Encapsulation alginate de cellules souches pluripotentes en utilisant une buse de co-axiale

Résumé

Nous avons mis au point une méthode d’encapsulation de cellules souches pluripotentes (cellules PS) dans des capsules d’hydrogel d’alginate à l’aide d’une buse coaxiale. Cela empêche les cellules de s’agréger excessivement et limite le stress de cisaillement subi par les cellules en culture en suspension. La technique est applicable à la production de masse de cellules PS ainsi qu’à la recherche sur la niche des cellules souches.

Résumé

Les cellules souches pluripotentes (cellules PS) font l’objet d’intenses recherches en raison de leur rôle dans la médecine régénérative et le criblage de médicaments. Cependant, le développement d’un système de culture de masse serait nécessaire pour utiliser des cellules PS dans ces applications. La culture en suspension est une méthode de culture prometteuse pour la production de masse de cellules PS, bien que certains problèmes tels que le contrôle de l’agrégation et la limitation de la contrainte de cisaillement du milieu de culture ne soient toujours pas résolus. Afin de résoudre ces problèmes, nous avons développé une méthode d’encapsulation de l’alginate de calcium (Alg-Ca) à l’aide d’une buse coaxiale. Cette méthode permet de contrôler facilement la taille des capsules en co-écoulant le gaz N₂. Le diamètre de la capsule contrôlable doit être supérieur à 500 μm car un débit trop élevé de gaz N₂ provoque la dégradation de gouttelettes et donc de capsules de tailles hétérogènes. De plus, une faible concentration d’Alg-Na et de CaCl₂ provoque des capsules non sphériques. Bien qu’une capsule d’Alg-Ca sans revêtement d’Alg-PLL se dissolve facilement, ce qui permet la collecte de cellules, elle peut également s’échapper des capsules sans revêtement d’Alg-PLL. En effet, un revêtement d’alginate-PLL peut empêcher les fuites cellulaires mais est également difficile à casser. Cette technologie peut être utilisée pour étudier le créneau des cellules souches ainsi que la production de masse de cellules PS, car l’encapsulation peut modifier le micro-environnement entourant les cellules, y compris la matrice extracellulaire et la concentration des facteurs sécrétés.

Introduction

Les cellules souches pluripotentes induites (cellules iPS) font actuellement l’objet d’intenses recherches en raison de leur rôle en médecine régénérative. Cependant, d’énormes quantités de cellules sont nécessaires à la régénération des tissus. Par exemple, environ un milliard de cellules pancréatiques sont nécessaires pour^{un patient diabétique} de type 1. Cependant, la culture conventionnelle en boîte ne permet d’obtenir que 1 × 10⁵ cellules/^cm2, ce qui nécessite 1^m2 de surface de culture pour obtenir suffisamment de cellules pancréatiques dérivées de cellules souches pour traiter un patient diabétique de type 1. Le dév....

Protocole

1. Matériaux Préparation

1. Préparer tampon HEPES 10 mM. Ajuster le pH à 7,0 à température ambiante et ajouter du NaCl à 0,9%.
2. Préparer la solution d'alginate à 5% et une solution 10 mM d'EDTA en mélangeant une solution saline tamponnée au HEPES préparé en 1.1. Ajuster le pH à 7,0 à température ambiante.
3. Autoclave les réactifs (1.1, 1.2) pendant 20 min à 121 ° C.
4. Préparer des plats 60 mm revêtues de gélatine en couches avec de 1,2 à 2,0 × 10 ⁶ souris fibroblaste embryonnaire (MEF) des cellules, qui sont traités comme cellules nourricières par incubation à l'intérieur du DMEM contenant 10% de FBS ES-qualifié....

Résultats

Au protocole 2.5, la solution d'alginate expulsé forme une forme sphérique immédiatement après l'expulsion (Figure 2A - H). Si la suspension est expulsé avec une vitesse d'écoulement inférieure à ₂ N 1L / min, la taille des gouttelettes est uniforme (figure 2I). Cependant, si le débit de N ₂ est supérieur à 1 L / min, la gouttelette tombe en panne (figure 2G, repéré par une flèche blanche) et la taille des gouttelettes devient hétérogène (f.......

Discussion

culture d'encapsulation peut être comparé à des cultures en suspension directe. Suspension de culture est un procédé plus simple d'obtenir de grandes quantités de cellules souches pluripotentes que les méthodes d'encapsulation. Toutefois, le contrôle de l'agrégation des cellules en culture en suspension est encore difficile. Dans le procédé d'encapsulation, l'agrégation cellulaire est limitée dans des capsules et peuvent donc être bien contrôlée. Une publication antérieure a montré que les .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Fibroblaste d’embryon de souris	Cell Biolabs	SNL 76/7
Cellule souche pluripotente induite par la souris	Centre de résorpèse RIKEN Bio	iPS-MEF-Ng-20D-17
DMEM à haute teneur en glucose	GIBCO	11995
ES qualifié. FBS	GIBCO	16141079
Antibiotiques antibactériens	GIBCO	15240
Acide aminé non essentiel	GIBCO	11140
2-mercaptoéthanol	GIBCO	21985-023
ESGRO Facteur inhibiteur de la leucémie	Merck Millipore	ESG1107
Trypsine/EDTA	GIBCO	25300
Aiguille 26 G/16 G	Hoshiseido
10 ml Seringue	TERUMO	SS-10ESZ
Sodium  ; Chlorure	Wako	191-01665
HEPES	SIGMA	H4034
Alginate de sodium	Wako	194-09955
Chlorure de calcium	Wako	039-00475
Poly-L-lysine (MW = 15 000 - 30 000)	SIGMA	P7890
EDTA	DOJINDO	345-01865
Pompe Sylinge	AS ONE
Microscope	Olympus	IX71
Microscope	Leica	DM IRB
Caméra haute vitesse	technologie d’image nac	Memrecam HX-3