Protein livraison directe aux cellules de mammifères en utilisant la cellule perméable Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -His<sub&gt; 2</sub&gt; Domaines doigt de zinc

Résumé

Domaines à doigt de zinc sont intrinsèquement perméable cellule et capable de médier la délivrance de protéines dans une large gamme de types de cellules de mammifères. Ici, un protocole étape par étape détaillé pour la mise en œuvre de la technologie à doigt de zinc pour la livraison de protéine intracellulaire est présenté.

Résumé

En raison de leur modularité et de leur capacité à être reprogrammés pour reconnaître un large éventail de séquences d’ADN, les domaines de liaison à l’ADN Cys_{2-His 2} zinc-finger sont apparus comme des outils utiles pour l’ingénierie génomique ciblée. Comme beaucoup d’autres protéines de liaison à l’ADN, les doigts de zinc possèdent également la capacité innée de traverser les membranes cellulaires. Nous avons récemment démontré que cette perméabilité cellulaire intrinsèque pouvait être exploitée pour l’administration de protéines intracellulaires. La fusion génétique des motifs en doigts de zinc conduit à un transport efficace des protéines et des enzymes dans un large éventail de types de cellules de mammifères. Contrairement à d’autres technologies de transduction de protéines, l’administration via des domaines à doigts de zinc n’inhibe pas l’activité enzymatique et conduit à des niveaux élevés d’administration cytosolique. Ici, un protocole détaillé étape par étape est présenté pour la mise en œuvre de la technologie du doigt de zinc pour l’administration de protéines dans les cellules de mammifères. Les étapes clés pour atteindre des niveaux élevés d’administration intracellulaire médiée par des doigts de zinc sont mises en évidence et des stratégies pour maximiser les performances de ce système sont discutées.

Introduction

Très stratégies de prestation de protéines efficaces et polyvalents sont essentiels pour beaucoup la recherche fondamentale et les applications thérapeutiques. La livraison directe des protéines purifiées dans les cellules représente l'une des méthodes les plus sûres et les plus faciles pour atteindre cet objectif. ^1,2 Contrairement aux stratégies qui se appuient sur ​​l'expression des gènes à partir d'acides nucléiques, ^3-5 délivrance de protéines ne pose pas de risque de mutagenèse insertionnelle, est indépendante de la transcription / machinerie de traduction cellulaire et permet pour un effet immédiat. Cependant, le manque de mét....

Protocole

1. Clonage

1. Obtenir deux doigts domaines ZIF substitution alanine qui ont été sous-clonés dans le système de vecteur d'expression pET-28 et sont disponibles sur demande (PET-2F-ZiF). ³⁴
2. Amplifier par PCR à partir du plasmide EmGFP Emerald-pBAD avec les amorces 5 'Xmal-EmGFP (5'-CCCGGG GGAAATTG ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC-3'; Xmal place en gras) et 3 'Sacl-EmGFP (5'-CGGATCT TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG GAGCTC-3' ; Sac I site en gras).
   1. Utilisez 5 ng d'ADN matrice, 10 ul de tampon 10X de la polymérase, une unités (U) de Taq ADN polymerase, 0,2 mM ....

Résultats

Deux doigts protéines de fusion ZiF-EmGFP peuvent être exprimées dans E. coli avec> 95% d'homogénéité et des rendements élevés (> 25 mg / ml) (Figure 2). En général, un ou deux doigts protéines de fusion ZIF peuvent être produites en quantités presque identiques à celles de type sauvage protéine non modifiée. Toutefois, dans certains contextes, des protéines de fusion ZiF cinq et six doigts ne peuvent pas être produits avec des rendements suffisamment élevés pour les applications en a.......

Discussion

Ici, un protocole étape par étape, pour la délivrance de protéines à doigt de zinc en utilisant (ZiF domaines cellulaires) perméable est présentée. Le domaine ZiF ne réduit pas l'activité enzymatique de la cargaison ³⁴ condensé; permet la production et la purification de protéines avec des rendements pratiquement identiques à celles observées avec la protéine non modifiée; et peut transporter des protéines et des enzymes dans un large éventail de types de cellules avec des rendements qui dépassent peptidi.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
XmaI	New England Biolabs	R0180L
SacI	New England Biolabs	R0156L
Expand Système PCR haute fidélité	Roche	11759078001
dNTPs	New England Biolabs	N0446S
4 %-20 % Tris-Glycine Mini gels de protéines, 1,5 mm, 10 puits	Life Technologies	EC6028BOX
2x Laemmli Sample Buffer	BioRad	161-0737
T4 DNA Ligase	Life Technologies	15224-017
BL21 (DE3) Compétent E. coliNew	England Biolabs	C2527I
IPTG	Thermo Scientific	R0391
Chlorure de zinc	Sigma-Aldrich	208086-5G
Sulfate	de kanamycineFisher Scientific	BP906-5
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-100G
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-25
Chlorure de sodium	Sigma-Aldrich	S9888-25G
DTT	Fisher Scientific	PR-V3151 ;
PMSF	Thermo Scientific	36978
Résine d’agarose Ni-NTA	QIAGEN	30210
Glycérol	Sigma-Aldrich	G5516-500ML
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513-25G
Unités de filtration centrifuge Amicon Ultra-15 EMO	Millipore	UFC900324
DMEM	Life Technologies	11966-025
Fetal Bovin Serum	Life Technologies	10437-028
Antibiotique-Antimycosique  ;	Life Technologies	15240-062
Plaque à fond plat 24 puits	Sigma-Aldrich	CLS3527-100EA
Poly-Lysine	Sigma-Aldrich	P7280
DPBS, sans calcium, sans magnésium	Technologies	21600010
Sulfate d’héparane	Sigma-Aldrich	H4777
Trypsine	Life Technologies
cellules HeLa	Spectrophotomètre ATCC	CCL-2
Nano Drop ND-1000  ;	Thermo Fisher Scientific
QIAquick Kit de purification PCR	QIAGEN	28104
Kit d’extraction de gel QIAquick	QIAGEN	28704

Life 25300054