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Encapsulation thermogénique préadipocytes pour la transplantation dans dépôts de tissu adipeux

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DOI :

10.3791/52806

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2 juin 2015

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1Department of Human Sciences, The Ohio State University, 2Department of Minimally Invasive Surgery, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 3NSF Nanoscale Science and Engineering Center for Affordable Nanoengineering of Polymeric Biomedical Devices, The Ohio State University

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole d’encapsulation des cellules cataboliques, qui consomment des lipides pour la production de chaleur dans le tissu adipeux intra-abdominal et augmentent la dissipation d’énergie chez les souris obèses.

Résumé

Cellule encapsulation est développé pour piéger des cellules viables dans des membranes semi-perméables. Les cellules encapsulées greffées peuvent échanger des metabolites de faible poids moléculaire dans les tissus de l'hôte traité pour obtenir une survie à long terme. La membrane semi-perméable permet greffé cellules encapsulées pour éviter le rejet par le système immunitaire. Le procédé d'encapsulation a été conçu pour permettre une libération contrôlée de composés bioactifs, tels que l'insuline, des hormones et d'autres cytokines. Nous décrivons ici un procédé pour l'encapsulation de cellules cataboliques, qui consomment des lipides pour la production de chaleur et de dissipation d'énergie (thermogenèse) dans le tissu adipeux intra-abdominale de souris obèses. Encapsulation de cellules cataboliques thermogénique peut être potentiellement applicable à la prévention et au traitement de l'obésité et le diabète de type 2. Une autre application potentielle de cellules cataboliques peut inclure la désintoxication d'alcools ou d'autres métabolites toxiques et des polluants environnementaux.

Introduction

L'incidence croissante des maladies chroniques 1 a stimulé les études sur la transplantation de populations de cellules thérapeutiques 2. Cellules souches syngéniques ou allogéniques sont les types de cellules les plus couramment utilisés pour ces applications 2. Cependant, ces traitements ne permettent pas le contrôle de la différenciation et la migration de cellules souches après l'implantation et ne sont pas économiques efficace. La transplantation de cellules génétiquement modifiées avec les fonctions bénéfiques prévoit améliorer le traitement de nombreuses maladies. Cependant, les modifications génétiques de cellules sont reconnus par le système immunitaire de l'hôte, par conséquent, ces traitements nécessitent trois immunosuppression. L'encapsulation de cellules produisant de l'insuline a été développé par le Dr Chang 4. La technique est basée sur l'encapsulation des cellules dans des gouttelettes d'alginate qui sont immergés dans une solution de chlorure de calcium. Les molécules d'alginate sont constitués d'acide mannuronique (M) et guluronique (G) et peuvent être connectés par Ca 2+. Après la gélification, les billes sont mises en suspension une poly-L-lysine (PLL) solution. Au cours de cette étape, PLL se lie à G et M dans les molécules d'alginate qui établit la membrane de la capsule. La porosité de la membrane de la capsule peut être modulée en faisant varier les concentrations de S PLL, et le temps d'incubation et de la température. La liaison de PLL dépend aussi du type et de la concentration d'alginate. Des matrices d'alginate réticulé par des ions Ca 2+, sont instables dans le milieu physiologique ou dans des solutions tampons à forte concentration communs de phosphate et les ions citrate. Ces tampons peuvent extraire Ca 2+ de l'alginate et liquéfier le noyau. La liquéfaction du noyau alginate offre un espace à l'intérieur des capsules pour le mouvement cellulaire et la croissance. Les cellules encapsulées dans de l'alginate polyanionique avec polycationique poly-L-lysine (APL) sont imperméables pour des immunoglobulines mais ont afflux d'éléments nutritifs et l'efflux de toxines. Les propriétés de ceux-ci APL permettent long terme survival des cellules encapsulées après transplantation dans génétiquement différents hôtes. Elliott et al. A rapporté la survie de fonctionnement des cellules du pancréas de porc encapsulés dans un patient humain neuf ans après l'implantation 5.

techniques d'encapsulation peuvent être classés en microencapsulation (3-800 um) et macroencapsulation (supérieure à 1000 um). Microcapsules sont plus durables que macrocapsules 6. Depuis sa découverte par le Dr Chang et ses collègues en 1964, microencapsulation a été largement utilisé pour l'encapsulation de cellules produisant l'insuline anabolisants, hormones et autres molécules bioactives 7. Ces traitements confrontés à plusieurs défis dans le tissu hôte, y compris la fibrose et la réponse immunitaire 8. Dans un premier temps, les effets secondaires liés à la qualité de biopolymères ont été résolus. Cependant, la transplantation de cellules anabolisants déclenche toujours des effets secondaires, tels que la fibrose, à la suite de l'hormone overproduction à l'extérieur d'une glande spécialisé.

Au cours des dernières décennies, l'obésité et le diabète de type 2 a atteint des proportions épidémiques 9. Plus de 30% des personnes adultes dans le monde sont en surpoids et obèses 10. Intra-abdominale (IAB) formation accrue de graisse augmente l'incidence de l'inflammation chronique et favorise le diabète de type 2, les maladies cardiovasculaires, de certains cancers et d'autres pathologies 11-13. Plusieurs éléments de preuve suggèrent que la pathogenèse associée avec de la graisse IAB peut être évitée par les adipocytes spécifiques. Des études récentes ont montré que la transplantation d'adipocytes sous-cutanés dans la région IAB peut améliorer le métabolisme et diminuer la résistance de l'obésité et de l'insuline chez les rongeurs in vivo 14. Une réduction efficace de la résistance de l'obésité et de l'insuline a été associé à adipocytes thermogénique capables de dissiper l'énergie sous forme de chaleur de 15,16. Modification thermogénique des adipocytes peut être obtenue par transfection stabledes gènes participant à la désolidarisation de protons mitochondrial, comme la protéine de découplage 1 (Ucp1) ou de gènes régulant l'expression de gènes et d'autres Ucp1 thermogénique 15,16. Nos études récentes ont montré que la déficience en aldéhyde déshydrogénase 1 a1 (aldh1a1) conduit à la rénovation de Iab graisse thermogénique qui réduit l'obésité et la résistance à l'insuline chez ces souris 17,18. Notamment, l'encapsulation des thermogénique aldh1a1 déficient (aldh1a1 - / -) préadipocytes médiatise même effet thérapeutique dans IAB graisse chez les souris de type sauvage obèses, ce qui suggère de nouvelles possibilités thérapeutiques pour le traitement de l'IAB graisses 18. Dans les paramètres expérimentaux, des cellules encapsulées permettent aux chercheurs d'étudier les effets des populations de cellules spécifiques dans une manière rentable 19. Ici, nous discutons du procédé d'encapsulation d'une lignée cellulaire catabolique thermogénique et son laboratoire et l'application thérapeutique dans un modèle de souris de l'obésité. Le protocole décrit tphases ROIS pour la production de microcapsules (figure 1): la formation des microbilles d'alginate (Figure 1A), la formation de la polycationique poly-L-lysine (PLL) de membranes à la surface des microbilles (figure 1B), et l'enlèvement de la alginate noyaux (Figure 1C).

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Protocole

Le protocole d'étude a été approuvé par l'Université Ohio State comités d'éthique. Les expérimentations animales ont été approuvés par le protocole IACUC. Toutes les procédures ont été effectuées en vertu de la biosécurité au niveau du Cabinet 2 avec flux laminaire. Nous avons suivi toutes les exigences et procédures de sécurité standard. La technique de microencapsulation pour la préparation de microcapsules a été effectuée comme décrit 17, 18.

1. Préparatifs de Matériaux

  1. Préparer 10 ml de solution d'alginate de sodium à 2% dans une solution saline physiologique à l'autoclave (0,9% de NaCl dans l'eau). Préparer une solution à 0,05% PLL dans du sérum physiologique. Préparer ces solutions le jour avant et agiter durant la nuit. Filtrer les solutions avec filtre de 0,22 um avant utilisation.
  2. Préparation du citrate de sodium 50 mM et 100 mM de CaCl 2 dans 0,9% de NaCl et les autoclaver.
  3. Autoclaver toutes les solutions, les aiguilles, les électrodes, et gobelets. Laver soigneusement les aiguilles propres avec des fils pour éviter le colmatage.
  4. Déterminer le montant approprié de cellules à utiliser pour les capsules (102 microcapsules sont nécessaires pour chaque cm 2 de bien et il ya environ 500 cellules par capsule 18). Utiliser 1 ml d'alginate de sodium par deux millions de cellules.
  5. Préparer un «Fibroblast Growth Medium" contenant du sérum de veau à 10%, et 100 U / ml de pénicilline / streptomycine dans une haute teneur en glucose (4500 mg / l de glucose) du milieu de Eagle modifié de Dulbecco (DMEM).
    1. Préparer un «milieu de différenciation I 'contenant 10% de sérum bovin foetal, 10 ug / ml d'insuline, 1 uM de dexaméthasone, la xanthine mM de 3-isobutyl-1-méthyl 0,5, et 100 U / ml de pénicilline / streptomycine dans du DMEM.
    2. Préparer contenant 10% de sérum un «milieu de différenciation II 'fœtal bovin, 10 pg / ml d'insuline, et 100 U / ml de pénicilline / streptomycine dans DMEM.
  6. Préparer du tampon de lyse contenant une protease comprimé d'inhibiteur par 10 ml de tampon de dosage radio-immunoprécipitation (RITampon PA).

2. Préparation des microbilles d'alginate (figure 1A)

  1. Retirer ancien milieu de flacon de culture cellulaire. Rincer les cellules avec 10 ml de PBS. Apportez cellules en suspension avec 0,25% de trypsine-EDTA (2 ml par une confluence flacon T175).
  2. Compter les cellules en suspension de cellules à l'aide d'un hémocytomètre. Utilisez aliquote de 10 ml de la suspension cellulaire et compter les cellules selon les instructions du fabricant. Centrifuger les cellules restantes dans un milieu de centrifugation à 480 x g à la température ambiante pendant 5 min.
  3. Suspension du culot cellulaire dans de l'alginate de sodium comme décrit à l'étape 1.4. Transférer la solution d'alginate de sodium-cellule à une seringue de 5 ml.
  4. Retirer les bulles d'air dans la solution, ajouter une aiguille de calibre 23 et inverser la seringue pour créer un 1 ml poche d'air.
  5. Placez un petit gobelet (180 ml) contenant 144 ml de solution de CaCl 100 mM 2 sous le bec de l'aiguille de l'encapsulateur. Fixez l'électrode à l'encapsulateur avec la pointe Approximment 2,5 cm au-dessus de la surface de la solution mM CaCl 2 100.
  6. Passer hermétiquement la seringue contenant la solution d'alginate de sodium-cellule dans la pompe à seringue. Fixer le tube de caoutchouc à l'ouverture de la seringue. Poussez le piston jusqu'à ce que la solution d'alginate de sodium-cellule entre mi-chemin à travers le tube. Régler la tension à 5,4 kV. Régler le diamètre de 12,06 mm sur la pompe à seringue. Réglez la vitesse de 3 ml / h. Démarrer la pompe. Allumez l'encapsulateur et maintenir la tension à 5,4 kV.
  7. Fermer la fenêtre de la hotte et éviter toute vibration inutile jusqu'à la fin de la formation des microbilles d'alginate. Après tout solution passe à travers l'aiguille, les microbilles se solidifier en forme de billes d'alginate dans la solution mM CaCl 2 pour cent supplémentaire de 20 min avant le revêtement avec PLL.

3. microbilles de revêtement avec PLL (figure 1B)

  1. Retirer le bécher contenant les microbilles en forme de billes d'alginate de sodium et de cellules transférer ces MicrobEADS dans un tube de centrifugation de 50 ml. Retirer la solution de CaCl2 à partir de la pastille de microbilles.
  2. Laver les microbilles sphériques d'alginate de cellules par addition de 30 ml de NaCl à 0,9%. Agiter le tube à la main en douceur. Retirer NaCl à 0,9% avec 25 ml pipette après les microbilles ont précipité par la gravitation. Répéter deux fois de plus pour un total de 3 lavages.
  3. Utiliser 10 ml de solution de PLL à 0,05% pour chaque 1 ml de solution d'alginate de sodium. Ajouter 0,05% PLL et le vortex à 1000 rotations par minute pendant 10 minutes.
    Remarque: Habituellement, 10 min est suffisante pour le revêtement PLL.
  4. Une fois la couche PLL est formé, retirez la solution PLL et laver les capsules 3 fois comme décrit au paragraphe 3.2.

4. Suppression de l'alginate de base (figure 1C)

  1. Ajouter 30 ml de solution de citrate de sodium à 50 mM. Attendre 5 minutes, ou jusqu'à ce que tout l'alginate de sodium soit dissous. Laver capsules trois fois comme décrit à l'étape 3.1.1.
  2. Enlever le NaCl à 0,9%, ajouter 20 ml de milieu de culture dans le tube de 50 mlet transférer tous les capsules contenant les cellules dans un ballon de culture de cellules. Poignée cellules encapsulées dans des conditions de culture cellulaire standard 18.

5. In Vitro applications à l'étude de xénogreffes et cellule hôte Interactions ou Cinétique de métabolite Afflux / Efflux entre cellules (Figure 2)

  1. La culture de cellules hôtes sur plaque à 24 puits jusqu'à la confluence des co-cultures. Utilisez le 'moyen de croissance des fibroblastes »pour préadipocytes de culture.
  2. microcapsules de transfert 24 dans des cellules hôtes confluentes de plaque contenant aussi. Ajouter microcapsules pour parvenir à une monocouche (102 microcapsules / cm 2 de bien).
  3. Induire la différenciation pré-adipocytes en milieu de différenciation I. Chaque 48 heures, les médias de changement au milieu de différenciation II pendant six jours. Lyse des cellules dans du tampon RIPA. Utilisez 50 pg de protéine par condition pour analyser l'expression de protéines en Western blot.

6. En Vivo Demande de Traitemeent de l'obésité (Figure 3)

  1. Mélanger 4% d'isoflurane avec de l'oxygène pour l'induction de l'anesthésie et 2% d'isoflurane avec de l'oxygène pour l'entretien de l'anesthésie. Confirmer la profondeur de l'anesthésie adéquate par pincement de l'orteil.
    1. Appliquer une pommade anti-démangeaison sur les yeux pour protéger les cornées de se dessécher.
  2. Utilisation des cellules encapsulées qui sont marqués de façon permanente avec la protéine de fluorescence artificiel, tels que la protéine de fluorescence verte (GFP).
  3. Utiliser une seringue de trois ml et une aiguille de calibre 20 pour injecter des cellules encapsulées.
    1. Injecter 0,5 x 10 6 cellules en suspension dans 0,2 ml de PBS dans chaque dépôt de graisse IAB qui se trouve dans la zone intrapéritonéale entre une gonade et les reins comme le montre la figure 3. Utilisez ce volume de PBS et le nombre de cellules pour des souris avec un poids moyen de 40 g. Ajuster le nombre de cellules et le volume chez des souris qui ont un poids différent ou pour la détermination des effets dépendants de la dose.

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Résultats

La figure 1 montre que chaque étape de la production de microbilles peut être contrôlé au microscope. La figure 2A montre comment la co-culture des adipocytes avec une monocouche de cellules encapsulées. La figure 2B est un exemple représentatif d'une étude quantitative utilisant des adipocytes / microcapsules co-cultures que ont été décrits dans la section 5. lysats des adipocytes ont été analysés en Western blot. Des cellules encapsulées sont analysés dans cette e...

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Discussion

Diverses méthodes ont été utilisées pour encapsuler des cellules, y compris le séchage, l'extrusion, et 19 l'émulsion. Dans ce procédé, les billes d'alginate sont extrudes à travers une aiguille, puis revêtue d'PLL et le noyau alginate sera dissoute pour terminer l'encapsulation. Bien que cette méthode a été utilisée pendant des années, la formation des perles avec la taille désirée et forme sphérique est toujours difficile. La taille des capsules est fortement dépendante de la viscosité d...

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Déclarations de divulgation

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Remerciements

Nous tenons à remercier Jennifer Petrosino et David DiSilvestro de l'aide éditoriale. Cette recherche a été soutenue par numéro 20020728 Prix de l'American Egg Board et le numéro 10040042 Prix de Novo Nordisk Pharmaceuticals ainsi que par le Centre Innovation Alimentaire, Bureau des affaires internationales, Centre for Advanced Functional Foods de recherche, et de l'entrepreneuriat à l'OSU ainsi que la National Science Foundation accorde CEE-0914790 (LJL). Le projet décrit a été soutenue par le Prix Nombre R21OD017244 (OZ) et UL1RR025755 (OSUCCC) du National Center for Research Resources, financé par le Bureau du Directeur de la National Institutes of Health (OD) et soutenu par le NIH Roadmap for Medical Research et NCI P30CA16058. Le contenu est de la seule responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de la National Center for Research Resources ou de la National Institutes of Health.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Dispositif d’encapsulation (VAR V1)NiscoLIN-0042Aucun
KD scientific Pousse-seringueKD scientific780100YAucun
Microscope Olympus  ;Olympus OpticalIX70-S8F2Aucun
Alginate de sodiumSigmaMKBP8122VAucun Bromhydrate
de poly-L-lysine (PLL)Sigma020M5006VAucun
Chlorurede calcium SigmaSLBJ2662VAucun
Citrate de sodium tribasique dihydratéSigma030M0200Aucun
Chlorure de sodiumSigmaSLBD2595VAucun
Mini-PROTEAN TGX GelsBio-Rad456-1093Aucun
Anticorps primaire ATGL (de lapin)Signalisation cellulaire2138SAucun
Anticorps secondaire (anti lapin)LI-COR926-68071Aucun Tampon
dosage par radio-immunoprécipitation (RIPA)Boston BioProductsD25Y6ZAucun
Tampon phosphate solution saline (PBS)SigmaRNBD2893None
TrypsinGibco25200-056Aucun
Cortizone 10 Pommade anti-démangeaisonsCortizone 10C4029138Aucun
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11965-092Aucun
Sérum de veau nouveau-né (CS)SigmaN4762Aucun
Sérum de veau fœtal (FBS)SigmaF4135Aucun
3-Isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX)SigmaI0516Aucun
DexaméthasoneSigmaD4902Aucun
Insuline (bovine)SigmaI5879Aucun
Inhibiteur de protéase compriméscocktail Roche4693159001Aucun
de Aucun

Références

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Mots-clés

Encapsulation cellulairealginate de sodiumpoly L lysineproduction de microbillestransplantation in vivoanalyse par Western blotmarquage par immunofluorescenceposte de s curit microbiologique

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