Les changements dans les niveaux de calcium intracellulaire dans les podocytes sont l’un des moyens les plus importants de contrôler la fonction de filtration des glomérules. Nous expliquons ici une approche à haut débit qui permet de détecter en temps réel la manipulation du calcium et l’activité des canaux ioniques uniques dans les podocytes des glomérules fraîchement isolés.
Article de méthode
Single-channel Analyse et Imagerie de calcium dans les podocytes des glomérules fraîchement isolés
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les podocytes (cellules épithéliales glomérulaires rénales) sont connus pour réguler la perméabilité glomérulaire et maintenir la structure glomérulaire ; un rôle clé de ces cellules dans la pathogenèse de diverses maladies rénales a été établi puisque les lésions des podocytes entraînent une protéinurie et un effacement du processus du pied. Il a déjà été rapporté que divers agents endogènes peuvent provoquer une surcharge spectaculaire de la concentration intracellulaire de Ca2+ dans les podocytes, conduisant probablement à l’albuminurie, et cela se produit probablement via les canaux ioniques conducteurs de calcium. Par conséquent, il est apparu important d’étudier la manipulation du calcium dans les podocytes à la fois dans des conditions normales et dans divers états pathologiques. Cependant, les approches expérimentales disponibles sont restées quelque peu limitées aux cellules cultivées et transfectées. Bien qu’ils représentent un bon modèle de base pour de telles études, ils sont essentiellement extraits de l’environnement d’origine du glomérule. Nous décrivons ici la méthodologie d’étude des podocytes en tant que partie du glomérule entier fraîchement isolé. Cette préparation conserve le potentiel fonctionnel des podocytes, qui sont toujours attachés aux capillaires ; Par conséquent, les podocytes restent dans l’environnement qui conserve la majeure partie de l’appareil de filtration des glomérules. Le présent manuscrit développe deux approches expérimentales qui permettent 1) la détection en temps réel des changements de concentration en calcium à l’aide de la microscopie confocale à fluorescence ratiométrique, et 2) l’enregistrement de l’activité des canaux ioniques uniques dans les podocytes des glomérules fraîchement isolés. Ces méthodologies utilisent les avantages de l’environnement natif du glomérule qui permettent aux chercheurs de résoudre les changements aigus dans la manipulation intracellulaire du calcium en réponse à l’application de divers agents, de mesurer la concentration basale de calcium dans les cellules (par exemple, pour évaluer la progression de la maladie) et d’évaluer et de manipuler la conductance calcique au niveau des canaux ioniques uniques.
Introduction
Les reins maintiennent l'équilibre homéostatique pour diverses substances et de réguler le volume sanguin d'une manière qui détermine la pression sanguine totale. Des perturbations dans la filtration rénale, la réabsorption ou la sécrétion d'entraîner ou d'accompagner des états pathologiques, allant de l'hyper ou hypotension pour mettre fin à l'insuffisance rénale qui nécessite éventuellement une transplantation rénale. L'unité de filtration rénale (glomérule) se compose de trois couches - l'endothélium capillaire, la membrane basale et une couche mono-cellulaire des cellules épithéliales - podocytes, qui jouent un rôle majeur dans le ....
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Protocole
L'utilisation et le bien-être des animaux devraient adhérer à la NIH Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire suivant les protocoles examinés et approuvés par le Comité de protection des animaux et l'utilisation institutionnelle (IACUC).
1. Kidney Flush
- Utiliser 8 à 12 semaines vieux rat mâle (suggéré est une souche Sprague Dawley, mais d'autres souches d'âge et sexe différent peuvent être utilisés avec les modifications appropriées).
- Anesthésier les animaux selon le mode opératoire autorisé par le protocole IACUC; surveiller la profondeur de l'anesthésie et d'inspecte....
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Résultats
Ici, nous avons abordé le problème de la mesure des changements de courte durée dans les niveaux de calcium dans les podocytes. La figure 1 montre une représentation schématique du protocole expérimental conçu pour effectuer l'imagerie haute résolution fluorescence confocale en temps réel et des enregistrements individuels de l'activité des canaux ioniques dans les podocytes de la fraîchement glomérules isolés de rongeurs. Brièvement, après le rat est anesthésié, les reins doivent être rincés av.......
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Discussion
L'approche décrite ici permet l'analyse de manipulation de calcium par les podocytes des glomérules chez les rongeurs. Cette technique permet l'application de patch-clamp électrophysiologie à canal unique et imagerie confocale à fluorescence ratiométrique. Cependant, les deux approches peuvent être utilisés séparément, sur leur propre. Le protocole proposé comporte plusieurs étapes relativement simples, y compris 1) Kidney Flush; 2) l'isolement des glomérules par tamisage différentiel; 3) exécuter des pa.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ont rien à révéler.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) et Colleen A. Lavin (Nikon Instruments, Inc.) pour une excellente assistance technique avec des expériences de microscopie. Gregory Blass est reconnu pour la relecture critique du manuscrit. Cette recherche a été financée par les Instituts nationaux de la santé HL108880 de subvention et American Diabetes Association accorder 1-15-BS-172 (AS), et Ben J. Lipps bourse de recherche de l'American Society of Nephrology (DVI).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Fluo4 AM | Life Technologies | F14217 | 500 µl dans du DMSO |
| FuraRed AM | Life Technologies | F-3020 | |
| Poly-ʟ-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Acide Pluronic | Sigma-Aldrich | F-68 | solution |
| Ionomycine | Sigma-Aldrich | I3909-1ML | |
| Rotateur de tubes | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-753 | Allemagne |
| Microscope confocal Nikon (inversé) | Nikon | Nikon A1R | Excitation laser à 488 nm. Filtres d'émission 500-550 nm et 570-620 nm |
| Objectif | Nikon | Plan Apo 60x/NA 1.4 Oil | |
| Couvercle en verre | Thermo Scientific | 6661B52 | |
| Graisse à vide élevé | Dow Corning | Composé au silicone | |
| Logiciel | Nikon | Nikon NIS-Elements | |
| Chambre d'enregistrement/perfusion | Warner Instruments | RC-26 | |
| Amplificateur de patch-clamp | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Système d'acquisition de données | Molecular Devices | Digidata 1440A | Système Axon Digidata® |
| Filtre passe-bas | Warner Instruments | LPF-8 | Bessel à 8 pôles |
| Capillaires en verre borosilicaté | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
| Tireuse de micropipettes | Sutter Instrument Co | P-97 | Tireuse de micropipettes de type Flaming/Brown |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Japon |
| Micro-manipulateur motorisé | Sutter Instrument Co | MP-225 | |
| Microscope inversé | Nikon | Eclipse Ti | |
| Table d'isolation des microvibrations | TMC | équipée d'une cage de Faraday | |
| Système de perfusion multivoies à valve | AutoMake Scientific | Valve Bank II | |
| Chambre d'enregistrement/perfusion | Warner Instruments | RC-26 | |
| Logiciel | Molecular Devices | pClamp 10.2 | |
| Nicardipine | Sigma-Aldrich | N7510 | |
| Ibério-toxine | Sigma | I5904-5UG | |
| Acide niflumique | Sigma-Aldrich | N0630 | |
| DIDS | Sigma-Aldrich | D3514-25MG | |
| Chlorure de TEA | Tocris | T2265 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11835030 | sans antibiotiques |
| BSA | Sigma-Aldrich | A8327 | solution d'albumine à 30 % |
| Table chirurgicale contrôlée en température | MCW core | pour rongeurs | |
| Tamis en acier : | #100 (150 μm), 140 (106 μm) | ||
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200 | Fisher Sci | 50-871-316 | |
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270 | Fisher Sci | 50-871-318 | |
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400 | Fisher Sci | 50-871-320 | |
| Maille 200 | Sigma-Aldrich | s4145 | écran pour CD-1 |
| Microscope binoculaire | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Microscope binoculaire | Nikon | SMZ745 | |
| Système de perfusion basé sur une pompe à seringue | Harvard Apparatus | ||
| Tuyau en polyéthylène | Sigma-Aldrich | PE50 | |
| Anesthésie à l'isoflurane |  VetEquip, Inc. | 911103 | |
| Autres réactifs de base | Sigma-Aldrich |
Références
- Machuca, E., Benoit, G., Antignac, C. Genetics of nephrotic syndrome: connecting molecular genetics to podocyte physiology. Hum. Mol. Genet. 18, R185-R194 (2009).
- Haraldsson, B., Nystrom, J., Deen, W. M. Properties of the glomerular barrier and mechanisms of pro....
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