Encapsulation alginate de cellules souches pluripotentes en utilisant une buse de co-axiale

Résumé

Nous avons mis au point une méthode d’encapsulation de cellules souches pluripotentes (cellules PS) dans des capsules d’hydrogel d’alginate à l’aide d’une buse coaxiale. Cela empêche les cellules de s’agréger excessivement et limite le stress de cisaillement subi par les cellules en culture en suspension. La technique est applicable à la production de masse de cellules PS ainsi qu’à la recherche sur la niche des cellules souches.

Résumé

Les cellules souches pluripotentes (cellules PS) font l’objet d’intenses recherches en raison de leur rôle dans la médecine régénérative et le criblage de médicaments. Cependant, le développement d’un système de culture de masse serait nécessaire pour utiliser des cellules PS dans ces applications. La culture en suspension est une méthode de culture prometteuse pour la production de masse de cellules PS, bien que certains problèmes tels que le contrôle de l’agrégation et la limitation de la contrainte de cisaillement du milieu de culture ne soient toujours pas résolus. Afin de résoudre ces problèmes, nous avons développé une méthode d’encapsulation de l’alginate de calcium (Alg-Ca) à l’aide d’une buse coaxiale. Cette méthode permet de contrôler facilement la taille des capsules en co-écoulant le gaz N₂. Le diamètre de la capsule contrôlable doit être supérieur à 500 μm car un débit trop élevé de gaz N₂ provoque la dégradation de gouttelettes et donc de capsules de tailles hétérogènes. De plus, une faible concentration d’Alg-Na et de CaCl₂ provoque des capsules non sphériques. Bien qu’une capsule d’Alg-Ca sans revêtement d’Alg-PLL se dissolve facilement, ce qui permet la collecte de cellules, elle peut également s’échapper des capsules sans revêtement d’Alg-PLL. En effet, un revêtement d’alginate-PLL peut empêcher les fuites cellulaires mais est également difficile à casser. Cette technologie peut être utilisée pour étudier le créneau des cellules souches ainsi que la production de masse de cellules PS, car l’encapsulation peut modifier le micro-environnement entourant les cellules, y compris la matrice extracellulaire et la concentration des facteurs sécrétés.

Introduction

Les cellules souches pluripotentes induites (cellules iPS) font actuellement l’objet d’intenses recherches en raison de leur rôle en médecine régénérative. Cependant, d’énormes quantités de cellules sont nécessaires à la régénération des tissus. Par exemple, environ un milliard de cellules pancréatiques sont nécessaires pour^{un patient diabétique} de type 1. Cependant, la culture conventionnelle en boîte ne permet d’obtenir que 1 × 10⁵ cellules/^cm2, ce qui nécessite 1^m2 de surface de culture pour obtenir suffisamment de cellules pancréatiques dérivées de cellules souches pour traiter un patient diabétique de type 1. Le développement d’un système de culture de masse de cellules souches pluripotentes, tel que le microcarrier² et la culture en suspension, est donc nécessaire pour la médecine régénérative. La culture en suspension représente une méthode prometteuse de culture de masse, mais le contrôle de l’agrégation des cellules est difficile dans les cultures en suspension directe de cellules iPS humaines³. En effet, les cellules en suspension sont exposées à des contraintes de cisaillement, ce qui provoque des dommages cellulaires³ ou une différenciation⁴.

Des recherches sur l’encapsulation à base d’hydrogel ont été menées pour résoudre les problèmes associés à la culture en suspension. Dans les gélules d’hydrogel, les cellules sont protégées de l’écoulement du fluide. Des rapports précédents ont documenté l’utilisation de divers types d’hydrogel, notamment l’agarose⁵, le PEG⁶ et l’alginate (Alg), pour l’encapsulation cellulaire. L’hydrogel Alg-Ca est l’un des hydrogels les plus utiles pour l’encapsulation cellulaire, car l’hydrogel Alg-Ca se forme immédiatement après la chute d’une solution d’alginate dans une solution de CaCl₂ et est également facilement digéré par des enzymes ou des réactifs chélatants.

Ici, nous avons établi un processus stable d’encapsulation d’alginate pour les cellules iPS à l’aide d’une buse coaxiale. En utilisant le flux de gaz N₂ pour former des gouttelettes, il est possible d’encapsuler les cellules dans des capsules uniformes sans avoir besoin d’autres réactifs tels que l’huile. Dans cette méthode, le débit de N₂ et la concentration de CaCl₂ et d’alginate sont les principales conditions de fonctionnement affectant la taille, la forme et l’uniformité des capsules. Ce rapport démontre l’optimisation de ces conditions de fonctionnement grâce à l’utilisation d’une caméra haute vitesse et d’un microscope.

Protocole

1. Matériaux Préparation

1. Préparer tampon HEPES 10 mM. Ajuster le pH à 7,0 à température ambiante et ajouter du NaCl à 0,9%.
2. Préparer la solution d'alginate à 5% et une solution 10 mM d'EDTA en mélangeant une solution saline tamponnée au HEPES préparé en 1.1. Ajuster le pH à 7,0 à température ambiante.
3. Autoclave les réactifs (1.1, 1.2) pendant 20 min à 121 ° C.
4. Préparer des plats 60 mm revêtues de gélatine en couches avec de 1,2 à 2,0 × 10 ⁶ souris fibroblaste embryonnaire (MEF) des cellules, qui sont traités comme cellules nourricières par incubation à l'intérieur du DMEM contenant 10% de FBS ES-qualifiés, et 10 ug / ml de mitomycine C pendant 90 - 120 min.
5. Maintenir la souris induit souches pluripotentes (iPS) cellules sur le plat avec les cellules nourricières en présence de 5 ml de DMEM riche en glucose contenant 20% d'ES qualifié FBS, 50 M de 2-mercaptoéthanol, acide aminé non essentiel, et des antibiotiques ( 100 unités / ml de pénicilline G sodique, 100 ug / ml de sulfate de streptomycine et 250 ng / ml de amphotericin B).
6. Seed 4 × 10 ⁵ cellules iPS sur une boîte de 60 mm revêtu de gélatine et les incuber à 37 ° C et 5% de CO _2. Changer le milieu de culture tous les jours pendant l'incubation. Après 3-4 jours de culture, les cellules trypsiniser pendant 1 min avec 500 pi de trypsine à 0,05% contenant 0,02% d'EDTA à 37 ° C et 5% de CO _2. Après cela, détacher les cellules en tapant sur la boîte de culture dix fois.
7. Ajouter 2,5 ml de DMEM avec 10% de FBS et des antibiotiques ES-qualifié (après iPS dissociation de souris des cellules dans des cellules individuelles par pipetage avec 1000 ul micropipette trois fois) suspension de cellules de centrifugation à 160 g pendant 3 min et retirez surnageant et compter les cellules . Après le comptage des cellules, réensemencer les cellules recueillies sur un plat revêtu de gélatine et incuber pendant 30 min à isoler les cellules iPS à partir des cellules MEF. Après comptage des cellules (généralement de 1 - 3 × 10 ⁶ cellules / boîte peut être recueillie), réensemencer 4 × 10 ⁵ cellules iPS surle plat.

2. Encapsulation cellulaire dans Alginate hydrogel Capsules

1. Recueillir les cellules par le même mode opératoire décrit dans 1.5 et 1.6. Après centrifugation à 160 x g pendant 3 min, laver le culot de cellules iPS avec une solution saline tamponnée au HEPES trois fois. Après remise en suspension des cellules dans une solution saline tamponnée de HEPES, filtrer la suspension de cellules à travers un tamis de 40 um de la cellule afin d'éliminer les gros agrégats, ce qui pourrait autrement obstruer la buse.
2. Mélanger 2 ml de suspension de cellules au sein de la solution saline tamponnée de HEPES et 3 ml de solution à 5% Alg-Na. Enfin 5 ml de suspension cellulaire à moins de 3% de solution de Na-Alg est obtenu. La densité cellulaire est de préférence plus de 10 ⁶ cellules / ml.
3. Après avoir recueilli la suspension de cellules dans une seringue de 5 ml, installer une buse de co-axial (figure 1A, B) sur la seringue et les mettre sur la pompe à seringue. N ₂ Emit écoulement de gaz (inférieure à 1 L / min) à travers l'aiguille extérieure de la buse de co-axial etexpulser la suspension de cellules à travers la buse intérieure.
4. Recueillir gouttelettes dans 250 ml de solution à 0,5% de _CaCl2 et attendez 10 - 20 min pour la gélification tout en agitant à 60-90 rpm.

3. Traitement des capsules d'alginate (facultatif)

1. Incuber capsules Alg-Ca à 0,05% de poly-L-lysine (PLL) solution pendant 5 minutes à 37 ° C et 5% (p / v) de CO _2.
2. Après lavage des capsules avec une solution saline tamponnée de HEPES, incuber dans du DMEM contenant 10% de FBS dans le but de neutraliser la charge électrique sur leur surface. Utiliser les capsules enrobées comme (figure 1c).
3. Incuber les capsules dans une solution saline tamponnée au HEPES contenant 10 mM d'EDTA pendant 5 min. Les capsules traitées EDTA sont utilisés sous forme de capsules creuses (Figure 1C).

4. Culture et recueillir des cellules dans de l'alginate Capsules

1. Incuber les cellules encapsulées à 75 tours par minute sous agitation à 37 ° C et 5% de CO ₂pendant 10 jours.
2. Recueillir et incuber les capsules dans 10 mM d'EDTA à 37 ° C et 5% de _CO2 pendant 10 min. Recueillir les cellules des capsules d'alginate sans traitement PLL par centrifugation à 1 000 g pendant 3 min.
3. Si les capsules d'alginate sont traités avec PLL, briser la membrane Alg-PLL par pipetage de haut en bas autour de dix fois avec une aiguille fixée à une seringue et centrifuger à 1,000 - 5,000 g pendant 5 min. diamètre de l'aiguille doit être inférieure à la taille de la capsule et G 25 (260 um) d'aiguilles sont utilisées dans cette expérience (600 um)
4. Après centrifugation, recueillir culot cellulaire strictement cassés membranes Alg-PLL si vous voulez prélever des échantillons d'ARNm à partir de cellules. Restants membranes Alg-PLL éventuellement, de prévenir la purification de l'ARNm.

Résultats

Au protocole 2.5, la solution d'alginate expulsé forme une forme sphérique immédiatement après l'expulsion (Figure 2A - H). Si la suspension est expulsé avec une vitesse d'écoulement inférieure à ₂ N 1L / min, la taille des gouttelettes est uniforme (figure 2I). Cependant, si le débit de N ₂ est supérieur à 1 L / min, la gouttelette tombe en panne (figure 2G, repéré par une flèche blanche) et la taille des gouttelettes devient hétérogèn...

Discussion

culture d'encapsulation peut être comparé à des cultures en suspension directe. Suspension de culture est un procédé plus simple d'obtenir de grandes quantités de cellules souches pluripotentes que les méthodes d'encapsulation. Toutefois, le contrôle de l'agrégation des cellules en culture en suspension est encore difficile. Dans le procédé d'encapsulation, l'agrégation cellulaire est limitée dans des capsules et peuvent donc être bien contrôlée. Une publication antérieure a montré que les ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Fibroblaste d’embryon de souris	Cell Biolabs	SNL 76/7
Cellule souche pluripotente induite par la souris	Centre de résorpèse RIKEN Bio	iPS-MEF-Ng-20D-17
DMEM à haute teneur en glucose	GIBCO	11995
ES qualifié. FBS	GIBCO	16141079
Antibiotiques antibactériens	GIBCO	15240
Acide aminé non essentiel	GIBCO	11140
2-mercaptoéthanol	GIBCO	21985-023
ESGRO Facteur inhibiteur de la leucémie	Merck Millipore	ESG1107
Trypsine/EDTA	GIBCO	25300
Aiguille 26 G/16 G	Hoshiseido
10 ml Seringue	TERUMO	SS-10ESZ
Sodium  ; Chlorure	Wako	191-01665
HEPES	SIGMA	H4034
Alginate de sodium	Wako	194-09955
Chlorure de calcium	Wako	039-00475
Poly-L-lysine (MW = 15 000 - 30 000)	SIGMA	P7890
EDTA	DOJINDO	345-01865
Pompe Sylinge	AS ONE
Microscope	Olympus	IX71
Microscope	Leica	DM IRB
Caméra haute vitesse	technologie d’image nac	Memrecam HX-3