L'utilisation de l'essai de formation souple Agar colonie à identifier des inhibiteurs de Tumorigénicité dans les cellules cancéreuses du sein

Les cellules non transformées (normales) et transformées peuvent facilement proliférer dans une culture monocouche 2D. Cette forme de croissance cellulaire adhérente est très différente de celle qui se produit in vivo où, en l’absence de stimulation mitogénique, les cellules ne se divisent pas souvent rapidement au sein de leur microenvironnement. Le test de gélose molle, quant à lui, se distingue des systèmes de culture 2D car il quantifie la tumorigénicité en mesurant la capacité d’une cellule à proliférer et à former des colonies en suspension dans un gel d’agarose semi-solide¹. Dans ce contexte, les cellules non transformées sont incapables de se propager rapidement en l’absence d’ancrage à la matrice extracellulaire (MEC) et subissent une apoptose, un processus connu sous le nom d’anoïkis. En revanche, les cellules qui ont subi une transformation maligne perdent leur dépendance à l’ancrage en raison de l’activation de voies de signalisation telles que la phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt et Rac/Cdc42/PAK. Par conséquent, ces cellules sont capables de croître et de former des colonies dans la matrice de gélose molle semi-solide².

Une utilisation courante du test de gélose molle est de tester si des composés spécifiques, tels que les inhibiteurs de PADI, sont capables de supprimer la croissance tumorale in vitro. En général, le nombre de colonies ou la taille des colonies sont des lectures quantitatives de l’essai qui peuvent être comparées entre les groupes témoins et les groupes de traitement pour évaluer les différences de tumorigénicité cellulaire. Par conséquent, si l’on constate que la formation de colonies est inversement corrélée à l’augmentation de la concentration du médicament, on pourrait alors conclure que le médicament est un inhibiteur efficace de la tumorigénicité in vitro. D’autre part, si le médicament n’affecte pas la formation des colonies, soit il n’est pas à la dose appropriée, soit il n’est pas un inhibiteur tumorigène efficace. En plus d’utiliser un test de gélose douce pour tester l’effet antitumoral d’un médicament, ce test peut également être utilisé pour sonder la relation entre un gène spécifique et la tumorigenèse. Par exemple, l’effet de la suppression de l’expression de PADI2 sur la tumorigénicité peut être traité par un traitement par siRNA spécifique de PADI2.

Les PADI sont des enzymes dépendantes du calcium qui modifient post-traductionnellement les protéines en convertissant les résidus d’arginine chargés positivement en citrulline chargée neutre dans un processus connu sous le nom de citrullination ou déimination^3-5. Nous avons récemment découvert que la peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) peut fonctionner comme un nouveau biomarqueur du cancer du sein et que les inhibiteurs de PADI représentent des thérapies candidates pour les cancers du sein à un stade précoce⁶. Par exemple, nous avons précédemment démontré qu’un inhibiteur « pan-PADI », la Cl-amidine, supprime la prolifération des cellules cancéreuses du sein à l’aide de monocouches 2D et que l’inhibiteur supprime la croissance des sphéroïdes tumoraux 3D⁶. Dans ce rapport, nous étendons ces études et soulignons l’utilité du test de la gélose molle, en testant l’efficacité d’un nouvel inhibiteur de PADI, BB-CLA, dans la suppression de la croissance de MCF10DCIS colonies de cancer du sein⁷. Nous notons que nous avons utilisé MCF10DCIS cellules pour cette expérience parce qu’elles sont des dérivés oncogéniques de cellules humaines MCF10A non transformées et parce qu’elles contiennent des niveaux élevés de la protéine PADI2⁸ à l’état d’équilibre. Nous émettons l’hypothèse que l’activité enzymatique de PADI2 joue un rôle clé dans la tumorigénicité de cette lignée cellulaire et que l’inhibition de l’activité de PADI2 médiée par BB-CLA supprimera la progression du cancer.

1. Préparation de 3% de 2-hydroxyéthyle Agarose

1. Dans un endroit propre, sec 100 ml bouteille en verre, ajouter 0,9 g de 2-hydroxyethyl agarose (Agarose VII), suivie par 30 ml d'eau distillée.
2. Micro-ondes le mélange pendant 15 secondes et agiter doucement. Répétez cette étape au moins trois fois jusqu'à ce que la poudre d'agarose dissout complètement.
3. Autoclaver la bouteille contenant la solution pendant 15 min-.
4. Laisser la solution d'agarose à refroidir à température ambiante avant une nouvelle utilisation. Conserver la solution à la température ambiante.

2. Préparation de la couche inférieure: 0,6% gel d'agarose

1. Pré-réchauffer plusieurs 5 ml et 10 ml de pipettes dans un incubateur à 37 ° C pour empêcher la solidification de l'agarose dans la pipette lors de la manipulation.
2. Desserrer partiellement le couvercle de la bouteille et micro-ondes la solution d'agarose à pré-mesure de 3% de 2-hydroxyéthyle pendant 15 s. Ensuite, mélanger doucement la solution et micro-ondes pendant 15 secondes. ATTENTION: Soyez prudent lorsque vous tourner le agarosolution soi parce que la solution se lève lorsqu'il est exposé à l'air et peut déborder.
3. Si il ya gel solide résiduel dans la bouteille, micro-ondes quelques secondes de plus.
4. Gardez la bouteille contenant la solution d'agarose dans un bain d'eau à 45 ° au cours des prochaines étapes pour empêcher la solution d'agarose de se solidifier prématurément.
5. Médias MCF10DCIS chaud dans un bain d'eau à 37 C ° de. Remarque: MCF10DCIS support est constitué de DMEM / F12, de sérum de cheval à 5%, 5% de pénicilline streptomycine.
6. Transfert 3 ml de la solution d'agarose à 3% en utilisant les pipettes préchauffées dans un tube conique de 50 ml stérile.
7. Immédiatement ajouter 12 ml de milieu de MCF10DCIS chaudes et inverser doucement le tube conique de mélanger l'agarose avec les médias. Essayez de ne pas former des bulles comme il va interférer avec la colonie comptant plus tard.
8. Ajouter doucement 2 ml de ce mélange dans chaque puits d'une plaque de culture à 6 puits sans former de bulles d'air.
9. Incuber le 6 puits plaque de culture horizontally sur une surface plane à 4 ° C pendant 1 heure pour permettre au mélange de se solidifier.
10. Après le mélange se solidifie, placer la plaque dans un incubateur à 37 ° de 30 min. La couche inférieure est maintenant prêt à l'emploi.

3. Préparation de la couche contenant des cellules: 0,3% gel d'agarose

1. Trypsiniser les cellules MCF10DCIS et les diluer à une concentration cellulaire de 4 x 10 ⁴ / ml.
2. Prendre 2 ml de l'agarose à 3% en utilisant des pipettes préchauffées et transférer dans un tube conique de 50 ml stérile.
3. Immédiatement ajouter 8 ml de MCF10DCIS médias pour le tube conique et inverser doucement pour mélanger l'agarose avec les médias. Éviter la formation de bulles.
4. Prendre 2 ml de cellules MCF10DCIS (4 x 10 ⁴ / ml) et traiter avec BB-CLA (0 uM (DMSO) ou 1 um).
5. Dans une dilution 1: 1, le mélange des cellules avec le 0,6% d'agarose.
6. Prélever 1 ml du mélange de cellules-agarose et ajouter doucement sur la couche inférieure de la culture à 6 puits pfin (2 x 10 ⁴ cellules / ml).
7. Placer la plaque de culture à 6 puits à l'horizontale sur une surface plane à 4 ° C pendant au moins 15 minutes pour permettre à la couche de recouvrement se solidifier.
8. Après le mélange se solidifie, placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C pendant de une semaine avant d'ajouter la couche d'alimentation.

4. Préparation de la couche d'alimentation: 0,3% Agarose Gel

1. Micro-ondes de la solution d'agarose préfabriqué 3% de 2-hydroxyéthyle pendant 15 s. agiter doucement la solution et micro-ondes pendant 15 secondes.
2. Equilibrer la bouteille de solution de gélose dans un bain d'eau à 45 ° C.
3. Réchauffez les médias MCF10DCIS dans un bain d'eau à 37 ° C.
4. Mélanger 1 ml de solution d'agarose à 3% avec 9 ml de milieu de MCF10DCIS chaud dans un tube conique de 50 ml et inverser doucement pour mélanger l'agarose avec les médias. Éviter la formation de bulles d'air.
5. On traite le mélange avec BB-CLA (0 uM (DMSO) ou 1 pM).
6. Ajouter délicatement 1 ml de ce mélange (sans pourming bulles) dans chaque puits de la plaque de culture de 6 puits contenant le fond et couches molles.
7. Placer la plaque de culture à 6 puits à l'horizontale sur une surface plane à 4 ° C pendant au moins 15 minutes pour permettre au mélange de se solidifier.
8. Après la couche d'alimentation se solidifie, placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C.
9. Répétez cette procédure hebdomadaire alimentation en superposant 1 ml de solution d'agarose / moyen / traitement de 0,3% sur la couche d'alimentation existante pour reconstituer les cellules avec les nouveaux médias jusqu'à ce que la formation de colonies est observée. Remarque: Agar dans les couches molles et d'alimentation est très doux et, par conséquent, les éléments nutritifs ajoutés à partir de la couche d'alimentation seront facilement diffuser dans la couche contenant des cellules d'atteindre les cellules.

5. Collecte de données

1. Au bout de 2,5 semaines de croissance cellulaire dans la gélose molle, compter le nombre de colonies dans chaque puits en utilisant un microscope optique. Pour faciliter la quantification, imprimer une grille sur une transparence et fixer la grille pour laPlaque de 6 puits pour aider à localiser où les cellules sont en cours de comptage. Étant donné que la taille des colonies (telle que quantifiée par le diamètre de chaque colonie) varie prédéfinir une taille de colonie de référence pour déterminer les colonies qui sera reçu. Par exemple, inclure la taille des colonies de 70 um ou plus dans l'analyse de données.
2. Stocker les échantillons à 4 ° C pour empêcher la formation de colonies pour le comptage et futur. Sceller le 6 puits plaque de culture avec du Parafilm pour éviter les gels de se dessécher.

Le dosage de formation de colonies sur gélose molle peut être utilisée pour une large gamme d'applications documentant la tumorigénicité des cellules cancéreuses. Un avantage majeur de cette technique est que la matrice semi-solide favorise sélectivement la croissance des cellules qui peuvent proliférer d'une manière indépendante de l'ancrage. Cette caractéristique est principalement exposée par les cellules cancéreuses, mais pas par les cellules normales. Nous utilisons cette technique principalement pour tester l'efficacité de l'inhibition de la croissance tumorale par les médicaments et pour tester l'effet de la surexpression ou de l'épuisement de nos gènes d'intérêt, y compris les gènes PADI, sur la tumorigénicité de cellules de cancer du sein. Ici, nous avons évalué l'effet de BB-CLA sur l'inhibition tumorigène des cellules surexprimant PADI2-MCF10DCIS (Figure 1 et 2).

Les résultats montrent que BB-CLA inhibe de manière significative la formation de colonies MCF10DCIS dérivés de cellules. La figure 3 montre que, en présence d'un inhibiteur de PADI, t ici est à la fois une réduction de la formation de colonies et la taille des colonies, par rapport au témoin de DMSO. [Note:. CLA-BB a été dissous dans du DMSO et ainsi, le DMSO a été utilisé comme témoin] La taille des colonies pour BB-CLA MCF10DCIS cellules traitées étaient principalement dans la plage de 20 à 100 um tandis que la taille des colonies pour le DMSO témoin présente une plus grande gamme de 70 à 150 um après 2,5 semaines de croissance.

Les colonies de plus de 70 um ont été comptées et analysées (Figure 4). Il y avait une moyenne de 3 536 colonies dans le contrôle de DMSO alors que seulement 1 967 colonies ont été observées dans le groupe traité BB-CLA après 2,5 semaines de culture agar mou. Cela représente une diminution de 44% de la formation de colonies moyenne en présence de 1 uM BB-CLA, ce qui indique une inhibition significative tumorigène de cellules de cancer du sein (cellules MCF10DCIS) par l'inhibiteur de PADI.

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Figure 1. Structure chimique de BB-CLA.

Figure 2. Schéma Aperçu du Protocole pour la Formation de dosage souple Agar colonie. Chaque puits des plaques de culture à 6 puits a été revêtue d'un gel d'agarose à 0,6% (couche de fond). Un mélange de gel d'agarose à 0,3% contenant les cellules et MCF10DCIS soit l'inhibiteur BB-CLA (1 uM) ou du DMSO (témoin) a été ensuite déposé en couche sur le dessus du gel de 0,6%. Une fois par semaine, le mélange de gel d'agarose à 0,3% (contenant BB-CLA) a été ajouté sur le dessus de la couche douce. Après 2 à 4 semaines, la formation de colonies a été observée et a compté pour l'analyse des données. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. Images de Formation Colony dans les cellules MCF10DCIS BB-CLA-traités. MCF10DCIS cellules ont été cultivées dans de l'agar mou en présence (1 uM BB-CLA) ou l'absence de BB-CLA (0 uM DMSO). Après 2,5 semaines, des colonies ont été imagées en utilisant un microscope inversé pour des images à faible grossissement et un microscope optique pour des images à fort grossissement. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. Quantification des MCF10DCIS Nombre Colony après que les cellules de traitement BB-CLA. MCF10DCIS ont été cultivées dans de l'agar mou à différentes concentrations de BB-CLA (0 pm (DMSO) ou 1 uM BB-CLA). Après 2,5 semaines, des colonies individuelles plus grande eun 70 um ont été comptées. Les expériences ont été répétées quatre fois (n = 4). La signification statistique de la différence totale de comptage de cellule entre les échantillons témoins et traités a été déterminée par le test t de Student à deux échantillons (* p <0,005).

Les auteurs n’ont rien à divulguer.