Deux photons imagerie intracellulaire de Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Manipulation et production d&#39;oxyde nitrique endothélial et en cellules de muscle lisse d&#39;un Rat aorte isolée

Bradley T. Endres; Alexander Staruschenko; Marie Schulte; Aron M. Geurts; Oleg Palygin

doi:10.3791/52734

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Article de méthode

Deux photons imagerie intracellulaire de Ca

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DOI :

10.3791/52734

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10 juin 2015

Bradley T. Endres¹^,² , Alexander Staruschenko¹ , Marie Schulte⁴ , Aron M. Geurts¹^,²^,³ , Oleg Palygin¹

¹Departments of Physiology, Medical College of Wisconsin, ²Human and Molecular Genetics Center, Medical College of Wisconsin, ³Cardiovascular Center, Medical College of Wisconsin, ⁴Blood Research Institute of Wisconsin

Dans cet article

Résumé

La fonction des cellules vasculaires dépend de l’activité des messagers intracellulaires. Il s’agit d’une méthode d’imagerie ex vivo à deux photons qui permet de mesurer les niveaux intracellulaires de calcium et d’oxyde nitrique en réponse à des stimuli physiologiques et pharmacologiques dans les cellules endothéliales et musculaires lisses individuelles d’une aorte isolée.

Résumé

Le calcium est un régulateur important de nombreux processus physiologiques dans les tissus vasculaires. La plupart des fonctions endothéliales et musculaires lisses dépendent fortement des changements de calcium intracellulaire ([Ca ^2+] _i) et de l'oxyde nitrique (NO). Afin de comprendre comment [Ca ^2+] _i, NO et des molécules en aval sont traitées par un vaisseau sanguin en réponse à des vasoconstricteurs et vasodilatateurs, nous avons développé une nouvelle technique qui applique calcium-étiquetage (ou NO-étiquetage) colorants comportant deux microscopie photonique à mesurer la manipulation de calcium (ou de la production de NO) dans les vaisseaux sanguins isolés. Décrit ici est une procédure détaillée étape par étape qui montre comment isoler une aorte d'un rat, l'étiquette de calcium ou de NO dans les cellules endothéliales ou musculaires lisses, et l'image transitoires de calcium (ou la production de NO) à l'aide d'un microscope à deux photons suivante physiologique ou des stimuli pharmacologiques. Les avantages de l'utilisation de la méthode sont multiples: 1) il est possible d'simultanély mesurer les transitoires de calcium dans les cellules endothéliales et les cellules des muscles lisses en réponse à différents stimuli; 2) elle permet de cellules endotheliales de l'image et des cellules musculaires lisses dans leur milieu d'origine; 3) cette méthode est très sensible au calcium intracellulaire ou pas de changements et génère des images à haute résolution pour des mesures précises; et 4) approche décrite peut être appliquée à la mesure d'autres molécules, telles que les espèces réactives de l'oxygène. En résumé, l'application de deux microscopie biphotonique d'émission laser pour contrôler les transitoires de calcium et la production de NO dans les endothéliales et musculaires lisses des cellules d'un vaisseau sanguin isolé a fourni des données quantitatives de haute qualité et de la promotion de notre compréhension des mécanismes de régulation de la fonction vasculaire.

Introduction

Le calcium est un second messager fondamental à l'intérieur de cellules vasculaires tels que des cellules endotheliales et des muscles lisses. Il est le stimulus primaire pour la contraction vasculaire et joue un rôle majeur dans la dilatation vasculaire, y compris ses effets par le biais de la production de NO dans le endothélium. En raison des limites des technologies d'imagerie, il a été pratiquement impossible d'observer la manipulation de calcium dans le récipient intact. Le développement de deux systèmes d'imagerie photonique et la création de nouvelles calcium ou pas de colorants d'étiquetage, il est possible de l'image à une profondeur....