Génération d'une épaisseur en trois dimensions équivalent de peau et automatisé Blessant

Résumé

L’objectif de ce protocole est de construire un équivalent tridimensionnel de la peau de pleine épaisseur, qui ressemble à une peau naturelle. Grâce à un dispositif de plaie automatisé spécialement conçu, des plaies précises et reproductibles peuvent être générées en cas de maintien de la stérilité.

Résumé

Les modèles in vitro constituent une alternative rentable et éthique pour étudier les processus de cicatrisation des plaies cutanées. De plus, en utilisant des cellules humaines, ces modèles reflètent mieux la situation des blessures humaines que les modèles animaux. Bien que les modèles bidimensionnels soient largement utilisés pour étudier des processus tels que la migration cellulaire et la prolifération, des modèles plus complexes sont nécessaires pour acquérir des connaissances plus approfondies sur la cicatrisation des plaies. Outre un système de modèle approprié, la génération de plaies précises et reproductibles est cruciale pour garantir des résultats comparables entre les différentes séries d’essais. Dans cette étude, la génération d’une peau tridimensionnelle de pleine épaisseur équivalente à la cicatrisation des plaies étudiée est montrée. La partie dermique des modèles est composée de fibroblastes dermiques humains intégrés dans un hydrogel de collagène de type I en queue de rat. Après l’inoculation avec des kératinocytes épidermiques humains et la culture subséquente à l’interface air-liquide, un épiderme multicouche se forme au-dessus des modèles. Pour étudier le processus de cicatrisation des plaies, nous avons également développé un dispositif de plaie automatisé, qui génère des plaies standardisées dans une atmosphère stérile.

Introduction

La peau est le plus grand organe du corps. Il crée une barrière entre l'environnement extérieur et les organes internes. En outre, la peau protège le corps contre la perte de liquide, influences de l'environnement, des blessures et des infections et aide à réguler la température corporelle ^1. Grâce à sa situation exposée, la peau est souvent affectée par un traumatisme mécanique, thermique ou chimique. Bien que la peau est généralement capable d'auto-réparation, de multiples facteurs locaux tels que l'infection, l'oxygénation, et la suffisance veineuse peuvent conduire à la guérison des plaies. La cicatrisation des plaies peut également....

Protocole

NOTE: Le protocole est conçu pour la production de 24 équivalents de pleine épaisseur de la peau. Fibroblastes dermiques et les kératinocytes épidermiques humains ont été isolés à partir de biopsies de la peau selon un protocole précédemment publié. ^21,22 consentement éclairé a été obtenu au préalable et l'étude a été approuvé par le comité d'éthique institutionnels sur la recherche humaine de Julius-Maximilians-Université de Würzburg (voter 182 / 10).

1. Production de composants cutanée

1. Dissoudre le collagène avec de l'acide acétique à 0,1% à une concentration finale de 6 mg / ml. Pour la solution de neu....

Résultats

La isolée HDF et Hek diffèrent à la fois dans la morphologie et de l'expression de marqueurs typiques. HDF a montré la morphologie typique broche en forme, alors que la morphologie de Hek peut être décrit par une morphologie pavée. Les cellules ont été caractérisées par une coloration immunohistochimique (Figure 1) avant de les utiliser pour FTSE. Le HDF sont positives pour la vimentine (Figure 1A), un marqueur de fibroblastes. HEK primaire exprimer très précoce de différenciation proté.......

Discussion

Dans les cellules in vitro sont généralement étendu dans des cultures cellulaires bidimensionnelles, dans lequel les cellules adhèrent aux surfaces plastiques. Cependant, ces conditions de culture ne reflètent pas les conditions physiologiques en trois dimensions dans laquelle les cellules se développent in vivo. Dans des conditions tridimensionnelles, les cellules peuvent former des attachements cellule-cellule et cellule-matrice naturelles et de migrer dans les trois dimensions. Surtout dans.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Trypsine EDTA (1:250) 0,5 % dans DPBS	PAA	L11-003	0,05 %
Dulbecco' s Phosphate Saline	Sigma	D8537
Collagène (6 mg/ml dans 0,1 % d’acide acétique)	Produit en interne
Fibronectine Protéine humaine, Plasma (50  ; et micro ; g/ml)	Life Technologies	33016-015
Inserts	Nunc	140627
plaque à 6 puits  ;	Nunc	140685
24 plaque de microscope	Nunc	142485
R	. Langenbrinck	03-0070
Fibroblasts de culture (500 ml) :
DMEM, high glucose	Life Technologies	11965-092	89 % (445 ml)
Sérum fœtal bovin	Bio & Vendez des	FCS. ADD.0500	10 % (50 ml)
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1 % (5 ml)
Milieu de culture de kératinozyte (500 ml) :
Milieu de croissance de kératinocytes 2	Promocell  ;	C-20111	89 % (445 ml)
Milieu de croissance des kératinocytes 2 SupplémentPack	Promocell  ;	C-39011
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1 % (5 ml)
Solution de neutralisation du gel (250 ml) :
Dulbecco' s Modified Eagle Poudre de glucose moyenne, élevée avec L-Glutamine	PAA	G0001,3010	93 % (232.5 ml)
Sulfate de chondroïtine sel sodique de cartilage de requin	Sigma	C4384-1g	1 % (2.5 ml)
Sérum fœtal	bovin Bio & Vendez des	FCS. ADD.0500	3 % (7.5 ml)
HEPES	Sigma  ;	H3375-1kg	3 % (7.5 ml)
Skins submerseurs medium (500  ; ml) :
Milieu de croissance des kératinocytes 2	Promocell  ;	C-20111
Milieu de croissance des kératinocytes 2 SupplementPack	Promocell  ;	C-39011
Sérum de veau fœtal	Bio & Vendez des	FCS. ADD.0500	5 %-2 % (25 ml-10 ml)  ;
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1 % (5 ml)
Skin model air-liquid interface medium (500 ml) :
Keratinocyte Growth Medium 2
Growth Medium 2 Supplement Pack	Promocell  ;	C-39011	en ajoutant uniquement des suppléments : insuline, hydrocortisone, épinéphrine, transferrine, CaCl2
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1 % (5 ml)
CaCl2 (300 mM)	Sigma  ;	C7902-500g	0,62 % (3,1 ml)
Histologie :
IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP	DCS	PD000KIT
Vimentin	anticorps Abcam	ab92547
CK14	anticorps Sigma  ;	HPA023040-100 et micro ;
Anticorps CK10	Dako	M7002
Anticorps anti-filaggrine	Abcam	ab81468
H& E coloration :
Mayer&aiguë ; s Haemalaun	AppliChem	A0884,2500
Xylol	Sigma Aldrich	296325-4X2L
Éthanol	Sigma Aldrich	32205-4X2.5L
HCl	Sigma Aldrich	H1758-500ML
Eosin	Sigma Aldrich	E4009-5G
2-Propanolol	Sigma Aldrich	I9516-500ML
Support de montage	Sigma Aldrich	M1289-10ML