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Article de méthode

Protein livraison directe aux cellules de mammifères en utilisant la cellule perméable Cys

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DOI :

10.3791/52814

⸱

25 mars 2015

 , 
1Departments of Chemistry and Cell and Molecular Biology, The Scripps Research Institute, 2Shanghai Institute for Advanced Immunochemical Studies, ShanghaiTech University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Domaines à doigt de zinc sont intrinsèquement perméable cellule et capable de médier la délivrance de protéines dans une large gamme de types de cellules de mammifères. Ici, un protocole étape par étape détaillé pour la mise en œuvre de la technologie à doigt de zinc pour la livraison de protéine intracellulaire est présenté.

Résumé

En raison de leur modularité et de leur capacité à être reprogrammés pour reconnaître un large éventail de séquences d’ADN, les domaines de liaison à l’ADN Cys2-His 2 zinc-finger sont apparus comme des outils utiles pour l’ingénierie génomique ciblée. Comme beaucoup d’autres protéines de liaison à l’ADN, les doigts de zinc possèdent également la capacité innée de traverser les membranes cellulaires. Nous avons récemment démontré que cette perméabilité cellulaire intrinsèque pouvait être exploitée pour l’administration de protéines intracellulaires. La fusion génétique des motifs en doigts de zinc conduit à un transport efficace des protéines et des enzymes dans un large éventail de types de cellules de mammifères. Contrairement à d’autres technologies de transduction de protéines, l’administration via des domaines à doigts de zinc n’inhibe pas l’activité enzymatique et conduit à des niveaux élevés d’administration cytosolique. Ici, un protocole détaillé étape par étape est présenté pour la mise en œuvre de la technologie du doigt de zinc pour l’administration de protéines dans les cellules de mammifères. Les étapes clés pour atteindre des niveaux élevés d’administration intracellulaire médiée par des doigts de zinc sont mises en évidence et des stratégies pour maximiser les performances de ce système sont discutées.

Introduction

Très stratégies de prestation de protéines efficaces et polyvalents sont essentiels pour beaucoup la recherche fondamentale et les applications thérapeutiques. La livraison directe des protéines purifiées dans les cellules représente l'une des méthodes les plus sûres et les plus faciles pour atteindre cet objectif. 1,2 Contrairement aux stratégies qui se appuient sur ​​l'expression des gènes à partir d'acides nucléiques, 3-5 délivrance de protéines ne pose pas de risque de mutagenèse insertionnelle, est indépendante de la transcription / machinerie de traduction cellulaire et permet pour un effet immédiat. Cependant, le manque de méthodes simples et généralisables pour doter l'activité pénétrant dans les cellules sur des protéines confond régulièrement leur entrée directe dans les cellules. Les méthodes actuelles pour faciliter la délivrance de protéines intracellulaires sont basés sur l'utilisation d'origine naturelle ou conçus 08.06 peptides de pénétration cellulaire, 12.9 domaines de transduction suralimentés, 13,14 nanoparticules, des liposomes 15 et 16 particules pseudo-virales 17,18 et les matériaux de microsphères polymères. 19 Malheureusement, plusieurs de ces approches sont entravés par de faibles taux d'absorption cellulaire, 20,21 mauvaise stabilité, 22 par inadvertance spécificité de type cellulaire, 23 bas endosomales échappement propriétés 24 et la toxicité. 25 En outre, beaucoup de protéines technologies de transduction de réduire la bioactivité des protéines livrés. 14

Notre laboratoire précédemment démontré que la nucléase en doigt de zinc (ZFN) protéines - restriction endonucléases chimérique constitué d'un Cys 2 -His deux doigt de zinc protéine de liaison à l'ADN programmable et le domaine de clivage de l'endonucléase de restriction FokI 26-28 - sont intrinsèquement Cell- perméable. 29 Cette activité pénétrant les cellules-surprenant se est révélée être une propriété intrinsèque du domaine en doigt de zinc conçu sur mesure, une plate-forme de liaison à l'ADN qui a émergé comme un outil puissant pour génome ciblé eningé-, 30-32 et est considéré comme le résultat de la constellation de six résidus chargés positivement sur ​​la surface de la protéine. En effet, plusieurs protéines de liaison à l'ADN, y compris c-Jun et N-DEK ont été démontré qu'ils possèdent une capacité innée à traverser les membranes cellulaires. 33 Plus récemment, notre laboratoire élargi sur ces résultats et a démontré que l'activité pénétrant dans les cellules du zinc doigt (ZiF) domaines pourraient être mises à profit pour la livraison de protéine intracellulaire. Fusion génétique soit des domaines de ZIF une ou deux doigts à la cargaison de protéine spécifique conduit à l'absorption efficacité qui dépassaient de nombreux systèmes de livraison classiques de peptides de pénétration cellulaire. 34 Plus particulièrement, la livraison ZiF médiation n'a pas compromis l'activité de fret enzymatique fusionné et facilité des niveaux élevés de livraison cytosolique. Collectivement, ces résultats démontrent le potentiel du domaine ZiF pour faciliter la prestation efficace et facile de protéines, et potentiellement plus divers types de macromolécules, dans les cellules.

Ici, un protocole étape par étape détaillées sur la façon de mettre en œuvre la technologie ZIF pour la distribution des protéines dans les cellules de mammifères sont présentées. Nous avons déjà construit une suite de un, deux, trois, quatre, cinq et six doigt des domaines ZIF qui ne ont pas la capacité de lier l'ADN, en raison de la substitution de chacun des résidus de liaison à l'ADN α-hélicoïdale, mais sont capables de délivrer des protéines dans des cellules 34 (figure 1). La production et la transduction de Emerald GFP (EmGFP) dans des cellules HeLa en utilisant un domaine ZiF deux doigt est décrite. Ce protocole est extensible à presque ne importe quelle protéine soluble capable d'expression dans Escherichia coli et presque ne importe quel type de cellule de mammifère. Les résultats attendus sont fournis et des stratégies pour maximiser la performance de ce système sont également discutés.

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Protocole

1. Clonage

  1. Obtenir deux doigts domaines ZIF substitution alanine qui ont été sous-clonés dans le système de vecteur d'expression pET-28 et sont disponibles sur demande (PET-2F-ZiF). 34
  2. Amplifier par PCR à partir du plasmide EmGFP Emerald-pBAD avec les amorces 5 'Xmal-EmGFP (5'-CCCGGG GGAAATTG ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC-3'; Xmal place en gras) et 3 'Sacl-EmGFP (5'-CGGATCT TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG GAGCTC-3' ; Sac I site en gras).
    1. Utilisez 5 ng d'ADN matrice, 10 ul de tampon 10X de la polymérase, une unités (U) de Taq ADN polymerase, 0,2 mM de chaque dNTP et 0,2 uM de chaque amorce dans une solution de 100 pi avec le volume restant constitué d'eau distillée / désionisée . Utiliser les conditions de cyclisme: 95 ° C pendant 5 min; 30 cycles de 95 ° C pendant 30 sec, 55 ° C pendant 30 sec et 72 ° C pendant 1 min; 72 ° C pendant 10 min. Purifier le produit PCR par gel extractiet à déterminer la concentration d'ADN en utilisant un spectrophotomètre mesurant Abs 260 x 50 ug / ml.
  3. Digest pET-2F-ZiF et l'insert codant EmGFP avec les enzymes de restriction Xmal et Sac I dans le tampon recommandé pendant 3 heures à 37 ° C en utilisant 10 U d'enzyme par 1 ug d'ADN. Visualiser l'ADN par électrophorèse sur gel d'agarose en utilisant un colorant d'intercalation fluorescent, tel que le bromure d'éthidium.
  4. Purifier l'ADN digéré par le kit d'extraction sur gel et déterminer la concentration d'ADN par un spectrophotomètre mesurant Abs 260 x 50 ug / ml.
  5. Ligaturer l'ADN codant EmGFP purifié dans 50 à 100 ng de pET-2F-ZiF en utilisant 1 U de T4 DNA Ligase pendant au moins 1 h à température ambiante. Pour de meilleurs résultats, effectuer la réaction de ligature en utilisant un rapport de 6: 1 insert-à-vecteur molaire.
  6. Thaw 50 pi de toute cellules XL-1 coli Bleu Escherichia chimiquement compétentes sur la glace et mélanger doucement avec 10-20 ng d'ligaturé pET-2F-ZiF-EmGFP.
  7. Gardez sur la glace pendant 30 min. choc thermique le mélange à 42 ° C pendant 90 secondes et récupérer les cellules dans 2 ml de bouillon de Super optimale avec la répression catabolique (SOC) pendant 1 heure à 37 ° C avec agitation.
  8. Étaler 100 pi de la culture de récupération sur un bouillon de lysogénie (LB) plaque de gélose avec 50 ug / ml de kanamycine et incuber O / N à 37 ° C.
  9. Le lendemain, inoculer 6 ml de Super Broth (SB) ou à la culture LB contenant 50 pg / ml de kanamycine avec une colonie de la plaque de gélose LB et la culture O / N à 37 ° C.
    Remarque: colonie PCR en utilisant les amorces 5 'Xmal-EmGFP et 3' Sacl-EmGFP pourrait être utilisée pour identifier des clones positifs avant Miniprep.
  10. Purifier pET-2F-ZiF-EmGFP par miniprep et confirmer plasmide par séquençage d'ADN en utilisant le promoteur T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ').

2. Expression et purification

  1. Décongeler 50 pi de chimiquement compétente BL21 E. coli cellules sur la glace et mélanger doucement avec 100 ng de PET-2F-ZiF-EmGFP plasmid. Transformez comme décrit dans les étapes 1.7 à 1.8.
  2. Le lendemain, inoculer 10 ml de milieu LB contenant 50 ug / ml de kanamycine avec une colonie unique et faire croître O / N à 37 ° C avec agitation par secousses.
  3. Le jour suivant, les diluer 10 ml de culture O / N dans 1 L de milieu LB additionné de 50 pg / ml de kanamycine, 0,2% de glucose et 100 uM ZnCl2. Cultiver la culture à 37 ° C avec agitation par secousses à une densité optique à 600 nm (DO600) de 0,8 et induire l'expression de la protéine avec 2 mM d'isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). Après 6 heures de croissance à 37 ° C, les cellules de récolte par centrifugation à 5000 xg pendant 10 min à 4 ° C.
    Nota: conditions d'induction sont très variables et dépendent de la stabilité des protéines est exprimé. Surveiller la DO 600 toutes les 30 minutes jusqu'à ce qu'une DO 600 de 0,8 soit atteint.
  4. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 5 ml de tampon de lyse (50 mM Tris-HCl, 500 mM de NaCl, 100 uM de ZnCl2, 1 mM dithiothréitol (DTT), 1 mM de MgCl2, 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) et de l'imidazole 10 mM, pH 8,0). Lyse des cellules sur la glace par ultrasons avec le réglage suivant: sortie de puissance de 50%, 4 min temps de processus avec 5 sec sur / 10 sec éteint intervalles. Éviter la surchauffe de la solution.
  5. Centrifuger le lysat cellulaire à 25 000 xg pendant 30 min à 4 ° C et transférer le surnageant dans un nouveau tube de collecte. Pour de meilleurs résultats, effectuer toutes les étapes suivantes à 4 ° C.
  6. Exécuter le surnageant à travers une colonne pré-garnie de 1 ml d'une suspension équilibrée de Ni-NTA. Laver la résine avec 20 ml de tampon de lavage (50 mM de Tris-HCl, 500 mM de NaCl, 100 uM de ZnCl2, 1 mM de DTT, 1 mM MgCl 2 et 30 mM d'imidazole, pH 8,0).
  7. Eluer la protéine avec 5 ml de tampon d'élution (50 mM de Tris-HCl, 500 mM de NaCl, 100 uM de ZnCl2, 1 mM de DTT, 1 mM de MgCl2, et 300 mM d'imidazole, pH 8,0).
  8. Tampon échanger la protéine est éluée avec un tampon de stockage (50 mMTris-HCl, 500 mM de NaCl, 100 uM de ZnCl2, 1 mM de DTT, 1 mM de MgCl2 et 10% de glycerol, pH 8,0) et on concentre la protéine à au moins 40 uM en utilisant un concentreur centrifuge par centrifugation selon les instructions du fabricant.
  9. Déterminer la concentration de protéines par BCA ou dosage de Bradford. Mélanger 2 ul de protéines purifiées avec 2 pi 2 × SDS-PAGE colorant de charge, faire bouillir à 95 ° C pendant 10 min, puis résoudre le 4% à 20% de Tris-Glycine SDS-PAGE pour évaluer la pureté de la protéine (figure 2).

3. Protéines de stockage

  1. Aliquoter la protéine concentrée, gel rapide dans l'azote liquide et conserver à -80 ° C. Pour les protéines de fusion EmGFP, couvrir le tube de papier d'aluminium pour protéger la protéine de la lumière.
  2. Évitez congélation et décongélation de la solution de protéine répétée. Remarque: protéines ZiF fusionnés sont stables dans ces conditions pendant au moins un mois. Ou> 4 stockage inapproprié de mois peut conduireà la précipitation des protéines ou des EmGFP photoblanchiment.

4. Protéines de transduction

  1. Maintenir des cellules HeLa dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) contenant 10% (v / v) de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% d'antibiotique-antimycotique à 37 ° C dans une atmosphère complètement humidifiée avec 5% de CO 2.
    Note: Les cellules des passages plus de 30 fois ne sont pas recommandés pour la protéine de transduction.
  2. Pré-enduire une plaque à 24 puits avec 500 ul de 50 ug / ml de poly-lysine pendant 30 à 60 min à 25 ° C. cellules de semences sur une plaque de 24 puits à une densité de 2 x 10 5 cellules par puits. À 24 h après le semis, ou une fois les cellules sont entre 80% -90% de confluence, retirer les supports de chaque puits et laver avec 500 pi de DMEM sans sérum préchauffé (AFD).
  3. Pour chaque puits, ajouter 250 pi de GDF contenant 2 uM de la protéine ZiF-EmGFP et 100 uM ZnCl 2. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 1 heure. Remarque: ZIF domaines pénètrent dans les cellules primarily travers macropinocytose, 34 qui est un mécanisme dépendant de l'énergie. Par conséquent, les cellules doivent être incubées à 37 ° C pendant une internalisation efficace de la protéine.
  4. Retirez le support de cellules et laver trois fois avec 500 ul de calcium et sans magnésium tamponnée au phosphate salin de Dulbecco (DPBS) supplémenté avec 0,5 mg / ml d'héparine. Remarque: L'héparine est nécessaire pour éliminer la protéine liée à la surface qui pourraient compliquer les analyses en aval.
  5. (Facultatif) Les traitements répétés jusqu'à trois fois pour une meilleure exécution.
  6. Isoler les cellules traitées immédiatement après l'héparine lavage par digestion avec 0,05% de trypsine-EDTA à 37 ° C pendant 2 min. Remettre en suspension les cellules détachées dans 0,5 ml de DPBS supplémenté avec 1% de FBS.
  7. Mesurer l'intensité de fluorescence de chaque échantillon par cytométrie de flux en utilisant le canal 35 l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) (figure 3). Réglez la diffusion vers l'avant (FSC) et la diffusion latérale (SSC) à placer la population deintérêt à l'échelle, en assurant que les populations ayant des propriétés différentes sont réglées l'une de l'autre.
  8. Recueillir 10 000 événements en direct pour chaque échantillon et d'analyser les données en utilisant la cytométrie en flux analyse des données logiciel. 36 Normaliser la fluorescence de cellules HeLa traitées avec ZiF-EmGFP à ces cellules traitées seulement avec GDF.

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Résultats

Deux doigts protéines de fusion ZiF-EmGFP peuvent être exprimées dans E. coli avec> 95% d'homogénéité et des rendements élevés (> 25 mg / ml) (Figure 2). En général, un ou deux doigts protéines de fusion ZIF peuvent être produites en quantités presque identiques à celles de type sauvage protéine non modifiée. Toutefois, dans certains contextes, des protéines de fusion ZiF cinq et six doigts ne peuvent pas être produits avec des rendements suffisamment élevés pour les applications en a...

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Discussion

Ici, un protocole étape par étape, pour la délivrance de protéines à doigt de zinc en utilisant (ZiF domaines cellulaires) perméable est présentée. Le domaine ZiF ne réduit pas l'activité enzymatique de la cargaison 34 condensé; permet la production et la purification de protéines avec des rendements pratiquement identiques à celles observées avec la protéine non modifiée; et peut transporter des protéines et des enzymes dans un large éventail de types de cellules avec des rendements qui dépassent peptidi...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé (DP1CA174426 à Carlos F. Barbas) et l'Université ShanghaiTech, Shanghai, Chine (à JL). Graphiques moléculaires ont été générés en utilisant PyMol.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
XmaINew England BiolabsR0180L
SacINew England BiolabsR0156L
Expand Système PCR haute fidélitéRoche11759078001
dNTPsNew England BiolabsN0446S
4 %-20 % Tris-Glycine Mini gels de protéines, 1,5 mm, 10 puitsLife TechnologiesEC6028BOX
2x Laemmli Sample BufferBioRad161-0737
T4 DNA LigaseLife Technologies15224-017
BL21 (DE3) Compétent E. coliNewEngland BiolabsC2527I
IPTGThermo ScientificR0391
Chlorure de zincSigma-Aldrich208086-5G
Sulfatede kanamycineFisher ScientificBP906-5
GlucoseSigma-AldrichG8270-100G
Tris BaseFisher ScientificBP152-25
Chlorure de sodiumSigma-AldrichS9888-25G
DTTFisher ScientificPR-V3151 ;
PMSFThermo Scientific36978
Résine d’agarose Ni-NTAQIAGEN30210
GlycérolSigma-AldrichG5516-500ML
ImidazoleSigma-AldrichI5513-25G
Unités de filtration centrifuge Amicon Ultra-15 EMOMilliporeUFC900324
DMEMLife Technologies11966-025
Fetal Bovin SerumLife Technologies10437-028
Antibiotique-Antimycosique  ;Life Technologies15240-062
Plaque à fond plat 24 puitsSigma-AldrichCLS3527-100EA
Poly-LysineSigma-AldrichP7280
DPBS, sans calcium, sans magnésiumTechnologies21600010
Sulfate d’héparaneSigma-AldrichH4777
TrypsineLife Technologies
cellules HeLaSpectrophotomètre ATCCCCL-2
Nano Drop ND-1000  ;Thermo Fisher Scientific
QIAquick Kit de purification PCRQIAGEN28104
Kit d’extraction de gel QIAquickQIAGEN28704
Life 25300054

Références

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