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Comet Assay comme une mesure indirecte de stress oxydatif systémique

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DOI :

10.3791/52763

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22 mai 2015

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1Department of Ophthalmology, University of Basel, 2Department of Biomedicine, University of Basel

Dans cet article

Résumé

Test des comètes mesure cassures de l'ADN induites par différents facteurs. Si tous les facteurs (sauf stress oxydatif) causant des dommages de l'ADN sont maintenus constants, le montant des dommages à l'ADN est un bon paramètre indirect de stress oxydatif. L'objectif de ce protocole est d'utiliser test des comètes pour la mesure indirecte du stress oxydatif.

Résumé

Organismes eucaryotes supérieurs ne peuvent pas vivre sans oxygène; Pourtant, paradoxalement, l'oxygène peut être nocif pour eux. La molécule d'oxygène est chimiquement relativement inerte parce qu'il a deux électrons non appariés, situés dans différents pi * orbitales anti-collage. Ces deux électrons ont des spins parallèles, ce qui signifie qu'ils tournent dans la même direction autour de leurs propres axes. Ceci est la raison pour laquelle la molécule d'oxygène est peu réactif. L'activation de l'oxygène peut se produire par deux mécanismes différents; soit par réduction par l'intermédiaire d'un électron à la fois (réduction monovalent), ou par l'absorption d'une énergie suffisante pour inverser la rotation de l'un des électrons non appariés. Cela se traduit par la production d'espèces oxydantes réactives (ROS). Il existe un certain nombre de moyens par lesquels le corps humain élimine ROS à l'état physiologique. Si la production de ROS dépasse la capacité de réparation, les résultats de stress oxydatif et les dommages différentes molécules. Il existe de nombreuses méthodes différentes par lesquelles le stress oxydatif peut être moiPROFESSIONNELS DU SECTEUR. Ce manuscrit met l'accent sur l'une des méthodes de famille électrophorèse sur gel de cellule, également connu sous le nom «dosage comète" qui permet la mesure de cassures de l'ADN. Si tous les facteurs connus pour provoquer des dommages à l'ADN, autre que le stress oxydatif sont maintenus constants, le montant des dommages à l'ADN mesurée par dosage comète est un bon paramètre de stress oxydatif. Le principe est simple et repose sur le fait que les molécules d'ADN sont chargées négativement. Molécule d'ADN intact a une taille telle qu'elle ne migre pas au cours de l'électrophorèse. cassures de l'ADN, cependant, si le résultat présent en des fragments plus petits qui se déplacent dans le champ électrique vers l'anode. Des fragments plus petits migrent plus rapidement. Comme les fragments ont des tailles différentes le résultat final de l'électrophorèse est pas une ligne distincte, mais plutôt un continuum avec la forme d'une comète. Le système permet une quantification de la "comète" résultant et donc des cassures de l'ADN dans la cellule.

Introduction

Test des comètes a été développé par des scientifiques suédois Ostling et Johanson 1. L'ADN est une molécule chargée négativement. Au cours de l'électrophorèse, les fragments d'ADN, endommagées petits voyagent plus vite vers une anode chargée positivement 2. Le plus petit des fragments d'ADN, plus vite leur migration vers l'anode pour former une "comète" typique avec une «tête» composée de intacte, l'ADN endommagé et une "queue" composée de fragments d'ADN endommagés 3. ADN endommagé peut être réparé par différents mécanismes dans le corps 4, qui gardent la génération des cassures de l'ADN assez équilibrés 5. Si, cependant, la balance est en faveur de cassures de l'ADN, les pauses peuvent accumuler et finira par contribuer au développement d'une maladie.

Notre ADN souffre environ 0.000165% de dégâts à un moment donné 6. Simples cassures de l'ADN échoués se réfèrent à un défaut sur l'un des deux brins de la double hélice de l'ADNalors que des cassures double-brin d'ADN sont causées lorsque les deux brins de la double hélice de l'ADN sont endommagés. Il ya différents facteurs qui peuvent améliorer la quantité de cassures de l'ADN à un moment donné, comme l'âge de la cellule, la fumée de cigarette, divers médicaments ou le stress oxydatif 7-9. Si tous les facteurs conduisant à l'amélioration des cassures d'ADN sont maintenus constants, la quantification des cassures de l'ADN à l'aide d'essai de comète est un bon paramètre indirect de stress oxydatif.

La méthode de test des comètes est utilisé de plus en plus aujourd'hui dans la médecine, y compris l'ophtalmologie. Une raison à cela est que le stress oxydatif est de plus en plus reconnue comme un mécanisme pathogénique pour diverses maladies 8-11 et test des comètes est une méthode avec laquelle le stress oxydatif peut indirectement être quantifiés.

Protocole

Les études sur test des comètes effectuées à l'Université de Bâle, Département d'ophtalmologie ont été approuvés par le comité d'éthique local de Bâle

1. Préparation des réactifs

  1. Préparer saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (PBS) (Ca ++, Mg ++) solution par addition de PBS (1 paquet L) et 990 ml de dH 2 O aux médias. Ajuster le pH à 7,4. Stocker à température ambiante.
  2. Préparer la solution de lyse: Pour préparer 1000 ml ajoute 2,5 M de NaCl (146,1 g), de l'EDTA 100 mM (37,2 g) et 10 mM de base Trizma (1,2 g) dans de dH 2 O.
  3. Préparer tampon d'électrophorèse (NaOH 300 mM / EDTA 1 mM) en ajoutant 30 ml de NaOH 10 M et 7,5 ml de 0,2 M EDTA, QS 1500 DH 2 O et bien mélanger. Le volume total dépend de la capacité de la boîte à gel. Avant utilisation, mesurer le pH du tampon pour assurer un pH> 13.
  4. Préparez tampon de neutralisation contenant 0,4 M de Tris (48,5 g ajouté à dh ~ 800 2 O, ajuster le pH à 7,5), concentré (& #62; M HCl 10) dans 1000 ml avec dH 2 O. Conserver la solution à la température ambiante.
  5. Préparer la solution de coloration. Pour le bromure d'éthidium (EtBr; 10x Stock, 20 pg / ml) ajouter 10 mg de EtBr dans 50 ml dH 2 O et stocker à température ambiante. Pour 1x Stock - mélanger 1 ml avec 9 ml dH 2 O. PRUDENT! Manipuler avec précaution EtBr adéquate car il est un cancérogène connu.

2. Isolement de leucocytes

  1. Obtenir des échantillons de sang humain (20 ml) avec anti-coagulant tels que l'héparine en utilisant la ponction veineuse.
  2. Séparer les lymphocytes en utilisant un séparateur de cellules à gradient de densité tels que Histopaque.
    1. En bref, le sang dilué dans 1: 1 avec du PBS ou RPMI (sans FBS) et de la couche au-dessus de 600 ul de liquide de séparation de cellule.
    2. Centrifugeuse 1800 g pendant 20 min à 4 ° C. Aspirer le manteau 'Buffy' dans 3-5 ml de PBS / RPMI et centrifugé à 300 g pendant 10 min pour sédimenter les lymphocytes.
    3. Récupérer lymphocytes juste au-dessus limite entre PBS (RPMI) Et le liquide de séparation de cellules, à l'aide d'une pipette. Retirer les bandes de leucocytes à partir de l'interface entre le plasma et les couches de liquide de séparation de cellules de chaque tube et recueillir dans un tube de 50 ml.
  3. Amener le volume total à 50 ml avec du milieu Eagle modifié de froid Dulbecco (DMEM). Laver la suspension de cellules trois fois avec du DMEM à 300 xg pendant 10 min.
  4. Comptez le nombre total de cellules en utilisant un hémocytomètre. Suspendre les cellules dans PBS et aliquote dans des microtubes à 10 7 cellules / tube.
  5. Pipeter 0,4 ml de cellules dans un tube de matière plastique à usage unique de 5 ml. Ajouter 1,2 ml 1% d'agarose à faible température de gélification à 40 ° C. Mélanger et rapidement et pipeter 1,2 ml de suspension de cellules sur la surface d'agarose recouvert d'une lame de pré-enduit. Éviter de produire des bulles.
  6. Laisser la gélose se gélifier pendant environ 2 min. Soyez cohérent avec le temps et la température de gélification, et veiller à ce que l'agarose est entièrement réglé avant l'immersion dans une solution de lyse. Après pleinement set, plonger dans la solution de lyse à ~ 4 ºC.

3. Lyse et Électrophorèse

NOTE: La procédure décrite est pour l'électrophorèse dans des conditions de pH> 13 alcalines.

  1. Après au moins 2 heures à ~ 4 ºC, retirez délicatement les lames de la solution de lyse. Placer les lames côte à côte sur la boîte de gel horizontal de près d'une extrémité, les glissant aussi rapprochés que possible.
  2. Remplir les réservoirs tampons avec fraîchement préparé tampon à pH> 13 d'électrophorèse jusqu'à ce que le niveau de liquide recouvre complètement les diapositives (éviter les bulles plus de l'agarose).
  3. Laissez-lames sont assis dans le tampon alcalin de 20 min pour permettre le déroulement de l'ADN et l'expression des dommages alcalin labile.
  4. Allumez alimentation de 25 volts (~ 0,75 V / cm) et ajuster le courant à 300 milliampères en élevant ou abaissant le niveau de tampon. Électrophorèse les diapositives pendant 30 min.
  5. Coupez l'alimentation. Soulevez doucement les lames de la mémoire tampon et pdentelle sur un plateau de vidange. Goutte à goutte enduire les lames avec neutralisation tampon. Laisser les lames reposer pendant au moins 5 min. Égoutter diapositives et répéter deux fois de plus.
  6. Colorer les lames avec 80 ul 1x bromure d'éthidium (BET) et laisser reposer pendant 5 min, puis tremper dans de l'eau distillée refroidie pour éliminer l'excès. Ensuite, placez une lamelle sur la lame et de les stocker immédiatement. Magasin glisse pendant un mois à température ambiante dans des conditions sèches.
    REMARQUE: Les autres taches d'ADN (par exemple, SYBR-green) peut également être utilisé. Attention! porter des gants de protection comme la plupart des colorants sont mutagènes.

4. Quantification des cassures de l'ADN

  1. Pour visualiser la lésion de l'ADN, observer la diapositive d'ADN coloré à l'EtBr sous un microscope à fluorescence objectif 40X.
  2. Évaluer quantitativement dommages à l'ADN dans les cellules en mesurant la longueur de migration de l'ADN et le pourcentage d'ADN migré (Figure 1A). Quantifier dommages à l'ADN (figure 1B) par le moment et Olive Queue-moment. Définitions de Queue-Moment et Olive -Moment ont déjà été donnés 8-10.
    NOTE: Dans notre expérience, il est suffisant pour tenir à l'un des paramètres. Les cellules sont photographiées en réglant l'outil automatisé qui analyse sur les cellules de diapositives et de photographies au microscope. Quantification des cassures de l'ADN peut être fait par des progiciels d'analyse d'image. Il existe plusieurs forfaits différents logiciels qui sont faits sur mesure pour capturer l'image des cellules et de quantifier les dommages à l'ADN. Nous vous recommandons d'utiliser le même logiciel pendant toute l'expérience. Le technicien de laboratoire identifie la cellule intacte ou d'une comète est marqué sur l'ordinateur et clique avec la souris sur elle. La cellule comète ou intacte est alors automatiquement marqué.

Résultats

Bien que la méthode de test des comètes rend résultats reproductibles, il peut être influencé par une variété de facteurs. Un tel facteur est de savoir si oui ou non les leucocytes sont cryoconservés avant la lyse et électrophorèse sur gel ou si cette étape est réalisée sur les leucocytes fraîchement préparées. La figure 2 montre que dans le groupe 2, où les leucocytes ont été cryoconservés avant de l'ADN de lyse et une électrophorèse sur gel pauses étaient significativement plus élevés, que dans le groupe 1 où la lyse et gel -electrophoresis a été faite sur des cellules fraîchement préparés.

Le dosage peut également être utilisé pour évaluer indirectement le stress oxydatif systémique. Le tableau 1 présente les statistiques descriptives pour Queue moment et Olive- moment, chez les fumeurs et les sujets sains. Les données révèlent que fumer un demi-paquet de cigarettes par jour a plus que doublé pauses ADNsb dans les leucocytes circulants 9.

figure-results-1

figure-results-2
Figure 1. (A) représente le microscope utilisé lors de l'analyse de l'essai comète. (B) Δ représente une "comète" typique avec une tête brillante et la queue (endommagé fragments d'ADN plus petites). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 2. ADNsb ruptures étaient significativement plus élevés lorsque les leucocytes ont été cryoconservés (Groupe 2) que lorsque les leucocytes fraîchement préparés ont été utilisés avant la lyse et électrophorèse sur gel.

figure-results-4
Tableau 1. Les fumeurs avaient plus que doubler le nombre de ssADN casse par rapport à l'âge et le sexe appariés non-fumeurs en bonne santé.

Discussion

Des scientifiques suédois Ostling et Johanson ont été les premiers dans leur domaine à utiliser test des comètes de quantifier les dommages de l'ADN dans les cellules 1. Les conditions neutres que les deux scientifiques ont utilisé, cependant, seulement permis la détection des cassures double-brin d'ADN. Singh et al. Tard le dosage adapté pour une utilisation dans des conditions alcalines, qui a produit une version sensible qui pourrait évaluer les cassures double et simple brin d'ADN et de détecter les sites alcali-labiles 12. Depuis son développement initial, le test a été modifiée à diverses étapes, pour la rendre appropriée pour évaluer les types de dommages à l'ADN dans des types cellulaires différents 13-15.

Comme avec toutes les techniques, en accordant une attention rigoureuse aux détails techniques est important d'obtenir des résultats précis 16. Basé sur notre expérience, on obtient les meilleurs résultats si chaque étape de la préparation de la solution vers la comète quantification-est réalisé par le laboratoire techn expert méthodologiqueicians. L'utilisation de milieux frais et correctement préparé, techniques de pipetage adéquates, le calendrier exact et (comme mentionné précédemment dans la section des résultats) l'utilisation de leucocytes fraîchement préparés sont essentiels pour que la lyse et électrophorèse sur gel pour obtenir des résultats précis 17.

Toutes les étapes individuelles dans ce test sont tout aussi importants pour obtenir des résultats fiables. Dans 16 meilleurs résultats généraux sont obtenus si chaque étape méthodologique unique de la préparation de la solution jusqu'à la quantification comète est effectuée par le laboratoire expert technicians.Important semblent l'utilisation de milieux frais et correctement préparés , les techniques de pipetage adéquates, timing exact et comme déjà mentionnées dans la section des résultats de l'utilisation de leucocytes fraîchement préparés pour la lyse et l'électrophorèse sur gel pour obtenir des résultats satisfaisants à partir de l'essai 17.

Comme le font d'autres méthodes, la technique de test des comètes a son avandes avantages et des inconvénients. Être une méthode sensible, le dosage est vulnérable aux facteurs (par exemple, la lumière UV) qui pourraient augmenter cassures de l'ADN et donc affecter les résultats. Tout facteur qui peut augmenter le stress oxydatif, sauf ce qui est l'objet de recherches, devrait être évitée. Les facteurs de stress peuvent augmenter le niveau de stress oxydatif, non seulement dans les leucocytes, mais aussi dans tous les autres milieux de sang et les lymphocytes. Comme mentionné précédemment, il existe de nombreuses façons de mesurer le stress oxydatif 18,19 différentes et plus directs. Le test des comètes est l'une des nombreuses méthodes qui présente certains avantages. Ceux-ci comprennent sa faible coût relatif, le petit nombre de cellules nécessaires (<10 000 cellules) et donc les petits échantillons de sang nécessaires par patient, la période de temps relativement courte nécessaire de quantifier les dommages de l'ADN dans les cellules (environ trois jours), sa sensibilité et son répandue applicabilité aux dommages de l'ADN des ânes dans différents types cellulaires. Dans le passé, nous avons choisi de travailler avec les leucocytes puisque nous avons eu l'expérience avec ceun type de cellule et il est applicable pour l'étude particulière prévue. Un autre avantage de l'essai de comète est qu'il peut être utilisé pour détecter les différents types et niveaux de dommages à l'ADN et peut donc être appliquée dans divers autres domaines d'études en plus de stress oxydatif telles que des études de réparation d'ADN, essais de supplémentation ou d'études de génotoxicité.

Le stress oxydatif est maintenant reconnue comme jouant un rôle essentiel dans la pathogenèse de plusieurs maladies. La méthode de test des comètes, tandis que l'une des nombreuses façons de mesurer le stress oxydatif 18,19, est relativement simple, polyvalent et peu coûteux. Lorsque maîtrisée, cette méthode peut être utilisée dans tous les domaines de la médecine dans lequel le stress oxydatif joue un rôle 8-10,20,21.

Remerciements

Nous tenons à remercier la LDD Stiftung, à Triesen Liechtenstein, de soutenir financièrement notre recherche sur le stress oxydatif.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Diméthylsulfoxyde (DMSO)Qualigènes(CPW59)
EDTA disodiqueHiMedia(RM1370)
Bromure d’éthidiumSigma(E-8751)
HistopaqueSigma(1077-1)
Phosphate salin tamponné (PBS) (sans Ca++, Mg++)HiMedia(TS1006)
Chlorure de sodium (NaCl)Ranbaxy Rankem(S0160)
Hydroxyde de sodium (NaOH)BDH-Merck(89021)
Triton X-100HiMedia(RM 845)
Trizma BaseSpectrochem
Matériaux requis pour l’électrophorèse sur gel
Agarose à fusion normale (NMA)HiMedia(RM273)
Point de fusion bas Agarose (LMPA)Sigma(A9414)
Lamelles de méthanol - Qualigens
(n° 1, 24 x 60 mm)
Tarsons(500010)
Micropipettor et pointesTarsons
Lames de microscope, Lames d’électrophorèse
Tubes de microcentrifugation Blue Star conventionnelle / Micro gel (MGE)

Références

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