Analyse quantitative des défauts d'escalade dans un modèle drosophile de maladies neurodégénératives

Résumé

Nous présentons un test de géotaxie négative optimisé, peu coûteux et fiable chez Drosophila melanogaster comme modèle pour les troubles neurodégénératifs. Étant plus sensible aux anomalies locomotrices bénignes, ce test aidera à dépister les interactions génétiques potentielles et les cibles médicamenteuses.

Résumé

Locomotive défauts résultant de maladies neurodégénératives peut être un symptôme d'apparition tardive de la maladie, après des années de dégénérescence infraclinique, et des stratégies ainsi actuels de traitement thérapeutique ne sont pas curatifs. Grâce à l'utilisation de séquençage d'exome ensemble, un nombre croissant de gènes ont été identifiés à jouer un rôle dans la locomotion humaine. Malgré l'identification de ces gènes, on ne sait pas comment ces gènes sont essentiels pour le fonctionnement de la locomotive normale. Par conséquent, un test fiable, qui utilise des organismes modèles pour élucider le rôle de ces gènes afin d'identifier de nouvelles cibles d'intérêt thérapeutique, est plus que jamais nécessaire. Nous avons conçu une version sensibilisée de l'essai de géotaxie négatifs qui permet la détection de défauts plus douces antérieure et a la capacité d'évaluer ces défauts au cours du temps. Le dosage est réalisé dans un cylindre gradué de verre, qui est scellée avec un film de barrière cire. En augmentant la distance de seuil pour être grimpé à 17,5 cm et en augmentant la durée de l'expérience à 2 min, nous avons observé une plus grande sensibilité dans la détection des dysfonctionnements de mobilité douces. Le dosage est rentable et ne nécessite pas une formation approfondie pour obtenir des résultats hautement reproductibles. Cela en fait une excellente technique pour le criblage de médicaments candidats dans des mutants de drosophile avec des défauts de locomotion.

Introduction

Maladies neurodégénératives dévastatrices telles que la maladie de Parkinson, la sclérose latérale amyotrophique, et paraplégie spastique familiale sont de plus en plus reconnus. Malheureusement, la plupart de ces maladies neurodégénératives sont encore sans traitements. L'utilisation clinique généralisée de tests génétiques impartiales pangénomiques comme le séquençage de l'exome ensemble a conduit à un nombre croissant de gènes étant impliqué dans les troubles locomoteurs humaines. Malgré ces progrès, la progression pathologique du début à la fin des étapes, reste insaisissable dans ces troubles. Drosophila fournit un avec les outils génétiques pour étudier exigence de gènes d'une manière spatio-temporelle contrôlée. En outre, la drosophile est avéré utile pour le criblage de médicaments pour les troubles neurologiques comme la maladie de Parkinson ^1, la maladie d'Alzheimer ^2, déficience intellectuelle et l'épilepsie ^{3,4 5,6} entre autres. Notre objectif était de développer une solution rentableet le dosage fiable qui permettrait analyse à haut débit qui serait encore assez sensible pour détecter de petits changements dans les performances du moteur.

Il existe plusieurs tests utilisés pour quantifier les effets de la mutation génétique et / ou de l'état de l'environnement sur ​​le comportement d'escalade drosophile. La plupart des essais capitaliser sur la tendance naturelle de mouches à grimper, connus sous le nom géotaxie négative, ou le dosage de l'escalade. ⁷ Benzer suggéré en 1967 que l'appareil à contre-courant utilisé pour l'étude de phototaxie pourrait également être utilisé pour étudier gravitaxis. Depuis lors, Ganetsky ⁸ et beaucoup d'autres ^{9 -12} ont construit sur ​​le dosage initial. Le principe est de placer un nombre connu de mouches dans un flacon et appuyez sur le flacon fermement contre une surface dure, provoquant les mouches tombent au fond du flacon. Comme il est un comportement inné, vol tenteront de grimper au sommet de la fiole, par opposition à la gravité. Cet essai est quantitative et mesures combien de mouches ont grimpé passé un marqueur sur le flacon pendant une période de temps allouée. Mesure de la vitesse à la place du nombre total de mouches escalade est devenue un paramètre fiable et montré des défauts dans les cas où le nombre de critères de mouches était non significatif ^13.

Le test d'escalade se sont révélées utiles dans l'étude de nombreux troubles neurodégénératifs, y compris la maladie de Parkinson ^14. Cependant, nous avons constaté que les défauts de locomotive peuvent ne pas être détectable au moment où la neurodégénérescence est déjà considérée dans les études pathologiques ^14. Ainsi, l'utilisation du dosage traditionnel peut limiter la capacité d'étudier les stades précoces de la pathogenèse de la maladie. L'apparition de défauts de locomotives durant les derniers stades de la pathologie peut refléter une maladie dont la progression est trop avancé pour le sauvetage complète.

Cela soulève un problème potentiel avec la sensibilité de l'essai d'escalade traditionnelle. L'incapacité potentielle de la traditiontional escalade test pour détecter les défauts de locomotives doux peut être attribuée à la hauteur à laquelle les mouches sont tenus de grimper. Les traditionnels dosage ^15,16 mesures le nombre de mouches à monter avec succès sur une hauteur de 2 à 5 cm dans 10 à 20 sec.

Protocole

Recherche sur Drosophila melanogaster était en conformité avec l'Université des lignes directrices de recherche de l'Alberta.

1. Fly Collection

1. Recueillir 20 mouches utilisant le CO _{2 (g)} l'anesthésie et le placer dans un flacon de collection 25 mm x 95 mm contenant de la nourriture.
2. Entreposer les flacons contenant des mouches horizontalement pour éviter le piégeage des mouches dans les liquides qui peuvent accumuler dans le fond du flacon.
3. Incuber mouches pendant au moins 21 heures à 22 ° C à 45% d'humidité dans un incubateur pendant environ pendant 15 heures. Régler l'incubateur avec une lumière de 12 h: cycle d'obscurité.

2. Escalade Assay

1. Le lendemain matin, transférer 20 mouches d'un seul flacon en verre de 250 ml graduée. Marquer la position du cylindre pour le maintenir constant de tous les jours. Utilisez un cylindre de verre par génotype pour éviter la contamination croisée entre les génotypes. Laver à la fin de chaque expérience et roliter eux entre les génotypes.
   1. Mener des expériences à la lumière ambiante (ou la lumière rouge si il ya un défaut potentiel de la vision) à la température et l'humidité de 22 ° C et 40% respectivement. Pour éviter rythme circadien confondre, toujours effectuer des expériences dans le même temps de la journée.
2. Sceller la partie supérieure du cylindre avec un film barrière (film de cire) pour empêcher la fuite de tout vol (figure 2).
3. Mettre en place la caméra vidéo sur un trépied. appareil photo Focus sur la ligne 190 ml de 250 ml graduée (17,5 cm).
4. Compter le nombre de mouches mortes au fond du cylindre et dans les flacons de produits alimentaires. Inscrire ce numéro que le taux de mortalité.
5. Très tapoter légèrement le cylindre contre un coussin en mousse à cellules fermées à plusieurs reprises avec une force suffisante pour déplacer les mouches à la surface inférieure intérieure. Appuyez sur 5 - 10 fois tout en utilisant l'autre main pour appuyer dossier sur l'appareil photo.
6. Appuyez sur le bouton "Enregistrer" sur la caméra.
7. Lancer la video enregistrement de la caméra et tapez sur le cylindre à six reprises dans un modèle non-rythmique distincte.
8. Mener chaque essai pendant 2 min à partir du moment les mouches sont exploitées dernière et enregistrer le nombre de mouches qui traversent la hauteur de 17,5 cm (190 ml) à chaque point de temps choisi (de quantifier toutes les 10 secondes). Remarque: Le marquage sur le cylindre ml variera d'un modèle de cylindre à l'autre en fonction du diamètre. Pour éviter toute erreur, mesurer la hauteur sur chaque bouteille utilisée.
9. Une fois le procès terminé, disposer de mouches dans 95% d'éthanol.
10. Répétez les étapes 2.1 à 2.9 jusqu'à ce que toutes les répétitions ont été testés avec des mouches frais à chaque fois.
    Note: Bien que 5 répétitions peuvent être assez avec une mutation ayant un effet important sur la locomotion, 10 répétitions biologiques de 20 200 mouches (mouches) est recommandée pour détecter des différences plus petites.
11. À la fin de l'expérience, se laver les cylindres dans le lave-vaisselle de laboratoire et O sec / N pour être réutilisé.

3. Analyse

1. Analyze vidéos de chaque volent procès. Chaque 10 secondes, enregistrer le nombre total de mouches qui passent la ligne de cible.
   1. Si une mouche redescend ou tombe, fiche qui volent comme -1 et compter la prochaine volée de franchir la ligne de cible que le même numéro que la mouche qui est remonté vers le bas ou est tombé. Par exemple, si le 15 ^ème mouche tombe en dessous de la ligne de cible, la prochaine volée à franchir la ligne (16 ^e volent) est considéré comme le 15 ^ème volée et non pas le 16 ^ème.
2. Soustraire la mortalité à partir du nombre total de mouches (20) pour obtenir le nombre de mouches qui restent dans le procès. A chaque point de temps, obtenir la fraction de mouches au-dessus de la ligne de cible.
3. Complot chaque pourcentage à chaque point de temps (voir Figure 3).
4. Analyser la performance au point de données 120 sec et effectuer test t de Student lorsque 2 groupes sont présents ou ANOVA et un post-test pour les comparaisons multiples (avec modification de Bonferroni pour planifiées et non planifiées Tukey pour comparisons). Le Kolmogorov-Smirnov teste ¹⁷ est également effectuée pour vérifier la normalité et variance égale, mais aussi de comparer les distributions du groupe mutant à la commande.
5. Pour présenter les données sur le vieillissement, tracer le pourcentage de mouches grimper à 120 sec avec des mouches de différents âges (2 jours, 1 semaine, 2 semaines) pour voir si il ya un déficit progressif (Figure 4).

Résultats

Escalade est un comportement solide et reproductible. En effet, un jour de vieilles mouches de type sauvage atteindre la performance d'escalade de distance de la cible rapidement (25 - 30 sec). Mouches mutantes présentent une gamme de performances de légère (ou retardée) pour compléter l'incapacité de monter à la cible. Nous illustrons cette ici avec deux allèles mutants différents. Le premier est un allèle sévère de la spastin génique provoquée par une deletion complète du gène de spas spastin ^{(5,75) 18.} Dan...

Discussion

Drosophila a déjà prouvé être un excellent modèle dans la maladie ¹⁴ et d'autres conditions neurodégénératives ^{de 1,2} de Parkinson. En plus des outils génétiques disponibles chez la drosophile, son génome est hautement conservé de gènes impliqués dans des troubles neurologiques ^19. L'avènement des méthodes de dépistage génétique larges génome (y compris le séquençage de l'exome ensemble) est susceptible de continuer à fournir une plus grande liste de gènes c...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
		de drosophile	Les souches sont sélectionnées en fonction des expériences. La température et l’humidité dans la pièce et dans l’incubateur doivent être contrôlées et constantes pour éviter que les mouches ne soient trop statiques ou trop humides.
		N’importe quel caméscope numérique fera l’affaire. Assurez-vous qu’ils peuvent faire la mise au point sur un objet proche.
Cylindre gradué	Kimble	20028W	Différents modèles de cylindre gradué peuvent avoir un diamètre différent. Il est donc important de mesurer la hauteur.
Ordinateur N’importe			quel modèle fera l’affaire. Nous avons utilisé l’ordinateur pour surveiller l’escalade des mouches et enregistrer le nombre de mouches à chaque point temporel.