Imagerie simultanée PET / IRM cérébrale Pendant souris hypoxie ischémie

Dans le monde entier, l'AVC est la deuxième principale cause de décès et une cause majeure d'invalidité ^1. La cascade d'événements biochimiques et physiologiques qui se produisent pendant et aiguë après un événement AVC survient rapidement et avec des implications pour la viabilité des tissus et, finalement, résultat ^2. Cerebral hypoxie ischémie (HI), ce qui conduit à encéphalopathie hypoxique-ischémique (HIE), est estimé à affecter jusqu'à 0,3% et 4% de la pleine terme et prématurés naissances, respectivement ^3,4. Le taux de mortalité chez les nourrissons atteints HIE est d'environ 15% à 20%. Dans 25% des victimes de HIE, les complications permanentes surviennent à la suite de la blessure, y compris un retard mental, des déficits moteurs, la paralysie cérébrale, l'épilepsie et ^3,4. Interventions thérapeutiques antérieures ont pas prouvé digne d'adoption en tant que norme de soins, et le consensus doit encore être atteint que les méthodes les plus avancées, basées sur l'hypothermie, réduisent efficacement la morbidité ^3,5. Autres questions of affirmation inclure la méthode d'administration de l'hypothermie et le patient sélection ^6. Ainsi, les stratégies pour la neuroprotection et neurorestoration sont encore une zone fertile pour la recherche ^7.

Des modèles de rats de HI cérébrale sont disponibles depuis les années 1960, et par la suite ont été adaptés à des souris ^8,9. En raison de la nature du modèle et l'emplacement de la ligature, il existe une variabilité inhérente à la solution due à la différence dans la circulation collatérale entre les animaux ^10. En conséquence, ces modèles ont tendance à être plus variables par rapport aux modèles similaires tels que l'occlusion de l'artère cérébrale moyenne (MCAo). Mesure en temps réel des changements physiologiques a été démontrée avec Doppler débitmétrie laser ainsi que la diffusion IRM pondérée ^11. La variabilité intra-artérielle observée dans les animaux d'écoulement cérébral pendant et immédiatement après une hypoxie, ainsi que des résultats aiguës telles que l'infarctus et le volume neurologiquedéficit, suggèrent que l'acquisition simultanée et la corrélation des données multimodales seraient bénéfiques.

Les progrès récents en simultanée la tomographie par émission de positons (TEP) et l'imagerie par résonance magnétique (IRM) ont permis à de nouvelles possibilités en matière d'imagerie préclinique ^12-14. Les avantages potentiels de ces hybrides, des systèmes combinés pour des applications précliniques ont été décrits dans la littérature ^15,16. Alors que de nombreuses questions précliniques peuvent être traitées par l'imagerie d'un séquentiellement animal individuel ou par imagerie groupes d'animaux séparés, certaines situations - par exemple, lorsque chaque instance d'un événement tel que la course se manifeste de manière unique, avec physiopathologie évolue rapidement - rendre souhaitable et même nécessaire à utiliser la mesure simultanée. La neuro-imagerie fonctionnelle fournit un tel exemple, où simultané 2-désoxy-2- ⁽¹⁸ F) fluoro-ᴅ-glucose ^([18 F] FDG) PET et blood-niveau de l'oxygène dépend (BOLD) IRM a été récemment démontré dans la stimulation des moustaches du rat ¹⁴ études.

Ici, nous démontrons simultanée imagerie PET / IRM lors de l'apparition d'un accident vasculaire cérébral hypoxique-ischémique dans lequel la physiologie du cerveau ne sont pas à l'état stable, mais est en train de changer rapidement et irréversiblement lors de provocation hypoxique. Les changements dans la diffusion de l'eau,, mesurée par IRM et quantifiée par le coefficient apparent de diffusion (ADC) dérivée de l'imagerie pondérée en diffusion (DWI), a été bien caractérisé d'accident vasculaire cérébral dans les données cliniques et précliniques ^17,18. Dans les modèles animaux tels que MCAo, diffusion de l'eau dans les tissus du cerveau touchée diminue rapidement en raison de la cascade conduisant à bioénergétique œdème cytotoxique ^18. Ces changements aigus de l'ADC sont également observées dans des modèles rongeurs d'hypoxie ischémie cérébrale ^{11,19. [18} F] FDG imagerie a été utilisé chez les patients victimes d'AVC à évaluer les changements dans gl localeucose ²⁰ métabolisme, et un petit nombre d'études in vivo sur des animaux ont également utilisé ^[18 F] FDG ^21, y compris dans le modèle d'ischémie cérébrale, l'hypoxie ^22. En général, ces études montrent une diminution utilisation du glucose dans les régions ischémiques, bien qu'une étude utilisant un modèle de reperfusion n'a pas trouvé de corrélation de ces changements métaboliques du myocarde avec le développement de ²³ plus tard. Ceci est en contraste avec les changements de diffusion qui ont été associés avec le noyau endommagé de manière irréversible ^21. Ainsi, il est important d'être en mesure d'obtenir de l'information complémentaire dérivé de ^[18 F] FDG PET et DWI de manière simultanée lors de l'évolution de la course, car cela est susceptible de donner des informations pertinentes sur l'évolution de la blessure et l'impact de la interventions thérapeutiques. La méthode que nous décrivons ici est prête facilement à utiliser avec une variété de traceurs TEP et IRM séquences. Par exemple, ^[15 O] H _{2 O} PETimagerie avec CFA et images de perfusion pondérée (PWI) à partir de l'IRM peut être utilisée pour explorer davantage le développement de la pénombre ischémique et valider les techniques actuelles dans le domaine de l'imagerie de l'AVC.

Toutes les manipulations et les procédures animaux décrits ici, et selon la recherche sur les animaux: Relevant expériences in vivo (arriver) des lignes directrices, ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par l'Association pour l'évaluation de l'accréditation du laboratoire Animal Care (AAALAC) International accrédité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité à l'Université de Californie, Davis. La chirurgie appropriée ne devrait pas entraîner des signes de douleur ou de l'inconfort chez l'animal, mais des mesures appropriées doivent être prises si ces signes sont observés, y compris l'administration d'analgésiques ou, dans certains cas, l'euthanasie. Le côté droit des animaux a été choisie arbitrairement pour la procédure unilatérale décrit.

1. unilatérale de l'artère carotide commune (CCA) ligature

1. Préparer champ stérile avec des outils chirurgicaux et les matériaux stérilisés positionnés convenablement. Assurer coussin chauffant est chauffé à 37 ° C avec sonde de température placée solidement sur le pavé. & #160; Veillez à utiliser un champ stérile pour couvrir le site chirurgical.
2. Anesthésier animale (isoflurane, 1-3% dans l'air à 0,5-1 L / min), et de placer l'animal dans une position couchée avec la queue opposée. Vérifiez anesthésie en pinçant l'orteil - ce qui devrait susciter aucune réaction si l'animal est correctement anesthésié. Appliquer une pommade ophtalmique pour les yeux.
3. Appliquer la crème d'épilation au bas du cou à la zone supérieure de la poitrine en utilisant 1-2 des cotons-tiges. Attendez 1-3 min, puis enlever les poils et crème à l'aide de gaze ou d'alcool tampons humides. Swab zone d'incision avec de la bétadine de manière circulaire de l'intérieur vers l'extérieur, puis se transformer en gants chirurgicaux stériles.
4. Avec des ciseaux chirurgicaux, faire une incision d'environ 1 cm le long de la ligne médiane de la partie inférieure du cou. Soigneusement séparer la peau externe de entourant fascia l'aide de ciseaux chirurgicaux.
5. L'utilisation de deux McPherson pince iris micro de suture, séparer le droit artère carotide commune de fascia, en prenant soin d'éviter les veines et les troubles de dommageablesbing le nerf vague.
6. Utilisation de la pince sur la droite, extérioriser le droit CCA dans une position stable. Appliquer plusieurs gouttes de solution saline pour éviter le dessèchement. Passer une longueur appropriée (2-3 cm) de soie 6-0 suture sous le droit CCA, et ligaturer en utilisant un noeud double carré. Eventuellement, ligaturer à nouveau en utilisant une seconde longueur de fil de suture en soie 6-0.
7. Repositionner droit CCA et nettoyer l'excès de liquide de l'ouverture à l'aide d'une éponge stérile basculé écouvillon. Fermer l'incision avec une suture de soie 6-0. Appliquer la lidocaïne topique à 7 mg / kg.
8. Permettre à l'animal de se remettre de l'anesthésie ambulatoire jusqu'à (environ 30 min) et d'effectuer le suivi post-opératoire jusqu'à ce que l'animal est prêt pour l'imagerie.

2. Préparation pour l'imagerie: système et le matériel Vérifie

1. Mettre en place le matériel et les logiciels pour les systèmes d'IRM et PET et de vérifier leur fonctionnalité comme suit. Assurer que toutes les connexions physiques sont sécurisés et les paramètres du logiciel sont choisis de manière appropriée.
   1. Système de montage PET intérieur de l'alésage IRM, en alignant le domaine TEP et l'IRM de vision (FOV) centres utilisant des décalages axiaux connus. Montez la bobine IRM intérieur de l'alésage du système PET et centrer la bobine avec le système PET et centres d'aimants IRM.
   2. Tournez sur l'électronique de puissance et de PET tension de polarisation (Remarque: étapes varient selon l'appareil). Effectuez un rapide (5 min) numérisation à l'aide d'un cylindre de ⁶⁸ Ge et vérifier le sinogramme résultant d'assurer tous les détecteurs sont opérationnels.
   3. Acquérir éventuellement les données à utiliser pour une matrice de transformation PET / IRM à des fins de co-inscription: Remplir un fantôme en trois dimensions (par exemple, trois sphères remplies) avec 200 uCi de ¹⁸ solution aqueuse F et acquérir pour 15 min avec le PET. Acquérir des données IRM anatomique: dans la fenêtre de contrôle de numérisation, sélectionnez le multi-coupes séquence multi-écho (MPME) (voir le tableau 1
2. Vérifiez les paramètres de pompe à perfusion et le fonctionnement. Régler la pompe à 4,44 pi par minute, ce qui en 45 min de perfusion constante délivre un volume total de 200 pi, la limite recommandée typique pour injection iv en 20 g animal.
3. Vérifiez le fonctionnement de chauffage et de confirmer que la sortie de la température est suffisante pour maintenir l'animal au chaud (37 ° C). Vérifiez que la température et la surveillance respiratoire est opérationnel en préparation pour le placement des animaux sur le lit de l'animal.
4. Vérifier le fonctionnement des O _{2 et} N ₂ débitmètres (0,5 L / min: O ₂ à 57,2 mg / min et N ₂ à 0,575 g / min) en alimentant à la fois avec la source d'air comprimé hors et O _{2 et} N ₂ sources de suite. Pour éviter le risque d'endommager les débitmètres, ne les mettez pas sans pression d'entrée suffisante.
5. Veiller à ce que l'isoflurane vaporizer est suffisamment rempli. Avant imagerie, commencer flux d'isoflurane à 1-2% et de 0,5 à 1 L / min.
6. Préparer lit animal en veillant à ce que l'anesthésie, pad respiratoires, et les systèmes de chauffage sont positionnés en toute sécurité et fonctionnel. Pour une précision de co-enregistrement supplémentaire PET / IRM, marqueurs de référence (par exemple, des tubes capillaires remplis de radiotraceurs à une concentration similaire à celle injectée pour l'imagerie) peuvent être fixés sur le lit de l'animal dans le champ de vision.

3. Imaging flux de travail

Après toutes les vérifications de l'équipement nécessaires sont terminés, passez à l'imagerie comme suit:

1. Anesthésier l'animal avec de l'isoflurane et insérer un cathéter dans la veine caudale (28 aiguille G, PE-10 tubes moins de 5 cm) rempli de solution saline héparinée (0,5 ml d'héparine, 1000 USP / ml, dans 10 ml de solution saline). Le réchauffement de l'animal et / ou de la queue peut améliorer la précision cathéter d'insertion. Eventuellement placer une goutte de colle à base de cyanoacrylate sur le site d'insertionpour sécuriser la ligne IV.
2. Transfert de l'animal à la chambre d'aliments préparés. Assurez-vous que la tête de l'animal est sécurisé, avec les incisives supérieures fixées par la barre et de l'oreille barres de dents en place si utilisé.
3. Appliquer une pommade ophtalmique pour les yeux pour éviter le dessèchement. Insérez thermomètre à sonde rectale. Veiller à ce que la température et les lectures de respiration sont fonctionnels.
4. Tracer la dose de traceur radioactif (environ 600 uCi dans 200 ul) à injecter dans héparinisé tubulure PE-10 de longueur appropriée - environ 3 m de tube PE-10 et un volume de 200 ul. Branchez une extrémité de ce tube à la seringue de la pompe à perfusion, et l'autre à la ligne de cathéter veine de la queue, en prenant soin de ne pas créer des perforations dans le tube.
5. Faire glisser le lit des animaux vers l'avant dans l'alésage de l'aimant, en veillant à ne pas perturber le positionnement de la bobine d'IRM et des lignes ou des câbles, en particulier le tube d'anesthésie. Assurez-vous que le centre du cerveau est aligné avec les centres des MBobine RI, système de PET, et l'aimant IRM.
6. Effectuez l'accord et l'appariement de la bobine IRM en tournant les boutons d'ajustement sur ​​la bobine, minimisant impédance (vérifier les spécifications de la bobine) et la fréquence (300 MHz ^pendant 1 h à 7 Tesla) inadéquations en observant l'affichage de la puissance préamplificateur haute.
7. (IRM) Après avoir accordé et l'appariement, acquérir une image de boy-scout: sélectionner une séquence de TriPilot RARE et exécuter la séquence de la fenêtre de contrôle de numérisation. Vérifiez le positionnement de l'animal, en répétant les étapes 3.5 et 3.6 que nécessaire. Réinitialiser cales à la valeur zéro.
8. (IRM) Acquérir, une analyse localisée du point résolue spectroscopique (PRESS) dans un volume dans le cerveau: Exécuter une séquence de presse (voir tableau 1) dans un volume rectangulaire avec des dimensions de 3,9 mm × 6 mm x 9 mm. Vérifiez la largeur de la ligne d'eau en utilisant la macro commande CalcLineWidth. Si la largeur à mi-hauteur (LMH) valeur est acceptable (par exemple, 0,2 ppm), passez à l'étape 3.10. Sinon, passez à l'étape 3.9.
9. (IRM) Acquérir une carte de terrain: Exécuter une séquence de FieldMap (voir le tableau 1). Utilisez les données résultant d'un multi-angle de projection cale (MAPSHIM) en exécutant la macro commande MAPSHIM et en sélectionnant linéaire et second ordre (z ²⁾ des ajustements locaux. Répétez l'étape 3.8.
10. (IRM) Placez le plan de tranche pour l'analyse de CFA (voir le tableau 1): en utilisant l'éditeur de géométrie, veiller à ce que l'acquisition FOV est positionné pour acquérir le volume souhaité d'intérêt dans le cerveau. Si le plan de tranche obtenue est aligné comme vous le souhaitez, copier ce plan de tranche dans la fenêtre de contrôle de numérisation pour toutes les analyses en matière de CFA. Commencez acquisition.
11. (PET) Avec l'acquisition PET préparé et prêt à commencer, démarrer la pompe de perfusion. Après le délai pré-déterminé dans lequel la solution saline du cathéter a été injecté, commencer l'acquisition PET (voir le tableau 1) afin de capturer l'entrée de radiotraceurs. Surveiller le taux de comptage et de chercher augmentation progressiveen chiffres indicatifs d'une injection réussie.
12. Après 10-15 minutes, amorcer la concurrente de provocation hypoxique à l'étape 3.12. Pour lancer provocation hypoxique, éteignez flux d'air médical et immédiatement l'alimentation sur O _{2 et} N ₂ débitmètres avec les paramètres prédéterminés pour fournir 8% d'oxygène et 92% d'azote, et de réduire l'isoflurane à 0,8%. Ne mettez pas débitmètres sans pression d'entrée.
13. (IRM) Dans le même temps que l'étape 3.12, commencer acquisition DWI préparé à l'étape 3.10 (scan "H1").
14. (IRM) Begin acquisition DWI (scan "H2"), préparé dans l'étape 3.10, immédiatement après la numérisation H1 est terminée. Fin provocation hypoxique par la mise hors tension débitmètres, rétablir le flux d'air médical, et le retour concentration isoflurane à une valeur appropriée en fonction de surveillance physiologique.
15. (IRM) acquérir un DWI post-scan hypoxie préparé à l'étape 3.10. Éteignez la pompe à perfusion après cette analyse terminée.
16. (IRM) acquérir anatomical images dans le plan sagittal et axial. Dans la fenêtre de contrôle de numérisation - sélectionnez la séquence des MPME (voir le tableau 1). Utilisation de l'éditeur Geometry, veiller à ce que l'acquisition FOV recouvre le cerveau.
17. Retirer animal, revenir à la cage quand ambulatoires et surveiller les signes de la morbidité, l'euthanasie, si nécessaire avec l'administration de CO ₂ suivie par dislocation cervicale comme méthode secondaire.

La figure 1 montre le résultat d'une ligature correcte de la artère carotide commune, avant la fermeture de la plaie avec 6-0 suture de soie.

Dans cette méthode, les données obtenues à partir de l'imagerie est fortement tributaire de la disposition temporelle de l'expérience, qui à son tour dicte et est également dictée par les limites expérimentales y compris les systèmes d'acquisition d'images et de configuration de l'équipement. Ceux-ci et d'autres considérations sont explorées dans la section Discussion. Avec le protocole décrit ici, la configuration physique de l'équipement (figure 2A) permet d'acquisition d'images multi-modale ininterrompue avant, pendant, et après (figure 2B), d'introduction rapide de la provocation hypoxique (figure 2C).

Dans ce modèle animal, comme avec de nombreux modèles d'AVC ischémiques, les changements dans la diffusion sont détectables rapidement après l'insulte (voir la figure 3A pour une représentatexemple ive). Comme notre méthode ne change pas fondamentalement le modèle HI cérébrale, les changements de diffusion peut être reproduite de manière robuste - la figure 3B montre les différences en pourcentage l'évolution dans ADC z (ADC dans la direction z) entre le controlatéral (non occlus, à gauche) et ipsilatéral (occlus, droite) côtés du cerveau, LR%, (n = 6 pour la numérisation H2, n = 5 pour tous les autres points de temps). Comme prévu, les valeurs de l'ADC sur le côté occlus de la diminution de cerveau comme le dommage progresse. La figure 3C montre un exemple tranche coronale à partir de la séquence DWI, ainsi que d'une coupe sagittale montrant l'étendue axiale limitée de l'angle de champ (8 mm) de la séquence utilisée. Détails concernant les limitations imposées à la séquence imagerie écho planar (EPI) utilisé pour CFA sont décrits dans la section Discussion. En bref, la qualité de l'image obtenue avec le cadre proposé d'imagerie dépend des caractéristiques de performance du système, et EPI-fondé séquences de CFA en particular peut exposer sous-optimale des conditions matérielles ou paramètres d'acquisition (voir la figure 5B). Que des différences significatives ont été observées entre les valeurs de base et ultérieures ADC% LR (p <0,05, t non apparié -test) suggère que cette est un paramètre robuste pour interroger l'aide de notre dispositif expérimental.

En même temps que les changements dans l'ADC, les différences hémisphériques ont été observées dans l'absorption de [18F] FDG après le début de la provocation hypoxique et H2 pendant de balayage (11% de la différence moyenne LR, n = 3). Dans deux cas sur trois, homolatéral absorption [18 F] FDG a diminué par rapport à l'absorption controlatéral après hypoxie (voir la figure 4 pour un exemple représentatif), bien que ce ne fut pas le cas dans tous les cas, probablement en raison de la variabilité des animaux. La figure 5A montre un exemple où la différence relative de [18F] FDG entre les deux hémisphères n'a pas été correctement avec un animal (bleu). FigureLa figure 5A montre également un exemple dans lequel, tandis que [18 F] FDG a été comme prévu suivant l'hypoxie, l'animal est mort à la fin du balayage H2.

Figure 1. Exemple de la droite artère carotide commune ligaturé avec 6-0 suture de soie. L'animal est couchée sur le dos, la tête dirigée vers le bas de l'image. La zone autour de l'incision a été épilé, et l'incision est maintenue ouverte avec des pinces pour la visualisation. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. (A) diagramme représentant de la disposition physique des équipement. L'insert de PET est positionné dans l'alésage de l'aimant, la bobine et l'IRM est à son tour placé dans l'alésage de l'insert de PET. Le lit des animaux, avec une surveillance physiologique (tampon de la respiration non représenté), la ligne d'anesthésie, et IV cathéter fonctionne dans le trou comme indiqué. L'anneau en pointillés représente une marge de sécurité pour le champ magnétique parasite -. Il peut être nécessaire de placer l'équipement avec des composants magnétiques en dehors de cette région, mais au sein de la salle d'IRM (après toutes les précautions de sécurité) (B) Schéma récapitulatif de la progression temporelle de l'expérience . (C) Les résultats représentatifs de premiers changements dans le niveau 2 O livrés à l'animal immédiatement après le début de la contestation de l'hypoxie. De environ 1 min, des conditions hypoxiques peuvent être réalisés, tel que mesuré par un compteur O 2 placé dans une boîte d'induction de 0,5 L (non représentée), en ligne avec le système d'anesthésie. rge.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. (A) Exemple de paramétriques ADC z cartes acquises au départ et par post-hypoxie. (B) Terrain montrant% différence de LR dans ADC z du départ à la post-hypoxie. Les astérisques indiquent une différence significative (p <0,05, t non apparié -test) par rapport à la valeur initiale. Les barres d'erreur représentent +/- un écart-type. (C) Exemple d'une acquisition EPI-DWI (axiales, sagittales, et des vues 3D de montrer l'étendue de la FOV). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

/ftp_upload/52728/52728fig4.jpg "/>
Figure 4. (A) de la tranche coronale et transversale d'un animal présentant [18 F] FDG d'absorption. L'image PET est au premier plan et est inscrit et fusionnée avec une image IRM anatomique dans le fond pour la visualisation. Les données de PET sont additionnées pour tous les cadres. (B) Dans le même animal, [18 F] FDG courbe d'activité de temps pour l'hémisphère controlatéral (bleu) et l'hémisphère ipsilatéral (rouge). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure .

5. courbes (A) de l'activité de temps de la figure de controlatéral (solide) et ipsilatéral (en pointillés) hémisphère [18 F] FDG - montré sur le même axe sont des exemples d'un inattendu temps [18 F] FDGcourbe d'activité (en bleu) et la mort des animaux à la fin de H2 (à 45 min, vert). (B) ghosting artefacts dus à potentiels défauts RF basée sur le matériel. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1. IRM paramètres de la séquence d'impulsions pour les analyses décrites dans le protocole, et l'acquisition PET, histogramme, et les paramètres de reconstruction.

JM et SW sont des employés de Genentech.