Transfecter des cellules RAW264.7 avec un gène rapporteur de la luciférase

La transfection d'acides nucléiques dans des cellules a une application variée dans la recherche scientifique. Des exemples comprennent (1) des gènes rapporteurs pour étudier le rôle des éléments de différents gènes dans l'expression génique, (2) les plasmides d'expression de protéine de surexpriment la protéine d'intérêt, et (3) de petit ARN interférent régulent à la baisse l'expression du gène. En manipulant le niveau de certains gènes d'expression et de mesurer l'effet différentiel de ces manipulations, les chercheurs peuvent déduire les fonctions des gènes dans les systèmes biologiques choisis. Toutes les méthodes de transfection fournissent les mêmes efficacités de transfection, et même le même procédé de transfection ne transfecter pas tous les types cellulaires également ^une. Par conséquent, différents procédés de transfection ont été développés tel que le procédé au phosphate de calcium, DEAE-dextrane, transfection lipide cationique, la transfection de polymère non-lipide cationique, une électroporation, et nucléofection ^2,3.

Transfection dans les macrophages est ESPEciellement difficile en raison du fait que les macrophages sont des phagocytes professionnels qui sont très sensibles à des matières étrangères, y compris les bactéries dérivées (méthyle) ⁴ ADN. L'introduction d'ADN étranger active la voie Toll-like récepteurs 9 (TLR9) conduisant à la production de cytokines et de ^5,6 d'oxyde nitrique. Ces macrophages activés peuvent alors être moins sensibles au traitement que les chercheurs entendent examiner.

Notre laboratoire transfecte régulièrement la lignée cellulaire de macrophages RAW264.7 avec des gènes rapporteurs luciférase, et nous avons développé un protocole qui est suffisamment robuste pour activer le signal luciférase significativement plus élevé que de fond, mais aussi assez doux pour les macrophages de rester à leur état de repos. Les comportements des cellules transfectées ont été évaluées par un gène rapporteur de luciférase de luciole-porteuse de la région de promoteur de IκBζ (pGL3- IκBζ). IκBζ expression est régulée positivement par le composant lèvre de la paroi cellulaire bactérienneopolyssacharide (LPS) ^7,8, et régulée à la baisse par la cytokine anti-inflammatoire, l'interleukine-10 (IL-10) ^8. Pour tenir compte de la variation entre les puits transfection, nous avons co-transfecter un plasmide témoin contenant le gène de la luciférase de Renilla (par exemple, phRL-TK) à des fins de normalisation. Le protocole décrit est optimisée après l'essai de divers paramètres, y compris le moment de la transfection, le type de réactifs de transfection, des quantités de réactifs de transfection et de l'ADN de plasmide, ainsi que le rapport de réactif de transfection de l'ADN plasmidique. Les deux réactifs de transfection inclus dans ce protocole sont (1) un réactif de transfection à base de lipides et (2) une protéine / réactif de transfection à base de polyamine.

1. L'ADN de plasmide Purification

1. Extraire l'ADN plasmidique en utilisant un kit de maxiprep selon le protocole du fabricant. Remettre en suspension l'ADN de plasmide dans 500 ul de tampon TE.
2. Effectuer un phénol: chloroforme: extraction de l'alcool isoamylique et précipitation à l'isopropanol pour éliminer les contaminants bactériens résiduels. La présence de LPS interfère avec la transfection ^9.
   1. Ajouter 500 pi de phénol: chloroforme: alcool isoamylique (25: 24: 1, pH 8) à l'ADN plasmidique et agiter vigoureusement pendant 15 sec. Phénol provoque de graves brûlures de la peau et est un anesthésique afin brûlures ne sont pas toujours senti jusqu'à ce qu'il y est des dommages graves. Effectuer extraction au phénol: isoamyle dans la hotte et faire preuve de prudence: chloroforme.
3. Incuber le mélange pendant 5 min à température ambiante. Centrifuger à 13 000 g pendant 10 min à température ambiante. Transférer 350 ul de la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube de 1,5 ml de collection.
4. Ajouter 350 pi de tampon TE au tube contenant la phase organique inférieure. Agiter vigoureusement pendant 15 sec. Centrifuger à 13 000 g pendant 5 min à température ambiante. Transférer 350 pl de la phase aqueuse supérieure à 1,5 ml du même tube de collecte.
5. Ajouter 70 ul d'acétate de sodium 3 M (pH 5,2) et bien mélanger. Ajouter 700 pi d'isopropanol à 100%. Mélangez bien et incuber 10 min à température ambiante. Centrifugeuse à 13.000 g pendant 10 minat 4 ° C. Retirer le surnageant.
6. Ajouter 500 ul d'éthanol à 75% au culot. échantillons de Vortex pour mélanger et centrifuger à 5000 g pendant 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant. ADN se trouve dans le culot.
7. Ouvrez le bouchon du tube et sécher à l'air le culot à température ambiante pendant 5 à 10 min. Le culot doit devenir translucide. Ajouter 500 ul de tampon TE pour remettre en suspension le culot d'ADN. On chauffe à 50 - 60 ° C pendant 10 minutes pour dissoudre le culot d'ADN.
8. Mesurer l'absorbance à 260 nm (A260) et 280 nm (A280) avec un spectromètre. Calculer la concentration de l'ADN en multipliant la valeur de A260 par 50 ng / ul. Évaluer la qualité de l'ADN par calculating le rapport A260 / A280. L'ADN de haute qualité devrait donner un rapport A260 / A280 de 1,8 à 2,0.

2. La culture cellulaire et l'ensemencement

1. les cellules RAW264.7 de culture dans du DMEM supplémenté avec 9% de sérum de veau foetal (milieu DMEM / 9% de FCS) dans un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur. Au cours de chaque passage, détacher les cellules de la plaque par pipetage continu à l'aide d'une pipette Pasteur. Passage des cellules tous les 2 jours, et ensemencer 1,5 à 2.000.000 cellules sur un plat traité de culture de tissu de 10 cm que le stock. Décongeler un nouveau stock de cellules tous les 5 - 6 semaines.
2. Le jour de la transfection, ensemencer 200 000 cellules par puits dans une plaque à 24 puits dans un volume de 500 ul de DMEM / 9% de FCS. Incuber les cellules pendant 4 heures dans le 37 ° C incubateur.
3. transfecter des cellules, soit avec le réactif à base de lipides (étape 3.1) ou le réactif à base de polyamine de protéine / (étape 3.2).

3. La transfection

1. Transfection à base de lipides:
   1. Réchauffer le Reagen de transfectiont à la RT dans l'obscurité. Réchauffez milieu sans sérum et DMEM / 9% de FCS à 37 ° C.
   2. Ajouter 0,5 pg d'ADN de plasmide à 50 pi de milieu sans sérum dans un tube de 1,5 ml. Ajouter 2 ul de réactif de transfection avec la pointe de la pipette au-dessous de la surface du liquide. Vortex pendant 6 sec.
   3. Laisser reposer le mélange réactif / ADN dans l'obscurité à température ambiante pendant 30 min.
   4. Au cours de l'incubation de 30 min, retirez le support du puits et ajouter 250 microlitres de frais DMEM / 9% de FCS à chaque puits.
   5. Après 30 min, ajouter 250 ul de DMEM / FCS à 9% du mélange réactif / ADN. Mélangez bien par pipetage de haut en bas.
   6. Ajouter 300 ul du mélange dilué à chaque puits. Incuber pendant 2 à 4 h dans un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur.
   7. Enlever la solution de transfection et ajouter 500 ul de DMEM / 9% de FCS. Incuber pendant 24 à 48 heures dans un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur avant de stimulation cellulaire.
2. Protéine / transfection à base de polyamine:
   1. Réchauffez sans sérummoyen et DMEM / 9% de FCS à 37 ° C.
   2. Ajouter 0,75 ul de réactif de transfection à 18,75 pi de milieu exempt de sérum. Vortex brièvement pour mélanger. Incuber à température ambiante pendant 5 min. Ajouter 0,5 pi de 1 ug / ul ADN dans le réactif transfectées diluée. Incuber à température ambiante pendant 10 min.
   3. Pendant les 10 minutes d'incubation, retirer le support de chaque puits de la plaque de 24 puits et ajouter 250 microlitres DMEM frais / 9% FCS à chaque puits.
   4. Après 10 min, ajouter 250 pi de DMEM / FCS 9% dans le mélange réactif / ADN.
   5. Ajouter 270 ul du mélange dilué dans le puits. Incuber dans un incubateur à _CO2 à 37 ° C et 5% pour les 2 - 4 heures.
   6. Enlever la solution de transfection et ajouter 500 ul de DMEM / 9% de FCS. Incuber pendant 24 à 48 heures dans un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur.

4. cellulaire Stimulation et de dosage de luciférase

1. Remplacez le support dans les bien avec 250 pi de DMEM frais / 9% de FCS.
2. Ajouter 50 ul de LPS ou LPS + IL-10 Aux concentrations désirées dans le puits. Retourner la plaque à la 37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur. Stimuler pour les 2 - 6 heures.
3. Enlever la solution de stimulation par aspiration, laver avec de la glace froide PBS, et ajouter 200 ul de tampon de lyse passive 1x. Rock à température ambiante pendant 30 min. Grattez et transférer le lysat tubes de 1,5 ml et éliminer les débris cellulaires par centrifugation à 20.000 g pendant 10 min à 4 ° C.
4. Transfert 40 pi de lysat clarifié (surnageant) à une plaque de 96 puits à fond transparent blanc pour la détermination de signaux luciférase selon le protocole du fabricant.
5. Lire le signal de la luciférase avec un luminomètre à travers l'ensemble du spectre de la lumière visible.

5. Analyse des données

1. Calculer la luciole: Renilla rapport en divisant les valeurs individuelles de la luciférase de luciole par les valeurs de la luciférase de Renilla dans chaque puits.
2. Calculer le facteur de changement en divisant la luciole: Renilla rapport de la bien traités parcelle du puits non traitée.

La figure 1 compare l'efficacité de transfection des deux réactifs de transfection dans RAW264.7. Le réactif à base de lipides a typiquement taux de transfection d'environ 25%, tandis que la transfection à base de polyamine de protéine / a donné lieu à environ 5% d'efficacité (figure 1A). La différence dans l'efficacité de transfection a été également observée dans les signaux de luciférase dans les cellules transfectées avec le RAW264.7 pGL3-promoteur IκBζ rapporteur (figure 1B). Ajout de LPS à ces cellules transfectées augmenté de signal luciférase de luciole, une indication directe de l'augmentation de l'activité de transcription du promoteur journaliste IκBζ. En d'autres termes, les résultats suggèrent que le LPS régulée à la hausse l'expression du gène IκBζ, en accord avec les rapports précédents 7,8. La figure 2 montre les résultats typiques obtenus dans nos expériences, en utilisant la transfection à base de lipides, par exemple. Après l'obtention de valeurs de signaux individuels de firefly luciférase et la luciférase de Renilla (figures 2A et 2B), les signaux de la luciférase de luciole ont été normalisées pour le signal de la luciférase de Renilla (figure 2C). La normalisation est recommandée en raison de la variation-puits à l'efficacité de transfection. Pour déterminer si les conditions de traitement (LPS ou LPS + IL-10) ont modifié les signaux rapporteurs, la luciole: rapport de Renilla (à savoir les signaux normalisés) des groupes de traitement ont été comparés à celui de la non traité (non stimulé) échantillon (figure 2D ). Nos données montrent que le traitement des cellules RAW264.7 avec LPS régulés à la hausse l'activité du promoteur rapporteur pGL3-IκBζ, ce qui indique que le LPS a augmenté le niveau du gène IκBζ de transcription. En présence d'IL-10, le promoteur reporter IκBζ avait une activité plus faible, ce qui suggère que l'IL-10 est capable d'inhiber la transcription induite par le LPS du gène IκBζ. L'/ transfection à base de polyamine-protéine habituellementont donné des valeurs inférieures à la fois dans la luciférase de luciole et les signaux de luciférase Renilla. La figure 3 compare la longueur de temps de repos entre la transfection et la stimulation (24 h ou 48 h), et montre que les signaux de la luciférase a diminué au fil du temps. La diminution du signal n'a pas interféré avec l'interprétation des données lorsque le réactif de transfection à base de lipides a été utilisé (figure 3A); induction par LPS et l'inhibition par l'IL-10 ont été encore observée après 48 heures de repos. Cependant, la diminution du signal était plus importante lorsque la protéine / réactif de transfection à base de polyamine a été utilisé (figure 3B), en particulier les signaux de la luciférase de Renilla. Par conséquent, la différence entre les groupes de traitement n'a pas été observée après un repos de 48 heures.

Un effet indésirable de la transfection est mort des cellules et donc l'impact de chaque méthode de transfection sur le degré d'apoptose a été évaluée. Les cellules ont été transfectées ou non et soumis à l'annexine-V et l'iodure de propidium (PI)coloration. Les lysats préparés à partir de ces cellules ont également été analysées pour la présence de poly ADP protéine intacte et clivé ribose polymerase (PARP). Analyse par cytométrie en flux des cellules annexine-V / PI teinté proposé que la transfection à base de lipides a légèrement augmenté la proportion de cellules positives à l'annexine-V par rapport aux cellules non transfectées, tandis que la transfection à base de polyamine de protéine / n'a pas (figure 4A) . De même, d'après la transfection lipide légèrement augmenté la proportion de la PARP clivée pendant la transfection à base de polyamine de protéine / n'a pas (figure 4B). Cependant, malgré le nombre élevé de cellules apoptotiques, la morphologie des cellules au microscope optique n'a pas changé (Figure 4C). Plus important encore, la réponse biologique des cellules transfectées à base de lipides est restée identique à celles des cellules non transfectées (Figure 4D). Les cellules ont été stimulées avec du LPS ± IL-10, et les quantités de TNF ^5; sécrétée dans le surnageant de culture ont été quantifiés par ELISA. Tant les cellules transfectées et non transfectées à base de lipides ont fait des quantités similaires de TNFa en réponse au LPS et sont inhibées par l'addition d'IL-10. N TNFa a été faite lorsque les cellules ont été stimulées pas (figure 4D), suggérant que les cellules restent naïfs après la transfection.

Figure 1. La transfection à base de lipides a donné une plus grande efficacité de transfection de la / transfection à base de polyamine-protéine. (A) des cellules RAW264.7 ont été transfectées un plasmide exprimant la GFP avec soit les base de lipides ou des réactifs de transfection à base de polyamine de protéine /. signal de la GFP a été mesurée par cytométrie de flux après 24 h. (B) les cellules RAW264.7 ont été transfectées avec le promoteur reporter pGL3-IkBζ. Après 48 heures de repos, caunes ont été stimulées avec LPS pendant 6 heures. Signal de la luciférase Firefly a été mesurée selon les instructions du fabricant. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. Les données de l'essai de la luciférase de cellules typiques. RAW264.7 ont été transfectées avec le TK-Renilla et IkBζ promoteur journaliste. Après 24 heures de repos, les cellules ont été stimulées avec LPS ± IL-10 pendant 2 heures. (A) la luciférase de luciole et (B) des signaux de la luciférase de Renilla ont été mesurés selon les instructions du fabricant dosage de la luciférase. (C) l'activité du rapporteur a été normalisée au signal TK-Renilla et tracée en rapport Firefly / Renilla. (D) Pliez le changement est calculé en divisant leFirefly:. rapport Renilla des échantillons stimulés par celle de l'échantillon non stimulées S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. La puissance du signal de la luciférase est dépendant du temps. (A) (b) des cellules transfectées à base de polyamine de protéine / transfectée à base de lipides et ont été laissées au repos pendant soit 24 heures ou 48 heures avant la stimulation avec du LPS ± IL-10 pendant 2 heures. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

(A) des cellules RAW264.7 ont été transfectées avec le promoteur reporter IkBζ. Après 24 heures de repos, la mort cellulaire a été évaluée par l'annexine-V et l'iodure de propidium (PI) coloration sur un cytomètre de flux. (B) Les cellules transfectées ont été soumis à l'analyse immuno-de PARP (pleine longueur et clivés) et GAPDH (contrôle du chargement). intensités de la bande ont ensuite été quantifiés en utilisant un logiciel d'imagerie. L = transfection à base de lipides, P = protéine / transfection à base de polyamine, STP = 0,1 uM staurosporine. Images (C) de microscope de cellules transfectées avec le réactif de transfection à base de lipides. (D) Les cellules transfectées avec le réactif de transfection à base de lipides ont été stimulées avec du LPS ± IL-10 pendant 6 heures, et les niveaux des TNFa de cytokines pro-inflammatoires ont été mesurés par ELISA. S'il vous plaît cliquer ilre pour voir une version plus grande de cette figure.

Les auteurs ont rien à révéler.