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Article de méthode

Évaluation des leucocytes infiltrant les tumeurs sous-ensembles dans un Modèle de tumeur sous-cutanée

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DOI :

10.3791/52657

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13 avril 2015

 ,  ,  ,  , 
1Division of Oncology, Department of Medicine, Washington University School of Medicine, 2Palo Alto Institute for Research and Education, Veterans Affairs Palo Alto Health Care System, 3Laboratory of Immunology and Vascular Biology, Department of Pathology, Stanford University School of Medicine

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une méthode pour l’évaluation détaillée des sous-ensembles de leucocytes dans le microenvironnement tumoral dans un modèle de tumeur chez la souris. Des cellules de mélanome B16 exprimant la chémérine ont été implantées par voie sous-cutanée dans des souris syngéniques. Les cellules du microenvironnement tumoral ont ensuite été colorées et analysées par cytométrie en flux, ce qui a permis d’analyser en détail les sous-ensembles de leucocytes.

Résumé

Cellules immunes spécialisées qui se infiltrent dans le microenvironnement tumoral régulent la croissance et la survie de la néoplasie. Les cellules malignes doivent éluder ou affaiblir les réponses immunitaires anti-tumorales afin de survivre et de se épanouir. Les tumeurs de profiter d'un certain nombre de différents mécanismes de immunitaire "fuite", y compris le recrutement de DC tolérogènes, des cellules T régulatrices immunosuppresseurs (Treg) et myéloïdes cellules suppressives dérivées (MDSC) qui inhibent les réponses cytotoxiques anti-tumoraux. Inversement, les cellules effectrices immunitaires anti-tumorales peuvent ralentir la croissance et le développement de tumeurs: les cellules dendritiques immunostimulateurs, les cellules tueuses naturelles qui abritent l'immunité anti-tumorale innée, et des cellules T cytotoxiques peut participer à toute suppression tumorale. L'équilibre entre pro et anti-tumorales leucocytes détermine finalement le comportement et le devenir des cellules transformées; une multitude d'études cliniques chez l'homme ont confirmé cette. Ainsi, l'analyse détaillée des sous-ensembles de leucocytes dans lesle microenvironnement de la tumeur est devenue de plus en plus importante. Ici, nous décrivons un procédé d'analyse des sous-ensembles de leucocytes infiltrants présents dans le micro-environnement de la tumeur dans un modèle de tumeur de souris. Des cellules de mélanome de souris B16 tumorales ont été inoculées par voie sous- cutanée dans des souris C57BL / 6. À un moment précis, les tumeurs et la peau environnante ont été réséquées en bloc et transformées en suspensions cellulaires simples, qui ont ensuite été colorées pour le multi-couleur cytométrie de flux. En utilisant une variété de marqueurs de leucocytes sous-ensemble, nous avons été en mesure de comparer les pourcentages relatifs des sous-ensembles de leucocytes infiltrant entre le contrôle et les tumeurs exprimant chémérine. Les chercheurs peuvent utiliser un tel outil pour étudier la présence immunitaire dans le microenvironnement de la tumeur et en conjonction avec les mesures de taille de l'étrier traditionnelles de la croissance de la tumeur, seront potentiellement leur permettre d'élucider l'impact des changements dans la composition immunitaire sur la croissance tumorale. Une telle technique peut être appliquée à ne importe quel modèle de tumeur dans laquelle la tumeur et son micro-environnement cune résection et traitées.

Introduction

L'équilibre entre la croissance de la tumeur et la promotion et la régression est, en partie, en fonction de l'équilibre des leucocytes infiltrant les tumeurs pro- et anti présents dans le microenvironnement 1,2. Afin d'étudier le microenvironnement tumoral (TME) et en particulier identifier les sous-populations de leucocytes infiltrant, nous avons développé une méthode d'évaluation des tumeurs sous-cutanées dans un modèle murin de la tumeur. L'importance de l'étude de la micro-environnement de la tumeur est bien connu et pris en charge dans la littérature. De nombreuses études ont démontré que la balance des cellules immunitaires pro et anti-tumorales infiltrant peut influer sur les résultats de la croissance tumorale, non seulement chez la souris mais aussi les études humaines (examinés dans 3,4). Par exemple, Curiel et al. Ont montré que les résultats cliniques ont empiré chez les patients atteints d'un cancer de l'ovaire ont été corrélées avec la présence des pourcentages croissants de cellules infiltrant les tumeurs de régulation (T CD4 + Treg) 5. Notre propre travail a également montré l'effet d'un pasvel chimiotactique des leucocytes sur les taux de sous-ensembles de leucocytes dans un modèle de mélanome de la souris 6, qui a également corrélée avec une diminution de la croissance tumorale. Ainsi, les analyses détaillées des sous-ensembles de leucocytes dans une tumeur est désormais plus largement reconnus et de plus en plus importante.

Il existe de nombreuses façons d'évaluer le microenvironnement de la tumeur pour l'infiltration des leucocytes; par exemple des groupes ont conçu des souris transgéniques pour exprimer différentes protéines fluorescentes pour imager la TME 7, immunohistochimie classique et immunofluorescence de sections conservés 8, y compris diverses modalités d'imagerie comme l'IRM, PET, microscopie confocale 9-11 - certains avec la capacité de surveiller intravitally 10,12. Ils peuvent être utilisés avec divers agents d'imagerie moléculaire, tels que 13 des nanoparticules ou des nouveaux agents de contraste 14 qui étiquette des cellules immunitaires. Notre méthode est une approche basée sur la cytométrie de flux et a plusieurs avantages.Tout d'abord, le micro-environnement de la tumeur entière peut être échantillonné; au moment de l'analyse, la totalité de la tumeur sous-cutanée et la périphérie environnante est réséquées chirurgicalement pour traitement. Ceci élimine tout biais potentiellement échantillonnage dans une seule tumeur et donne une analyse plus "global" de la tumeur dans son ensemble. Deuxièmement, en utilisant flux multicolore cytométrie d'analyser les sous-ensembles de leucocytes nous permet de mesurer plus précisément le phénotype de leucocytes infiltrants. Selon le nombre de couleurs utilisées, des sous-ensembles très spécifiques peuvent être identifiés. Ceci est important car il existe plusieurs sous-ensembles de leucocytes dans un type cellulaire particulier - ou même dans une classification générale du sous-type - qui ont des fonctions disparates qui sont potentiellement important dans la détermination du sort de la tumeur. Par exemple, les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) ont été impliqués dans l'immunité anti-tumorale 15. Toutefois, le sous-ensemble de CCR9 + pDC a été démontré que 16 tolérogène, et décaler la balance d'un tel sous-ensemble peut avoir un impact sur la croissance tumorale.

Notre méthode est appropriée pour sous-cutanée ou d'autres tumeurs qui peuvent être réséquées en bloc. Dans nos mains, les tumeurs ont été réséquées uniforme au moment de l'euthanasie. Toutefois, il est concevable, comme cela a été fait dans certaines études, une tumeur sous-cutanée qui peut être entièrement réséquée avec fermeture de la peau environnante à une chirurgie de survie 17, permettant ainsi une évaluation supplémentaire de l'animal. L'analyse est ensuite réalisée sur la tumeur réséquée. Ainsi, les résultats représentent un seul point de temps dans le développement de la tumeur. Bien que cela permet une analyse détaillée dans le microenvironnement, ce est aussi une image statique de ce qui est sans aucun doute un processus dynamique. Cependant, les leucocytes isolés (par exemple par l'intermédiaire d'une séparation magnétique ou de gradient de densité) peut ensuite être analysé séparément de l'épithélium et le stroma de la tumeur, ou utilisés dans d'autres dosages fonctionnels, de définir plus précisément leur phénotype, comme cela a été précément décrit 18. Cette méthode, alors, serait utile pour tous les chercheurs intéressés à comprendre la composition des leucocytes dans le microenvironnement de la tumeur à un instant donné, que ce soit dans le cadre du cours naturel de la maladie, ou après une perturbation thérapeutique spécifique. Bien que non effectuée par nous, les variations de cette procédure peuvent aussi potentiellement être utilisés pour analyser des portions spécifiques d'une tumeur dans l'isolement. Par exemple, étant donné la taille de la tumeur, la zone (s) périphérique pourrait être disséquée du noyau central, éventuellement nécrotique de la tumeur pour donner aux chercheurs une vue plus spatialement séparées du microenvironnement de la tumeur.

Dans le domaine en plein essor de l'immunologie des tumeurs, il y aura sans aucun doute un nombre en croissance exponentielle des études évaluant de nouveaux agents immunomodulateurs dans les modèles de tumeurs murines. Plusieurs rapports ont mis en évidence les différences de fonction spécifique de leucocytes dans la tumeur par rapport au périphérique environnement. Par exemple, Shafer-Weaver et al. Ont montré dans un modèle de souris que T effecteurs spécifiques à l'antigène des cellules CD8 +, tant qu'il est actif dans la périphérie, ont été transformés dans des cellules suppressives T CD8 + une fois la traite dans le micro-environnement de la tumeur 19. Ce était en partie due à TGFß, mais d'autres facteurs sont susceptibles impliqué ainsi. Ainsi, l'évaluation des sous-ensembles de leucocytes - des chiffres et des ratios, ainsi que l'état fonctionnel - au sein de la tumeur elle-même donnera une représentation plus précise de l'effet d'une immunomodulation notamment sur le sort de la tumeur.

Notre technique permet une analyse détaillée de la tumeur et le chercheur fournit l'occasion d'identifier de plus près l'évolution des populations de leucocytes que les approches précédentes.

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Protocole

NOTE: Toutes les expériences animales ont été menées conformément aux approuvé Stanford, Palo Alto VA HCS, et les instituts nationaux de la santé institutionnelle AnimalCare et l'utilisation des lignes directrices du Comité.

1. Préparation de prélèvement des échantillons et de transformation (Temps requis: ~ 10-15 min)

  1. Ensemencer les cellules B16F0 de mélanome murines (de 0,5 à 1 x 10 6) sous-cutanée à ou près de la ligne médiane de l'abdomen chez la femelle souris C57BL / 6 comme décrit précédemment 6. Sinon, inoculer les cellules tumorales dans des sites anatomiques supplémentaires (par exemple flanc, coussinet adipeux mammaire, etc).
    NOTE: Ne importe quel nombre de tumeurs (implanté ou spontané) peut être utilisé et évalué en utilisant ce protocole. Par exemple, d'autres couramment utilisés tumeurs syngéniques chez les souris C57BL / 6 comprennent la ligne du côlon MC38, carcinome pulmonaire de Lewis (LLC), et la ligne de la prostate TRAMP-C2. Bien que des xénogreffes humaines inoculées dans des souris immunodéficientes peuvent également être évalués de cette manière, il convient de noter que le portraits des leucocytes infiltrant les tumeurs seront nécessairement être modifiés en fonction de l'état immunodéficient de la souris hôte.
    1. Utilisez un support complet (par exemple RPMI contenant 10% de FBS et additifs) ou un autre tampon contenant une protéine appropriée (par exemple HBSS ou de PBS + 1% de FBS à 1% ou BCS). Refroidir les médias ou un tampon à 4 ° C avant l'euthanasie.
  2. Mettre en place des tubes de prélèvement et les filtres pour les tumeurs réséquées; les placer sur la glace.
    1. Utilisez une 50 ml par tube conique tumeur à une résection. Insérer un filtre de suspension de cellules de 40 à 70 um chacun. Vous pouvez également utiliser 15 ml tubes coniques avec filtre maille métallique. Utiliser un piston de seringue de 5 ml ou un stylo épais pour créer un filtre en forme de cuvette dans la partie supérieure du tube de 15 ml.
  3. Élaborer des instruments pour la résection tumorale et le traitement; utiliser une pince chirurgicale et ciseaux fins à réséquer et les tumeurs de processus. Utilisez éthanol à 70% pour nettoyer les instruments entre les échantillons résections / tumorales. Pour plus grand nombre of échantillons (par exemple> 10), nous recommandons le traitement simultané de plusieurs échantillons par les chercheurs pour éviter des différences significatives dans le temps de traitement entre les échantillons de tumeurs.

2. tumeur résection (Temps requis: ~ 5 min / tumeur)

  1. Euthanasier souris porteuses de tumeurs B16 individuellement à l'aide de dioxyde de carbone ou autre méthode approuvée.
  2. Fixez la souris sur une scène chirurgicale. Pulvériser la zone tumorale avec 70% d'éthanol et essuyer l'excès de large; Cela permet d'éviter la propagation de tout poil présente. Pour les souris non-nudité, raser la zone de la peau autour de la tumeur avant la résection au besoin.
  3. En utilisant des pinces et ciseaux, la résection de la tumeur sous-cutanée en bloc, y compris recouvrant et la peau environnante. Le montant de la peau "de la marge" prise peut varier, mais généralement réséquer 2-3 mm de la peau autour de la tumeur.
    1. Peser tumeurs réséquées (+/- de la peau environnante) à ce point. Placez la section la peau / résection de la tumeur dans le filtre fixé dans le pltube conique astic.

3. Préparer une suspension unique cellule tumorale (Temps requis: ~ 5-7 min / tumeur)

  1. Utilisez des pinces et ciseaux pour mâché tumeur et recouvrant / peau environnante. Émincer l'échantillon à l'aide des ciseaux jusqu'à ce que toutes les grandes sections de tissu sont transformées en sections 1-2 mm.
    Remarque: En général, les tumeurs sont traitées ensemble; Sinon, pour les tumeurs plus volumineuses, des sections représentatives de tumeurs pourraient être hachées et traitées.
  2. Utilisation d'un piston à partir d'un 5 ou jetable seringue de 10 ml, ventiler mécaniquement le tissu tumoral hachée sécurisée contre le filtre.
  3. Aide d'une pipette, lavez le tissu tumoral traité avec 5-10 ml de milieu froid ou tampon. Cela rincer les cellules individuelles à travers le filtre.
  4. Répétez les deux étapes ci-dessus à plusieurs reprises, se assurer que le nombre et le volume de lavage totale sont sensiblement les mêmes pour les tumeurs de taille similaire.
    1. Après avoir lavé le tissu de la tumeur traitée, observerde petits fragments de peau et / ou d'autres tissus conjonctifs doivent être laissées dans le filtre.
    2. Sinon, pour les tumeurs où désagrégation mécanique seule peut ne pas suffire, la digestion par la collagénase et / ou d'autres enzymes peut être effectuée avant la procédure de hachage. Cela permettra une suspension plus approfondie de la cellule unique. Toutefois, il convient de noter que ces protocoles de digestion peuvent affecter l'antigène de surface de 20 l'expression, donc la prudence doivent être prises dans l'interprétation de ces résultats.
  5. Lavez et sédimenter les cellules en ajoutant des médias / tampon et centrifugation à 4 ° C 500 g pendant 5 min.

4. FACS coloration de cellule unique Suspension (Temps requis: ~ 30-60 min)

  1. Resuspendre les cellules dans un tampon FACS glace froide (PBS + 1% de FBS).
  2. Compter les cellules viables à l'aide de bleu trypan et un hémocytomètre ou compteur de cellules automatisé.
  3. Déterminer le rendement de cellules viables total par volume. Ces données peuvent être utilisées pour extrapolernombre absolu de leucocytes infiltrant les tumeurs en combinaison avec les données FACS.
  4. Déterminer le nombre de cellules à colorer et analysé par FACS. Ce sera influencé par plusieurs facteurs (par exemple type de tumeur d'histologie, l'âge et la taille de la tumeur, pourcentage moyen de leucocytes infiltrants, etc.).
    Remarque: dans le mélanome B16, nous avons constaté un faible pourcentage de leucocytes infiltrant les tumeurs (TIL; typiquement <5%) par rapport à des cellules tumorales. Ainsi, au moins 1 x 10 6 tumeur totale (+ tumorales leucocytes infiltrants), les cellules ont été collectées par l'intermédiaire typiquement FACS pour l'analyse.
    1. En utilisant les données de comptage trypan teinté, volume calculé de cellules à colorer pour FACS. Par exemple, si TIL constitue généralement 5% des cellules tumorales totales (nombre de cellules tumorales seront morts sur la tache trypan), ce facteur dans le nombre total de tumeurs suspension cellulaire unique à colorer.
    2. Pour les sous-ensembles de leucocytes moins communs, comme les CCR9 + PDC) utiliser un plus grand nombre de cellules tumorales totales (par exemple 2 à 3 x 10 6) pour la coloration FACS, étant donné la faible fréquence relative de ces cellules dans la suspension cellulaire unique.
  5. Colorer la suspension tumeur des cellules unique pour FACS.
    1. Pour la discrimination vivants / morts, utiliser une tache fixable ou colorant non-réparable (par exemple l'iodure de propidium) peut être utilisé. Si la cellule sont colorés sans discrimination vivants / morts, la prudence doit être avisé donné le potentiel de liaison non spécifique d'anticorps.
    2. Colorer la suspension de cellules pour des sous-ensembles de leucocytes spécifiques en utilisant un protocole standard de coloration FACS. Bloc de cellules d'anticorps réduisent la liaison non spécifique avec du PBS / FBS contenant du sérum de rat à 1% et bloc Fc (anti-CD16 / 32) pendant 10 minutes avant la coloration avec des anticorps spécifiques de l'antigène. Inclure les anticorps de contrôle d'isotype correctes pour assurer la coloration est spécifique.
    3. À ce stade, après la coloration FACS est terminée, fixer échantillons avec 4% de formaldéhyde ou un autre agent fixateur similaire. Conserver les échantillons à 4 ° C dans le dark (pour éviter l'extinction de fluorophores) jusqu'au moment de la collecte et de l'analyse.
      REMARQUE: Le stockage des échantillons fixe pendant de longues périodes de temps peut entraîner une altération du signal et l'intensité des fluorophores 21.
    4. Recueillir les échantillons sur un cytomètre de flux. Écoulement optimal cytomètre paramètres varie en fonction du type d'instrument et la configuration laser / détecteur.
      NOTE: En outre, il peut être la variabilité entre les expériences, même si l'aide de la même machine. Ainsi, effectuez la configuration de la machine approprié (par exemple en utilisant des billes d'étalonnage) pour assurer réglage de la compensation appropriée avant la collecte et l'analyse de chaque expérience FACS.
  6. L'analyse des sous-ensembles de leukoctye
    1. Utilisation FACS logiciel d'analyse de données, d'analyser les données. Pour une tache vivants / morts, commencez par Elimination cellules mortes. Utilisez anticorps dirigé contre un marqueur spécifique de leucocytes (par exemple anti-CD45) pour identifier les leucocytes dans les cellules vivantes.
      1. Après cela, utiliser diverses gatirégimes ng d'identifier des sous-ensembles spécifiques, en fonction du protocole de coloration. Par exemple, pour identifier les cellules T CD4 +, sélectionnez la région SSC lo de la population CD45 + et CD19-sélectionner les cellules CD3 +; à partir de ces cellules T CD4 + peuvent être identifiés 22.
    2. Analyser les données et de les présenter dans un certain nombre de façons différentes pour assurer la cohérence et déterminer les comportements ou tendances (c.-à-utiliser NOMBRE TOTAL, pourcentages, rapports ou de quantifier des sous-ensembles).
      REMARQUE: Par exemple, nous avons examiné CD45 + cellules vif total en pourcentage de cellules tumorales totales collectées (Figure 1). En outre, nous avons ensuite calculé le pourcentage de chaque sous-ensemble de leucocytes (par exemple, les cellules T CD4 +) dans la tumeur et comparé ces ratios comme entre les groupes témoin et d'essai (Figure 3).

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Résultats

Nos résultats ont montré que la surexpression forcée de chémérine dans les tumeurs murines B16 augmentée le pourcentage de leucocytes infiltrant les tumeurs (TIL). En outre, les modifications de la proportion relative des sous-ensembles de leucocytes représentés dans le micro-environnement de la tumeur associée à l'expression de chémérine ont été identifiés. Re-imprimer avec la permission de Pachynski et al. 6.

La Figure 1 montre qu'il y avait une a...

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Discussion

Effectuer une analyse détaillée de la micro-environnement de la tumeur est essentielle pour déterminer les mécanismes et les effets de l'immunomodulation. Avec la présence croissante de l'immunothérapie dans le domaine clinique humaine, la compréhension de l'impact de ces agents sur les leucocytes infiltrant la tumeur devient nécessaire dans la définition de leur mécanisme d'action. Chez les humains, il existe souvent des problèmes cliniques et / ou de logistique pour l'obtention et l'analyse du ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été financé par des subventions R01-CA169354   et R01-047822   des Instituts nationaux de la santé et d'un prix d'excellence du ministère des Anciens Combattants (BCE). RKP a été soutenue par le NIH T32 CA009287-30A1, un Prix du jeune chercheur de l'ASCO, Californie Breast Cancer Research Project Fellowship, et d'un American Cancer Society Research Scholar encadrée Grant; BAZ a été soutenue par le NIH subvention AI079320. JM a été soutenu par des bourses des NIH T-32 subvention de formation T32-AI07290- 25, T32-AI07290-24 et American Cancer Society bourse post-doctorale PF-12-052-01-CSM.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
RPMICellgro10-040http://cellgro.com ; keep on ice
FBSCellgro35-011-CVhttp://cellgro.com
tubes coniques de 50 mlFalcon14-432-22fischersci.com
40 μ ; m filterFalcon08-771-1fischersci.com
seringue de 5 mlBD14-823-35fischersci.com
ciseaux/pinces chirurgicauxRobozRS-5910roboz.com
PBSCellgroMT-21-030-CMhttp://cellgro.com ; keep on ice
trypan blueCellgroMT-25-900-CI
fischersci.com hémacytomètreHausser Scientifice  ;02-671-54  ;fischersci.com
Teinture vivante/morteLife TechnologiesL34957lieftechnologies.com
Logiciel FlowJoTreeStar, Incflowjo.com

Références

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