Co-immunoprécipitation de la protéine souris Mx1 avec le virus Influenza A nucléoprotéine

Judith Verhelst; Dorien De Vlieger; Xavier Saelens

doi:10.3791/52871

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Article de méthode

Co-immunoprécipitation de la protéine souris Mx1 avec le virus Influenza A nucléoprotéine

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DOI :

10.3791/52871

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21 avril 2015

Judith Verhelst¹^,² , Dorien De Vlieger¹^,² , Xavier Saelens¹^,²

¹Inflammation Research Center, VIB, ²Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University

Dans cet article

Résumé

Ce protocole de co-immunoprécipitation permet d’étudier l’interaction entre la nucléoprotéine du virus de la grippe A et la protéine antivirale Mx1 dans les cellules humaines. Le protocole souligne l’importance du N-éthylmaléimide pour la réussite de la co-immunoprécipitation de Mx1 et de la nucléoprotéine du virus de la grippe A.

Résumé

L’étude de l’interaction entre les protéines est essentielle pour comprendre leur(s) fonction(s). Une méthode très puissante qui est fréquemment utilisée pour étudier les interactions des protéines avec d’autres macromolécules dans un échantillon complexe est appelée co-immunoprécipitation. Le protocole de co-immunoprécipitation décrit permet de démontrer et d’étudier plus avant l’interaction entre la protéine de résistance au myxovirus antiviral 1 (Mx1) et l’une de ses cibles virales, la nucléoprotéine (NP) du virus de la grippe A. Le protocole commence avec des cellules de mammifères transfectées, mais il est également possible d’utiliser des cellules infectées par le virus de la grippe A comme matériau de départ. Après la lyse cellulaire, la protéine virale NP est tirée vers le bas avec un anticorps spécifique et les complexes immunitaires qui en résultent sont précipités avec des billes de protéine G. Le pull-down réussi de NP et la co-immunoprécipitation de la protéine antivirale Mx1 sont ensuite révélés par western blot. Une condition préalable au succès de la co-immunoprécipitation de Mx1 avec NP est la présence de N-éthylmaléimide (NEM) dans le tampon de lyse cellulaire. Les groupes thiols libres d’alkylates NEM. On peut supposer que cette réaction stabilise l’interaction NP-Mx1 faible et/ou transitoire en préservant une conformation spécifique de Mx1, sa cible virale ou un troisième composant inconnu. Une limitation importante des expériences de co-immunoprécipitation est l’attraction par inadvertance de protéines contaminantes, causée par la liaison non spécifique des protéines aux billes ou aux anticorps de la protéine G. Par conséquent, il est très important d’inclure des paramètres de contrôle pour exclure les résultats faussement positifs. Le protocole de co-immunoprécipitation décrit peut être utilisé pour étudier l’interaction des protéines Mx de différentes espèces de vertébrés avec des protéines virales, n’importe quelle paire de protéines ou d’une protéine avec d’autres macromolécules. Le rôle bénéfique de la NEM pour stabiliser les interactions faibles et/ou transitoires doit être testé pour chaque paire d’interactions individuellement.

Introduction

Protéines résistance Myxovirus (Mx) sont un élément important de la défense immunitaire innée contre les pathogènes viraux. Ces protéines sont de grandes GTPases dynamine-like qui sont induits par les interférons de type III I et de type. Les gènes Mx correspondantes sont présentes dans pratiquement tous les vertébrés en une ou plusieurs copies et leurs produits géniques inhibent une large gamme de virus, y compris les Orthomyxoviridae (par ex., Virus de la grippe), des Rhabdoviridae (par ex., Virus de la stomatite vésiculaire), Bunyaviridae (par ex. , le virus de la crosse) et Retroviridae (par exemple, virus d'immunodéficienc....