎ pour permettre aux cellules d'adhérer.
3. Immerger les gels avec KGM-2 prêt + 5% de FCS et leur culture dans l'incubateur (37 ° C, 5% CO _2).

3. Culture de équivalents plein épaisseur de la peau (FTSE)

1. FTSE de Culture pour 6-7 joursen diminuant FCS-concentration (5%, 2% et 0% de FCS). Changer le support tous les 2-3 jours de la prochaine concentration inférieure FCS. Pour cela, supprimer complètement le moyen et ajouter 1,6 ml de milieu frais.
2. Au jour 7, supprimer complètement moyenne.
   REMARQUE: Ne touchez pas la surface FTSE avec le bout de la pipette en le faisant.
3. Lieu tous les insérer dans une puits d'une plaque à 6 puits avec des pinces stériles. Ajouter 1,5 ml de milieu de transport aérien par puits, veiller à ne pas mouiller la surface FTSE. Changer le milieu tous les 2-3 jours pour 14 jours supplémentaires.
   NOTE: Le niveau du milieu de remplissage est au ménisque du FTSE.

4. Analyse histologique

1. Fixation et paraffine-encastrement du FTSE
   1. Retirez milieu de culture, transférer inserts en plaques à 24 puits frais et fixer les tissus en ajoutant 1,6 ml de paraformaldéhyde 4% dans chaque puits et incuber les tissus pendant 2 heures à la température ambiante. Attention! Paraformaldehyde est toxique, manipuler sous une hotte. TransfertL'indice FTSE une cassette de tissu-enrobage. Retirer fixatif restant par lavage avec de l'eau et de déshydrater le tissu en utilisant des concentrations d'éthanol ascendant.
   2. Diviser l'équivalent de peau par une coupe verticale au milieu. Placer les deux pièces dans un moule de base métallique rempli de paraffine surfaces de coupe vers le bas. Ajouter la cassette de tissus au-dessus du moule en tant que support.
   3. Couper 3-5 um tranches et les faire flotter sur un bain d'eau à 40 ° pour les opprimer, les lamelles sur des lames de microscope appropriés. Tranches sécher complètement.
2. Hématoxyline & éosine (H & E) et immunohistochimique (IHC) coloration
   1. Placer les lames dans le rack et incuber pendant 1 heure à 60 ° C. Assurez-vous que la paraffine est fondue. Stain réhydraté tranches avec H & E comme un aperçu coloration standardisée.
   2. Par coloration H & E préparer 4x cuvettes de coloration de verre avec du xylol, 3x avec de l'éthanol à 96%, 2 fois avec de l'éthanol 70%, 1 x avec de l'éthanol à 50%, 4x eau désionisée, 1x hématoxyline, 1x HCl-eTHANOL (13,7 ml de HCl 1 M ad 200 ml 50% d'éthanol), l'eau du robinet 1x, 1x éosine (éosine 1 g dans 100 ml d'eau désionisée) et 2x 2-propanol.
   3. Placer les lames 10 min dans du xylol I et 10 min dans du xylol II Déparaffiner et réhydrater diapositives. Tremper les lames 3x dans l'éthanol 96% I, 3x dans l'éthanol 96% II, 3x dans l'éthanol 70% et 3x dans l'éthanol 50%. Tournez lames à l'eau déminéralisée. Pour différencier hématoxyline colorant, 2x plongeon dans HCl-éthanol. Rincer à l'eau déminéralisée. Pour bleuissement, placer les lames 5 min dans l'eau du robinet. Pour éosine, le lieu glisse 1 min dans l'éosine et laver ensuite dans de l'eau déminéralisée. Pour la déshydratation, plaques d'immersion 2x dans l'éthanol 70%, 2x dans l'éthanol 96% et les placer pendant 5 min dans 2-propanol I, pendant 5 min dans 2-propanol II, 5 min dans du xylol I et 5 min dans du xylol II. Après coloration H & E, des noyaux cellulaires sont colorés en bleu, le cytoplasme et la matrice extracellulaire sont colorées en rouge.
   4. Pour la récupération de l'antigène, enlever la paraffine avec du xylène et de se réhydrater tranches pour la coloration. Placer les tranchesen cuiseur à vapeur et faire cuire les tranches déparaffinées et réhydratées pendant 20 min dans préchauffées tampon citrate 10 mM (pH 6).
   5. Placer les lames dans du tampon de lavage (tampon PBS + 0,5% Polysorbat 20) et les tranches de cercle avec un marqueur liquide répulsif de glissement ou de diamant stylet.
   6. Placer les lames dans une chambre humide. Bloquer la peroxydase endogène, par addition de 100 ul de solution à 3% de peroxyde d'hydrogène sur chaque tranche. Attention! Très dangereux en cas de contact avec la peau et les yeux. Manipuler avec équipement de protection individuelle. Laver les lames dans du tampon de lavage.
   7. Appliquer un anticorps primaire et incuber pendant 1 heure à température ambiante. Laver les lames trois fois avec du tampon de lavage. A partir de là, les échantillons doivent être conservés dans l'obscurité.
   8. Utiliser le système de détection de la biotine-streptavidine pour la détection de la liaison antigène-anticorps spécifique.
   9. Noyaux Counterstain à l'hématoxyline pendant 1 min. Déshydrater et monter diapositives.
   10. échantillons de l'image en utilisant un microscope inversé.

5. Blessure par l'utilisation du dispositif automatisé Blessant (AWD)

1. Préparer le AWD en désinfectant la zone de travail avec 70% d'éthanol et la lumière ultraviolette. Assurez-vous que la tête de forage de la taille désirée (par exemple, 1 mm) est fixé.
2. Placez équivalents de peau dans les régions désignées de la plaque de support de l'échantillon autoclave en utilisant des pinces stériles. Placer la plaque de support d'échantillon dans la douille au-dessous de la tête de forage.
3. Utilisez le logiciel de commande pour régler les paramètres blessant comme suit: vitesse de rotation: 15000 tours par minute; pénétration: 1,5 mm; propulsion: 100 Hz. Ces paramètres doivent être définis pour chaque type d'échantillon individuellement. Transfert blessant paramètres au stade AWD.
4. Procédure de départ blessant. Retirer échantillon plaque de support de la prise. Transfert blessé FTSE retour dans des inserts utilisés pour la culture à l'aide de pinces stériles.
5. Procéder à la culture de FTSE blessés dans l'incubateur (37 ° C, 5% de CO ₂₎ pour l'étude de la régénération. Alvariante, utiliser les modèles pour l'analyse histologique à tout moment.

Résultats

La isolée HDF et Hek diffèrent à la fois dans la morphologie et de l'expression de marqueurs typiques. HDF a montré la morphologie typique broche en forme, alors que la morphologie de Hek peut être décrit par une morphologie pavée. Les cellules ont été caractérisées par une coloration immunohistochimique (Figure 1) avant de les utiliser pour FTSE. Le HDF sont positives pour la vimentine (Figure 1A), un marqueur de fibroblastes. HEK primaire exprimer très précoce de différenciation proté...

Discussion

Dans les cellules in vitro sont généralement étendu dans des cultures cellulaires bidimensionnelles, dans lequel les cellules adhèrent aux surfaces plastiques. Cependant, ces conditions de culture ne reflètent pas les conditions physiologiques en trois dimensions dans laquelle les cellules se développent in vivo. Dans des conditions tridimensionnelles, les cellules peuvent former des attachements cellule-cellule et cellule-matrice naturelles et de migrer dans les trois dimensions. Surtout dans...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Trypsine EDTA (1:250) 0,5 % dans DPBS	PAA	L11-003	0,05 %
Dulbecco' s Phosphate Saline	Sigma	D8537
Collagène (6 mg/ml dans 0,1 % d’acide acétique)	Produit en interne
Fibronectine Protéine humaine, Plasma (50  ; et micro ; g/ml)	Life Technologies	33016-015
Inserts	Nunc	140627
plaque à 6 puits  ;	Nunc	140685
24 plaque de microscope	Nunc	142485
R	. Langenbrinck	03-0070
Fibroblasts de culture (500 ml) :
DMEM, high glucose	Life Technologies	11965-092	89 % (445 ml)
Sérum fœtal bovin	Bio & Vendez des	FCS. ADD.0500	10 % (50 ml)
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1 % (5 ml)
Milieu de culture de kératinozyte (500 ml) :
Milieu de croissance de kératinocytes 2	Promocell  ;	C-20111	89 % (445 ml)
Milieu de croissance des kératinocytes 2 SupplémentPack	Promocell  ;	C-39011
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1 % (5 ml)
Solution de neutralisation du gel (250 ml) :
Dulbecco' s Modified Eagle Poudre de glucose moyenne, élevée avec L-Glutamine	PAA	G0001,3010	93 % (232.5 ml)
Sulfate de chondroïtine sel sodique de cartilage de requin	Sigma	C4384-1g	1 % (2.5 ml)
Sérum fœtal	bovin Bio & Vendez des	FCS. ADD.0500	3 % (7.5 ml)
HEPES	Sigma  ;	H3375-1kg	3 % (7.5 ml)
Skins submerseurs medium (500  ; ml) :
Milieu de croissance des kératinocytes 2	Promocell  ;	C-20111
Milieu de croissance des kératinocytes 2 SupplementPack	Promocell  ;	C-39011
Sérum de veau fœtal	Bio & Vendez des	FCS. ADD.0500	5 %-2 % (25 ml-10 ml)  ;
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1 % (5 ml)
Skin model air-liquid interface medium (500 ml) :
Keratinocyte Growth Medium 2
Growth Medium 2 Supplement Pack	Promocell  ;	C-39011	en ajoutant uniquement des suppléments : insuline, hydrocortisone, épinéphrine, transferrine, CaCl2
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1 % (5 ml)
CaCl2 (300 mM)	Sigma  ;	C7902-500g	0,62 % (3,1 ml)
Histologie :
IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP	DCS	PD000KIT
Vimentin	anticorps Abcam	ab92547
CK14	anticorps Sigma  ;	HPA023040-100 et micro ;
Anticorps CK10	Dako	M7002
Anticorps anti-filaggrine	Abcam	ab81468
H& E coloration :
Mayer&aiguë ; s Haemalaun	AppliChem	A0884,2500
Xylol	Sigma Aldrich	296325-4X2L
Éthanol	Sigma Aldrich	32205-4X2.5L
HCl	Sigma Aldrich	H1758-500ML
Eosin	Sigma Aldrich	E4009-5G
2-Propanolol	Sigma Aldrich	I9516-500ML
Support de montage	Sigma Aldrich	M1289-10ML