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Article de méthode

Création et caractérisation de l'UTI et Cauti dans un modèle de souris

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DOI :

10.3791/52892

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23 juin 2015

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1Department of Molecular Microbiology and Center for Women's Infectious Disease Research, Washington University School of Medicine

Dans cet article

Avis d’erratum

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Résumé

La capacité à modéliser les infections des voies urinaires (IVU) est cruciale pour pouvoir comprendre la pathogenèse bactérienne et favoriser le développement de nouvelles thérapies. L’objectif de ce travail est de démontrer des modèles murins d’infections urinaires expérimentales et d’infections urinaires associées à un cathéter qui récapitulent et prédisent les résultats observés chez l’homme.

Résumé

Les infections des voies urinaires (IVU) sont très répandus, une cause importante de morbidité et sont plus résistantes aux traitements avec des antibiotiques. Les femmes sont beaucoup affligé par UTI: 50% de toutes les femmes auront une infection urinaire dans leur vie. En outre, 20-40% de ces femmes qui ont une première UTI subira une récidive avec certains souffrant de récidives fréquentes avec grave détérioration de la qualité de vie, la douleur et l'inconfort, la perturbation des activités quotidiennes, l'augmentation des coûts de soins de santé, et quelques options de traitement autres de prophylaxie antibiotique à long terme. Uropathogène Escherichia coli (UPEC) est l'agent causal primaire de la communauté acquise UTI. UTI du cathéter-associé (Cauti) est l'hôpital infection la plus fréquente acquis représente un million occurrences dans les États-Unis chaque année et les coûts de soins de santé dramatiques. Alors que UPEC est également la principale cause de Cauti, d'autres agents pathogènes sont d'une importance accrue, y compris Enterococcusfaecalis. Ici, nous utilisons deux modèles de souris bien établies qui récapitulent plusieurs des caractéristiques cliniques de ces maladies humaines. Pour UTI, un modèle C3H / HeN récapitule la plupart des caractéristiques de virulence UPEC observés chez les humains y compris les réponses de l'hôte, la formation IBC et filamentation. Pour Cauti, en utilisant un modèle souris C57BL / 6, qui conservent les implants cathéter de la vessie, a été montré pour être sensibles à E. faecalis infection de la vessie. Ces modèles représentatifs sont utilisés pour acquérir de nouvelles connaissances frappantes dans la pathogenèse de la maladie UTI, qui conduit à la mise au point de nouveaux traitements et stratégies de gestion ou de prévention.

Introduction

Infections des voies urinaires (IVU) sont l'une des infections bactériennes les plus courantes et peuvent être divisés en deux catégories basées sur le mécanisme d'acquisition, la communauté et nosocomiale acquise UTI. Les infections urinaires se produit souvent chez les femmes et des études, autrement sains acquis communautaire ont montré qu'environ 50% des femmes auront au moins une infection urinaire dans leur vie 1. En outre, la récidive est un problème majeur. Une femme qui a une infection aiguë initiale a une chance d'avoir une seconde infection dans les six mois malgré un traitement antibiotique approprié et de nombreuses femmes continuent à avoir de fréquentes récidives 2 25-40%. Les bactéries qui causent ces infections sont également de plus en plus de protocoles de traitement de plus en plus résistantes aux antibiotiques de confusion 3-6. UTI affectent des millions de personnes chaque année coûte environ 2,5 milliards de dollars en frais liés aux soins de santé aux États-Unis, soulignant l'impact et la prévalence de la maladie1,7 .Nosocomial acquis les infections urinaires sont principalement liés à la présence de corps étrangers tels que cathéters. les infections urinaires de cathéter associée (Cauti) restent la nosocomiale la plus fréquente acquise UTI, représentant ~ 70-80% de ces infections 8. En outre, Cauti est associée à une augmentation de la morbidité et de la mortalité et il est la cause la plus fréquente des infections sanguines secondaires 9.

Communauté associée UPEC acquis les infections urinaires sont pensés pour être causé par l'introduction de bactéries dans la vessie à partir de réservoirs dans le tractus gastro-intestinal par le biais d'une manipulation mécanique pendant les rapports sexuels, le manque d'hygiène ou d'autres dynamique des populations microbiennes entre l'hôte différentes niches 10. Une fois à l'intérieur de la vessie, UPEC emploient de nombreux facteurs de virulence, y compris la capsule, les systèmes d'acquisition du fer, des toxines, un plasmide de virulence, ARNt, îlots de pathogénicité et de facteurs de colonisation qui ont été montrés à jouer un rôle dans la pathogenèse 11-14. Critique à l'établissement de la colonisation UPEC, UPEC codent également plusieurs types de chaperon adhésif huissier voie (CUP) pili qui reconnaissent les récepteurs avec une spécificité stéréochimique 15. Pili de type 1, pointe avec l'adhésine FimH, sont exprimées par l'UPEC et lier uroplakins 16 et α-β-1, 3 intégrines 17, qui sont exprimés sur la surface luminale des deux vessies humaines et de souris 18 mannosylée. Ces interactions à médiation FimH faciliter la colonisation bactérienne et l'invasion des cellules epitheliales superficielles 19,20. Une fois à l'intérieur de la cellule, UPEC peut échapper dans le cytoplasme où une seule bactérie peut rapidement diviser pour former une communauté bactérienne intracellulaire (IBC), qui, lors de la maturation, peut contenir ~ 10 4 21 bactéries. Formation IBC a été démontrée dans au moins six différentes souches de souris, C3H / poule, C3H / HeJ, C57BL / 6, ABC, FVB / NJ et BALB / c, et avec une grande variété de différentes UPESouches de carbone et d'autres Enterobacteriaceae 22-24. Toutefois, des différences temporelles et spatiales de la formation IBC peuvent varier en fonction de l'arrière-plan de la souris et la souche UPEC infecter. Dans C3H / HeN infectées par le UPEC prototypique souches UTI89 ou la formation CFT073, IBC peuvent être visualisés sous forme de petites biomasses de bactéries dès 3 HPI (post-infection h). Cette communauté continue à se développer et atteint un "point médian" de développement d'environ 6 hpi lorsque les bactéries en forme de bâtonnets occupent un grand pourcentage de l'espace cytoplasmique de cellules parapluie superficielles différenciées Ces forme précoce GRV d'une manière relativement synchrone avec la majorité affichant des dimensions similaires et morphologies. ~ 8 hpi les bactéries dans le changement IBC d'une bacilles à Cocci morphologie. GRV sont de nature transitoire. Ainsi, le BAC maturation 12-18 résultats de HPI à l'expansion continue de la population bactérienne, suivi par leur filamentation et la dispersion de la wi cellulaireth propagation ultérieure à des cellules voisines 23. Ainsi, le créneau IBC permet une croissance bactérienne rapide dans un environnement à l'abri de réponses 25 immunitaires et des antibiotiques hôtes. Les étapes distinctes d'infection UPEC qui sont vus dans les souris sont également observées chez l'homme, tels que les GRV et filamentation, soutenant le modèle de la souris de l'UTI comme un outil bénéfique qui peut être utilisé pour modéliser UTI chez les humains 22,26-28.

Alors que la majorité des femmes ressentent une infection urinaire dans leur vie, le résultat de ces infections peut varier de l'infection de l'auto-limitation aiguë sans récidive, à la cystite récidivante fréquente. En outre, des études ont montré une forte survenue familiale de l'UTI, ce qui suggère une composante génétique contribue à la susceptibilité 29 UTI. Nous avons constaté que les résultats UTI différentes dans les cliniques peuvent être reflétés par les résultats différents de l'infection expérimentale UPEC entre souches consanguines de souris 30. Par exemple, C3H / poule, l'ABC, Des souris DBA, et C3H / HeOuJ sont sensibles, de manière infectieux dépendante de la dose, de longue durée, la cystite chronique caractérisée par la persistance, les bactéries de titre élevé (> 10 4 unités formant des colonies (CFU) / ml), un titre élevé de bactéries charges de la vessie au sacrifice> 4 semaines post-infection (WPI), l'inflammation chronique, et la nécrose urothelial. Ces souris présentent également des taux sériques élevés de IL-6, G-CSF, KC, et IL-5 dans les 24 premières HPI qui servent de biomarqueurs pour le développement de la cystite chronique. Cela peut représenter fidèlement le cours naturel des infections urinaires chez certaines femmes, que des études contre placebo ont montré qu'un grand pourcentage de femmes victimes de UTI conservera des niveaux élevés de bactéries dans l'urine pendant plusieurs semaines après les premiers symptômes de la cystite si pas donné un traitement antibiotique 31 , 32. En outre, en utilisant des souris C3H / poule, nous avons constaté que des antécédents de cystite chronique est un facteur de risque important pour les infections récurrentes sévères ultérieures. Infection urinaire récidivante est le plus simanifestation clinique gnificant de l'UTI et la souris C3H / HeN est actuellement le seul modèle étudié qui récapitule une prédisposition accrue après l'exposition précédente. Un deuxième résultat UTI est récapitulée dans C57Bl / 6 souris où l'infection aiguë UPEC est auto-limitation, avec une résolution de l'inflammation de la vessie et bactériurie une semaine environ. Fait intéressant, dans ce modèle, UPEC former facilement des réservoirs intracellulaires de repos dans le tissu de la vessie à partir de laquelle UPEC sont capables de sortir d'un état ​​de dormance pour relancer une UTI actif, potentiellement expliquer un mécanisme de même souche UTI récurrent chez l'homme 33, 34.

En plus des influences génétiques sur UTI susceptibilité, l'introduction d'un cathéter dans la vessie augmente considérablement la probabilité d'avoir une infection ainsi que l'augmentation du nombre de bactéries capables de provoquer une infection. Il a été démontré que le cathétérisme urinaire humaine provoque histologique etchangements immunologiques dans la vessie dus au stress mécanique qui entraîne une réponse inflammatoire robuste, exfoliation, œdème de la lamina propria et submucusa, amincissement urothelial et lésion de la muqueuse urothélium et les reins 35,36. En outre, le cathéter offre une surface pour la fixation bactérienne créant ainsi un environnement utilisé par plusieurs espèces de provoquer Cauti. Alors que UPEC sont encore un contributeur majeur, Enterococcus faecalis représente 15% de ces Cauti 37. E. faecalis est de plus en plus résistantes aux antibiotiques avec résistance à la vancomycine émergence, posant un grave problème de santé 38. E. faecalis possèdent de nombreux facteurs de virulence y compris les toxines et adhésines nécessaires pour la fixation à la fois le cathéter et l'épithélium 38. Pendant sondage urinaire, l'hôte est vulnérable à l'adhésion microbienne, la multiplication et la diffusion dans le 39,40 urinaire. E. FAECAlis forme un biofilm sur le cathéter dans le cadre d'un mécanisme de persister dans la vessie et de diffuser vers les reins, qui est reproduite dans un modèle de souris Cauti 41. Récemment, il a été montré pendant un cathétérisme urinaire, fibrinogène (Fg) est libéré dans la vessie dans le cadre de la réponse inflammatoire. Fg accumule dans la vessie, le cathéter couches et est essentielle pour E. faecalis formation de biofilm, fonctionnant comme un échafaudage de fixation. Dans un modèle de souris C57BL / 6 de la souris de Cauti, nous avons découvert que E. faecalis formation de biofilm sur le cathéter, et donc la persistance dans la vessie, était à la charge sur le pili Ebp, spécifiquement son EBPA pointe d'adhésine. Nous avons constaté que le domaine N-terminal de EBPa se lie spécifiquement à FG revêtement du cathéter. En outre, il a été constaté que E. faecalis utilise Fg comme source de métabolite cours de l'infection, améliorant ainsi la formation de biofilm 42.

Des modèles de souris sont révélés indispensables à undertanding ainsi que la prévision des manifestations cliniques de l'UTI et Cauti 41. Dans cet article, nous démontrons la préparation de l'inoculum de la cystite UPEC isolons UTI89 et l'inoculation transurétrale de souris C3H / poule. En outre, nous démontrons un protocole pour l'insertion du cathéter dans des souris C57BL / 6 et de l'inoculation E. souche faecalis OG1RF. Ces deux techniques conduisent à UTI ou Cauti cohérente et fiable chez la souris. Nous affichons également des techniques utilisés pour observer la formation IBC au cours cystite aiguë et la collecte d'urine pour l'analyse de la cystite chronique ou récurrente. Souris C3H / HeN ont été utilisées pour étudier les aspects de la pathogenèse UPEC y compris invasion initiale bactérienne, la formation IBC, filamentation et le développement de la cystite chronique 23,33,43. Ces paramètres de virulence ont également été étudiés dans une variété d'autres milieux de souris 22,33. Pour Cauti, C57BL / 6 modèle permet pour l'implantation d'un corps étranger dans la vessie avec le co bactérienne ultérieureionisation, qui peut être maintenu pendant 7 jours après l'infection 41. Ces modèles ont été utiles pour évaluer les mécanismes de virulence bactérienne, les réponses de l'hôte aux infections urinaires et des mécanismes de subvertir réponses de l'hôte, dont une grande partie a été ensuite récapitulées ou observés dans les populations humaines cliniques.

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Protocole

Déclaration éthique: Le Comité des études animales Université de Washington a approuvé toutes les infections et les procédures souris dans le cadre de numéro de protocole 20120216, qui a été approuvé et expire 11/01/2013 11/01/2016. Prise en charge globale des animaux était compatible avec le guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire du Conseil national de recherches et le Guide des ressources Soins USDA animale. procédures d'euthanasie sont compatibles avec les "directives de l'AVMA pour l'euthanasie des animaux Edition 2013."

1. UPEC Protocole UTI, inoculation aiguille Préparation (Figure S1)

  1. Retirez le bouchon de l'aiguille 30 G. Fil d'environ 1 pouce de tube PE10 sur l'arbre de l'aiguille. UV stériliser les ensembles d'aiguille pendant la nuit. Cathétérisés aiguilles peuvent être stockés indéfiniment dans des boîtes de Pétri stériles.

2. UPEC inoculum bactérien Préparation

  1. Préparer UTI89 inoculum (début 72 h avant l'inoculumtion de jour)
    1. Streak UTI89 sur un milieu LB (Luria-Bertani) plaque de gélose à partir d'un stock congelé. Incuber une nuit à 37 ° C. Choisir une colonie et inoculer dans 10 ml de LB dans un ballon de 125 ml. Incuber à 37 ° C pendant 24 heures, de façon statique.
    2. Inoculer 10 pi de culture de nuit dans 10 ml de LB dans un nouveau flacon de 125 ml pour un 24 heures supplémentaires à 37 ° C, de manière statique.
    3. Transfert 3 ml (varient en fonction de la souche et la taille de l'inoculum désiré) à 1,5 ml tubes stériles et centrifuger à 7000 g pendant 3 min et remettre en suspension le culot dans 1x PBS et centrifuger une deuxième fois. Reprendre le culot bactérien dans 1 ml de PBS 1X.
  2. Mesurer la densité optique et ajuster la concentration bactérienne de l'inoculum de densité souhaitée. La concentration standard de l'inoculum utilisé est de 10 7 bactéries; Cependant, cela peut varier en raison de la conception de l'étude.

3. bactérienne inoculation

  1. Nettoyez le poste de travail avec 70% d'éthanol et csur la zone avec du papier absorbant (ou utiliser une hotte à flux stérile).
  2. Tirer jusqu'à 0,9 ml de l'inoculum bactérien préparé dans un 1 ml (TB) seringue (éliminer les bulles d'air). Fixez une aiguille d'inoculation stérile préparé avec PE10 tube, sur la seringue contenant l'inoculum, puis couper le tube stérile en polyéthylène.
    REMARQUE: Laissez 1 mm de tube dessus de la pointe de l'aiguille pour éviter la perforation de la vessie.
  3. Coupez un morceau carré de 1 pouce de parafilm et de mettre un peu de lubrifiant chirurgicale (environ la taille d'un centime) sur le dessus.
  4. Anesthésier les souris C3H / HeN femmes en les mettant dans un bocal en verre de 32 onces contenant une boule de thé-infusion avec des boules de coton imbibées de 3 ml d'isoflurane ou de la chambre de vaporisation (à la suite fabrique protocole) jusqu'à inconsciente mais respire encore normalement (1 respiration / sec) .
    NOTE: Certains comités IACUC ne pas approuver l'utilisation d'un pot ou un vaporisateur. S'il vous plaît suivre les indications du comité IACUC de votre institution.
    NOTE: Si bocal en verreavec du thé-ball et / ou cône de nez avec des boules de coton isoflurane soakd sont utilisés, l'animal doit être observé avec soin pour éviter surdose d'un anesthésique et de la mort. L'avantage d'utiliser une chambre de vaporisation et l'anesthésie est qu'elle permet l'administration de l'isoflurane contrôlée qui évite les surdoses accidentelles. ATTENTION: L'isoflurane est un anesthésique par inhalation. Utiliser dans un endroit bien ventilé et minimiser l'inhalation.
  5. Débranchez la souris de la jarre / vaporisateur et placez-le sur le dos sur une serviette en papier et de diffuser les jambes.
  6. Couvrir le nez de la souris avec un cône de nez (un tube relié à l'évaporateur qui fournit une dose contrôlée de isoflurance qui est équipé sur certaines unités vaporisateur) ou 50 ml tube conique avec une boule de coton contenant une petite quantité (environ 1-2 ml ) de l'isoflurane.
  7. Palpiter doucement la vessie pour induire la miction et d'assurer une vessie annulé. Essuyez la région de l'urètre avec 100% d'éthanol essuyer. Tamponnez l'aiguille d'inoculation / seringue, premier point, dans lelubrifiant chirurgical.
  8. Ensemencer chaque souris avec 50 ul de la solution de bactéries en insérant l'aiguille d'inoculation par voie transurétrale, environ 12 mm, et en appuyant vers le bas sur le piston de la seringue pour distribuer doucement l'inoculum dans la vessie doucement (10 ul / sec). Retirez l'aiguille d'inoculation de la souris.
    NOTE: retour immédiat de l'inoculum à l'ouverture de l'urètre en commençant à inoculer indique insertion incorrecte ou incomplète de l'aiguille.
  9. Débranchez la souris de cône de nez et de le retourner dans sa cage. Répétez les étapes 3.3 à 3.8 pour chaque souris. Lorsque / si commutation inoculum conditions / souches, disposer de la seringue et l'aiguille d'inoculation dans un récipient pour objets tranchants approuvé et recommencer l'étape 3.2.
    NOTE: L'inoculation avec les organismes uropathogènes ne cause généralement pas de symptômes de douleur sévère. Cependant, dans de rares cas, l'administration de fortes doses d'agents pathogènes peut causer de la fièvre, la réduction de l'apport alimentaire et de l'eau et un comportement anormal. UNEla santé Nimal doit être surveillée tout au long de l'expérience. Si les symptômes de la douleur sont manifestes préavis, un analgésique, comme la buprénorphine (0,05-0,1 mg / kg par voie sous cutanée donnée), peuvent être appliquées. Les procédures devraient être en conformité avec IACUC de chaque institution.

4. Détermination des charges bactériennes

  1. Préparer 5 ml des tubes séparés pour chaque paire de la vessie et des reins pour être récolté. Ajouter 1 ml de PBS / tubes / vessie 1x de la souris pour être récolté. Ajouter 0,8 ml de PBS 1x / tubes / paire de reins de souris pour être récolté. Étiqueter chaque tube pour correspondre à une souris donnée. Préparer une plaque de 96 puits contenant 180 pi de PBS 1x dans chaque puits pour 01h10 dilutions en série.
  2. Nettoyer la zone de travail avec 70% d'éthanol et couvrir la zone avec une couverture ou une serviette en papier absorbant.
  3. Anesthésier la souris avec l'isoflurane (voir l'étape 3.4) jusqu'à ce que la souris cesse de respirer pendant environ 1 min, puis placez-le sur la couverture ou une serviette en papier absorbant. D'autres méthodes de euthanasia sont également acceptés par les comités du IACUC, tels que le dioxyde de carbone, et peut être remplacé par overdose d'isoflurane.
  4. Sacrifice la souris par dislocation cervicale rapide qui consiste à retenir le cou à la base de la tête et la queue tirant horizontalement loin du corps jusqu'à dislocation se produit.
    REMARQUE: La plupart des comités IACUC exigent un moyen secondaire de l'euthanasie et la dislocation cervicale est une méthode courante. Cependant, d'autres méthodes peuvent être utilisées si elles sont approuvées par le comité IACUC.
  5. Placez la souris morte sur son dos et pulvériser éthanol à 70% sur l'abdomen. On dissèque la souris, la récolte de la vessie et des reins, en ce qu 'afin de minimiser les risques de contamination du sang suivant la dissection du rein. Placez les organes indépendamment préparés dans les tubes de 5 ml contenant 1x PBS (voir l'étape 4.1).
    NOTE: Utiliser différents ciseaux pour la dissection externe et pour le prélèvement d'organes à minimiser la contamination.
  6. Appuyez sur le tube pour assurer les organes sont en til 1x PBS. Répétez l'étape 4,3-4,5 pour chaque souris. Ciseaux propres et pince à 70% d'éthanol après chaque souris.

5. bactérienne Recovery

  1. Homogénéiser la vessie et des reins récoltée dans les tubes de 5 ml avec un homogénéiseur de tissu, par 15 sec 30 sec rein et par la vessie. Rincer homogénéiseur de façon séquentielle dans du PBS 1x, 70% d'éthanol et 1 x PBS entre les échantillons.
  2. Faire des dilutions en série à 1:10 à 10 -8 et la plaque pour chaque dilution UFC (unités formant colonie) sur des plaques de gélose LB. Incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit et compter les colonies le lendemain.

6. IBC Enumeration

  1. Retirer de manière aseptique la vessie et le placer dans 1x PBS dans une plaque à 6 puits avec un fond de silicone. Les plaques peuvent être préparés en utilisant un kit d'élastomère de silicone et en versant d'environ 1 cm de silicone dans chaque puits, voir instructions du fabricant. Couper la vessie dans la moitié avec des ciseaux.
  2. En utilisant de petites broches métalliques évasement doucement le bladder de sorte que la lumière de la vessie est orientée vers le haut. Veillez à placer les broches sur les bords extérieurs des sections de la vessie pour assurer la quantité maximale de urothélium est exposée.
  3. Après évasement, laver délicatement la vessie une fois avec PBS 1x. Retirez le 1x PBS à la pipette. Fixer la vessie en ajoutant suffisamment de paraformaldehyde à 3% pour couvrir toute la vessie évasée. ATTENTION: Paraformaldéhyde est cancérigène. Équipement de protection approprié, y compris des gants, doit être porté en tout temps. L'élimination doit suivre les directives institutionnelles.
  4. Incuber à température ambiante pendant 1 heure. Enlever la solution de paraformaldéhyde. Laver une fois avec PBS 1x.
  5. Laver avec une solution de lavage de LacZ (MgCl2 2 mM, désoxycholate de sodium à 0,01% et 0,02% nonidet-p40in 1x PBS) trois fois pour 5 min par lavage.
  6. Enlever la solution de lavage et ajouter suffisamment LacZ tache (9,5 ml de solution de lavage LacZ, 0,4 ml 25 mg / ml de X-gal et 0,1 ml de 100 mM K-FERROCYANURE / K-FERRICYANURE) pour couvrir les vessies. Incuber à 30 ° C overniGHT abri de la lumière.
  7. Retirer vessies écartés de l'incubateur et observer GRV, qui apparaissent puncta bleu comme visualisées avec un microscope à dissection, 40-60X grossissement.
    REMARQUE: Parfois, une souris peut uriner avant le placement du tube sous l'urètre. Dans ce cas, attendre 15-20 minutes avant de tenter de recueillir à nouveau urine.

7. Collection d'urine pour Bactériurie CFU Enumeration (Non applicable pour Cauti)

  1. Pour recueillir l'urine avant ou après l'infection doucement retenir la souris en maintenant la queue et en le plaçant sur une surface plane élevée (en haut de la cage de la souris).
  2. Maintenir un tube de 1,5 ml stérile sous l'urètre de la souris. Appuyez doucement sur le dos de la souris près de la queue pour faire pression sur la vessie. Catch l'urine dans le tube de 1,5 ml.
  3. Assurez-série des dilutions 1:10 à 10 -7 et plaque chaque dilution sur LB. appropriée Incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit et compter les colonies le lendemain.

8. Cauti Modèle de protocole, cathéter aiguille Préparation pour Cauti Modèle (Figure S2)

  1. Retirez le bouchon de l'aiguille 30 G. Couper un morceau de tube PE10 et 5 mm morceau de tube de silicone tel que RenaSIL 7 mm. Enfilez l'aiguille avec PE10 tube jusqu'à ce que le tube touche la base de l'aiguille.
  2. Puis nourrir la pièce de 5 mm sur l'aiguille contenant PE10. UV stériliser les aiguilles assemblées nuit.
    NOTE: En chargeant le tube de silicone, laissez environ 1 mm de la tubulure étendant au-delà de la pointe de l'aiguille.

9. E. faecalis OG1RF inoculum bactérien Préparation

  1. Préparer OG1RF inoculum à partir de 48 heures avant le jour de l'inoculation. Streak OG1RF sur une BHI (infusion de coeur de cerveau) plaque à partir d'un stock congelé.
  2. Choisissez une colonie et l'inoculer dans 10 ml de BHI et de croître de manière statique pendant 18 heures à 37 ° C. Centrifuger la culture et laver le culot (3 fois) en volumes de 1 ml de PBS stérile 1x.
  3. Reprendre le culot bactérien dans PBS 1x. Mesurer la densité optique bactérienne et ajuster la concentration de la taille de l'inoculum souhaité. La concentration standard de l'inoculum utilisé est de 10 7; Cependant, cela peut varier en raison de la conception de l'étude

10. cathéter Implantation

  1. Nettoyez le poste de travail avec 70% d'éthanol et couvrir la zone avec une couverture absorbante (ou utiliser une hotte à flux stérile).
  2. Fixez cathéter-aiguille à un vide de 1 ml (TB) seringue. Coupez un morceau carré de 1 pouce de parafilm et de mettre un peu de lubrifiant chirurgicale (environ la taille d'un centime) sur le dessus.
    REMARQUE: Deux aiguilles différentes sont utilisées pour le dépôt du cathéter et de l'inoculum à l'inoculation accidentelle minimisée en raison de la manipulation mécanique nécessaire pour cathéter implantation. Ceci permet aussi pour des raisons de commodité de préparation moins aiguilles d'inoculation.
  3. Anesthésier souris C57BL / 6 en les mettant dans un bocal en verre de 32 onces contenant un thé-infuser balle avec des boules de coton trempé dans 3 ml d'isoflurane ou de la chambre de vaporisation (à la suite fabrique protocole) jusqu'à inconsciente mais respire encore normalement (1 respiration / sec).
  4. Ensuite, placez la souris sur le dos sur une serviette en papier et de répandre les jambes. Couvrir le nez de la souris avec un cône de nez ou 50 ml tube conique avec des boules de coton contenant une petite quantité (environ 1-2 ml) de l'isoflurane.
    ATTENTION: L'isoflurane est un anesthésique par inhalation. Utiliser dans un endroit bien ventilé et minimiser l'inhalation par le chercheur.
  5. Palpiter doucement la vessie pour induire la miction et d'assurer une vessie annulé. Essuyez région de l'urètre avec un éthanol à 100% essuyer.
  6. Désinfectez la région de l'urètre avec une solution de povidone-iode à 10% en utilisant un applicateur coton-tige. Tamponnez l'aiguille d'inoculation / seringue, premier point, dans le lubrifiant chirurgicale.
    REMARQUE: Povidone-iode est utilisé pour l'implantation du cathéter, qui est une solution aseptique plus fort que l'alcool. Cathéter implantation nécessiteplus manipulation mécanique pour insérer le cathéter et donc un plus grand risque de contamination.
  7. Insérer le cathéter dans l'ouverture de l'urètre. Une fois dans, l'utilisation des pinces pour pousser le (PE10 7 mm) de long morceau vers la vessie, par conséquent, la poussée (5 mm silicone) petit cathéter et le déposer dans la vessie. Retirez l'aiguille, avec le tube de 7 mm encore attaché, immédiatement.

11. bactérienne inoculation

  1. Suivez le protocole d'inoculation bactérienne dans l'article 3, en utilisant l'inoculum préparé à partir de la section 9. Retirer la souris du cône de nez et de le retourner dans sa cage

12. A chaque point Temps de Sacrifice

  1. Préparer tubes de 5 ml pour la vessie et les reins (organes Pour suivre l'étape 4.1) et 1,5 ml tube Eppendorf pour les cathéters. Ajouter 1 ml de 1 x PBS à 1,5 ml pour des échantillons tube Eppendorf de cathéter
  2. Suivez les étapes 4.3 à 4.5. Disséquer la souris, la récolte de la vessie, les reins et le cathéter, plaCING les tissus indépendamment en 5 ml tubes contenant 1x PBS et le cathéter dans le Eppendorf de 1,5 ml (voir l'étape 12.1).
    NOTE: Utiliser différents ciseaux pour la dissection externe et pour le prélèvement d'organes et de récupération de cathéter pour minimiser la contamination
  3. Ensuite, suivez l'étape 4.6.

13. bactérienne Recovery

  1. Pour les organes, suivez les étapes 5.1 et 5.2. Pour la récupération des bactéries à partir de cathéters, vortex à la vitesse maximale pendant 30 s, sonication des échantillons de cathéter pendant 5 minutes en utilisant un sonicateur à bain, puis vortex à la vitesse maximale pendant encore 30 secondes.
  2. Assurez-série des dilutions 1:10 à 10 -8 et plaque chaque dilution pour UFC recensement sur ​​des plaques BHI. Incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit et compter les colonies le lendemain.

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Résultats

Les modèles intravésicale d'UTI associée simple et le cathéter fournissent des plates-formes flexibles pour élucider les mécanismes moléculaires de la pathogénie bactérienne, l'impact de ces maladies sur les tissus de l'hôte, et le développement et l'essai de nouvelles approches pour gérer ces infections courantes et coûteuses. Selon la souche de souris et pathogène, l'inoculation intravésicale peut être utilisée pour étudier les interactions hôte-pathogène à élucider les facteurs nécessaires pour l&...

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Discussion

Communauté simple acquis UTI est une infection courante et coûteuse qui représente plusieurs millions de visites de soins primaires chaque année 46. En outre, CAUTIS sont une infection acquise de santé commun qui est devenu extrêmement coûteux pour les fournisseurs de soins de santé que les Centres de services Medicare et Medicaid ne rembourse les fournisseurs pour le coût supplémentaire de traitement résultant de l'hôpital acquis Cauti 45. Les modèles de souris de l'UTI, tant cystite et Ca...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrentes.

Remerciements

Le financement de ce travail a été fourni par ORWH SCOR P50 DK064540, RO1 DK 051406, RO1 AI 108749-01, F32 DK 101171, et F32 DK 104516-01.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Matériel pour la préparation des cathéters et des aiguilles :
Aiguilles 30 GBD Precision Glide30510630 G x ½ ; (0,3 mm x 13 mm)
Tube en polyéthylène PE10BD427400Diamètre intérieur -0,011 po (0,28 mm) ; diamètre extérieur &ndash ; 0,024 po (0,61 mm)
RenaSIL 025 tube en silicone durci au platineBraintree Scientific, IncSIL 025diamètre intérieur-0,012 x diamètre extérieur 0,025, bobine
Matériau pour les infections :
Isoflourane &ndash ; IsothesiaButler Schein29405250 ml
Verre transparent Pot à bords droitsKimble Chase5413289V 21
Infuseur à thé en acier inoxydableSchefs-AmazonPremium Loose Leaf Tea Infuser By Schefs - Acier inoxydable - Grande capacité -
Boules de coton non stérilesFisherbrand22-456-880
50 ml Tubes FalconVWR89039-660
Isotec 3 -vaporisateurOhmeda1224478
Ear punchFisher Scientific13-812-201(si nécessaire)
Solution de bétadinebétadine10 % Povidie-iode solution topique
Q-tips FisherScientific22-037-9246 pouces
Couches pour bancFisherbrand14206 63Coussinets absorbants (20" X36 pouces tapis)
Lubrifiant chirurgicalSurgilube0281-0205-36
Ciseaux de dissectionOutils pour les sciences fines, INC14084-08
Pince Micro-AdsonOutils pour les sciences fines, INC11018-12
Seringue de 1 mlBD309659Pointe à tuberculine
ParafilmBemisPM9964 pouces x 125 PI
Rack EppendorfFisherbrand05-541-1
Tubes EppendorfMIDSCIAVX-T-17-C
Prélèvement cathéters, vessies et reins :
HomogénéisateurPRO Scientific INCBio-Gen Pro 200
5 ml tube à fond rond en polypropylèneBD352063pour homogénéisation d’organes
Serviette en papierGeorgia-Pacific
ÉthanolPharmco-AAPER11100020S200 proof
Costar&trade ; Polystyrène transparent 96-Well PlaquesCorning3788
1x Phosphate sodium salinSigma-AldrichP3813
BRANSONIC Nettoyeur à ultrasons 1210Branson Ultrasonics Corporation1210
IBC matériaux :
Plaque d’essai de culture tissulaire à 6 puitsTechno Plastic Products92006
PinsFine Science Tools26002-20
Sylgard 184Dow Corning3097358-1004Kit d’élastomère de silicone
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)Invitrogen15520-034
N, N-diméthylformamideSigma AldrichD4551
MgCl2 (Chlorure de magnésium)Sigma AldrichM8266
Désoxycholate de sodiumSigma AldrichD6750
Nonidet-P40Roche11754599001Octylphenolpoly(ethyleneglycolether)n
Hexacyanoferrate de potassium(II) trihydraté (K-ferrOcyanure)Sigma AldrichP3289
Hexacyanoferrate de potassium(III) (K-ferrIcyanure)Sigma Aldrich60299
de 25 pi Solution de ultrapur

Références

  1. Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. Dis Mon. 49, 53-70 (2003).
  2. Foxman, B., et al. Risk factors for second urinary tract infection among college women. American journal of epidemiology. 151, 1194-1205 (2000).
  3. Gupta, K., Hooton, T. M., Stamm, W. E. Increasing antimicrobial resistance and the management of uncomplicated community-acquired urinary tract infections. Annals of internal medicine. 135, 41-50 (2001).
  4. Gupta, K., Hooton, T. M., Stamm, W. E. Isolation of fluoroquinolone-resistant rectal Escherichia coli. after treatment of acute uncomplicated cystitis. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 56, 243-246 (2005).
  5. Gupta, K., Sahm, D. F., Mayfield, D., Stamm, W. E. Antimicrobial resistance among uropathogens that cause community-acquired urinary tract infections in women: a nationwide analysis. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 33, 89-94 (2001).
  6. Gupta, K., Scholes, D., Stamm, W. E. Increasing prevalence of antimicrobial resistance among uropathogens causing acute uncomplicated cystitis in women. Jama. 281, 736-738 (1999).
  7. Jarvis, W. R. Selected aspects of the socioeconomic impact of nosocomial infections: morbidity, mortality, cost, and prevention. Infect Control Hosp Epidemiol. 17, 552-557 (1996).
  8. Lo, E., et al. Strategies to prevent catheter-associated urinary tract infections in acute care hospitals: 2014 update. Infection control and hospital epidemiology : the official journal of the Society of Hospital Epidemiologists of America. 35, 464-479 (2014).
  9. Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature reviews Urology. 7, 653-660 (2010).
  10. Hooton, T. M., Stamm, W. E. Diagnosis and treatment of uncomplicated urinary tract infection. Infect Dis Clin North Am. 11, 551-581 (1997).
  11. Hannan, T. J., et al. LeuX tRNA-dependent and -independent mechanisms of Escherichia coli. pathogenesis in acute cystitis. Molecular microbiology. 67, 116-128 (2008).
  12. Cusumano, C. K., Hung, C. S., Chen, S. L., Hultgren, S. J. Virulence plasmid harbored by uropathogenic Escherichia coli. functions in acute stages of pathogenesis. Infection and immunity. 78, 1457-1467 (2010).
  13. Dhakal, B. K., Mulvey, M. A. The UPEC pore-forming toxin alpha-hemolysin triggers proteolysis of host proteins to disrupt cell adhesion, inflammatory, and survival pathways. Cell host & microbe. 11, 58-69 (2012).
  14. Garcia, E. C., Brumbaugh, A. R., Mobley, H. L. Redundancy and specificity of Escherichia coli. iron acquisition systems during urinary tract infection. Infection and immunity. 79, 1225-1235 (2011).
  15. Bergsten, G., Wullt, B., Svanborg, C. Escherichia coli., fimbriae, bacterial persistence and host response induction in the human urinary tract. International journal of medical microbiology : IJMM. 295, 487-502 (2005).
  16. Zhou, G., et al. Uroplakin Ia is the urothelial receptor for uropathogenic Escherichia coli.: evidence from in vitro FimH binding. J Cell Sci. 114, 4095-4103 (2001).
  17. Eto, D. S., Jones, T. A., Sundsbak, J. L., Mulvey, M. A. Integrin-mediated host cell invasion by type 1-piliated uropathogenic Escherichia coli. PLoS Pathog. 3, e100(2007).
  18. Taganna, J., de Boer, A. R., Wuhrer, M., Bouckaert, J. Glycosylation changes as important factors for the susceptibility to urinary tract infection. Biochemical Society transactions. 39, 349-354 (2011).
  19. Mulvey, M. A., et al. Induction and evasion of host defenses by type 1-piliated uropathogenic Escherichia coli. Science. 282, 1494-1497 (1998).
  20. Mysorekar, I. U., Mulvey, M. A., Hultgren, S. J., Gordon, J. I. Molecular regulation of urothelial renewal and host defenses during infection with uropathogenic Escherichia coli. The Journal of biological chemistry. 277, 7412-7419 (2002).
  21. Schwartz, D. J., Chen, S. L., Hultgren, S. J., Seed, P. C. Population Dynamics and Niche Distribution of Uropathogenic Escherichia coli. during Acute and Chronic Urinary Tract Infection. Infect. Immun. 79, 4250-4259 (2011).
  22. Garofalo, C. K., et al. Escherichia coli. from urine of female patients with urinary tract infections is competent for intracellular bacterial community formation. Infection and immunity. 75, 52-60 (2007).
  23. Justice, S. S., et al. Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli. in urinary tract pathogenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 1333-1338 (2004).
  24. Rosen, D. A., et al. Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae. urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression. Infection and immunity. 76, 3337-3345 (2008).
  25. Anderson, G. G., et al. Intracellular bacterial biofilm-like pods in urinary tract infections. Science. 301, 105-107 (2003).
  26. Robino, L., et al. Detection of intracellular bacterial communities in a child with Escherichia coli. recurrent urinary tract infections. Pathogens and disease. 68, 78-81 (2013).
  27. Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4, e329(2007).
  28. Horsley, H., et al. Enterococcus faecalis subverts and invades the host urothelium in patients with chronic urinary tract infection. PloS one. 8, e83637(2013).
  29. Hopkins, W. J., Uehling, D. T., Wargowski, D. S. Evaluation of a familial predisposition to recurrent urinary tract infections in women. American Journal of Medical Genetics. 83, 422-424 (1999).
  30. Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli. urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. Infection and immunity. 66, 2798-2802 (1998).
  31. Mabeck, C. E. Treatment of uncomplicated urinary tract infection in non-pregnant women. Postgraduate medical journal. 48, 69-75 (1972).
  32. Ferry, S., Holm, S., Stenlund, H., Lundholm, R., Monsen, T. The natural course of uncomplicated lower urinary tract infection in women illustrated by a randomized placebo controlled study. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 36, 296-301 (2004).
  33. Hannan, T. J., Mysorekar, I. U., Hung, C. S., Isaacson-Schmid, M. L., Hultgren, S. J. Early severe inflammatory responses to uropathogenic E. coli. predispose to chronic and recurrent urinary tract infection. PLoS Pathog. 6, (2010).
  34. Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli. persistence and eradication from the urinary tract. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 14170-14175 (2006).
  35. Glahn, B. E., Braendstrup, O., Olesen, H. P. Influence of drainage conditions on mucosal bladder damage by indwelling catheters. II. Histological study. Scandinavian journal of urology and nephrology. 22, 93-99 (1988).
  36. Goble, N. M., Clarke, T., Hammonds, J. C. Histological changes in the urinary bladder secondary to urethral catheterisation. British journal of urology. 63, 354-357 (1989).
  37. Ronald, A. The etiology of urinary tract infection: traditional and emerging pathogens. Dis Mon. 49, 71-82 (2003).
  38. Arias, C. A., Murray, B. E. The rise of the Enterococcus.: beyond vancomycin resistance. Nature reviews. Microbiology. 10, 266-278 (2012).
  39. Garibaldi, R. A., Burke, J. P., Dickman, M. L., Smith, C. B. Factors predisposing to bacteriuria during indwelling urethral catheterization. The New England journal of medicine. 291, 215-219 (1974).
  40. Warren, J. W. Catheter-associated urinary tract infections. Infect Dis Clin North Am. 11, 609-622 (1997).
  41. Guiton, P. S., Hung, C. S., Hancock, L., Caparon, M. G., Hultgren, S. J. Enterococcal biofilm formation and virulence in an optimized murine model of foreign body-associated urinary tract infections. Infection and immunity. 78, 4166-4175 (2010).
  42. Flores-Mireles, A. L., Pinkner, J. S., Caparon, M. G., Hultgren, S. J. EbpA vaccine antibodies block binding of Enterococcus faecalis. to fibrinogen to prevent catheter-associated bladder infection in mice. Science translational medicine. 6, 254ra127(2014).
  43. Martinez, J. J., Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Pinkner, J. S., Hultgren, S. J. Type 1 pilus-mediated bacterial invasion of bladder epithelial cells. The EMBO Journal. 19, 2803-2812 (2000).
  44. Hultgren, S. J., Schwan, W. R., Schaeffer, A. J., Duncan, J. L. Regulation of production of type 1 pili among urinary tract isolates of Escherichia coli. Infection and immunity. 54, 613-620 (1986).
  45. Chenoweth, C. E., Gould, C. V., Saint, S. Diagnosis, Management, and Prevention of Catheter-Associated Urinary Tract Infections. Infect. Dis. Clin. North Am. 28, 105-+(2014).
  46. Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7, 653-660 (2002).
  47. Justice, S. S., Hunstad, D. A., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Filamentation by Escherichia coli. subverts innate defenses during urinary tract infection. Proc Natl Acad Sci USA. 103, (1988).
  48. Song, J., et al. TLR4-mediated expulsion of bacteria from infected bladder epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 14966-14971 (2009).
  49. Wang, H., Min, G., Glockshuber, R., Sun, T., Kong, X. P. Uropathogenic E. coli. adhesin-induced host cell receptor conformational changes: implications in transmembrane signaling transduction. Journal of molecular biology. 392, 352-361 (2009).
  50. Cusumano, C. K., et al. Treatment and prevention of urinary tract infection with orally active FimH inhibitors. Science translational medicine. 3, 109-115 (2011).
  51. Langermann, S., Ballou, W. R. Vaccination utilizing the FimCH complex as a strategy to prevent Escherichia coli. urinary tract infections. J Infect Dis. 183, S84-S86 (2001).
  52. Langermann, S., et al. Vaccination with FimH adhesin protects cynomolgus monkeys from colonization and infection by uropathogenic Escherichia coli. J Infect Dis. 181, 774-778 (2000).
  53. Langermann, S., et al. Prevention of mucosal Escherichia coli. infection by FimH-adhesin-based systemic vaccination. Science. 276, 607-611 (1997).
  54. Alteri, C. J., Hagan, E. C., Sivick, K. E., Smith, S. N., Mobley, H. L. T. Mucosal Immunization with Iron Receptor Antigens Protects against Urinary Tract Infection. Plos Pathogens. 5, (2009).
  55. Russo, T. A., et al. The siderophore receptor IroN of extraintestinal pathogenic Escherichia coli. is a potential vaccine candidate. Infect. Immun. 71, 7164-7169 (2003).
  56. Schwartz, D. J., et al. Positively selected FimH residues enhance virulence during urinary tract infection by altering FimH conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15530-15537 (2013).
  57. Czaja, C. A., et al. Prospective cohort study of microbial and inflammatory events immediately preceding Escherichia coli. recurrent urinary tract infection in women. J Infect Dis. 200, 528-536 (2009).
  58. Chen, S. L., et al. Genomic Diversity and Fitness of E. coli. Strains Recovered from the Intestinal and Urinary Tracts of Women with Recurrent Urinary Tract Infection. Science Translational Medicine. 5, 2013(2013).
  59. Schilling, J. D., Mulvey, M. A., Vincent, C. D., Lorenz, R. G., Hultgren, S. J. Bacterial invasion augments epithelial cytokine responses to Escherichia coli. through a lipopolysaccharide-dependent mechanism. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 166, 1148-1155 (2001).
  60. Schwartz, D. J., Chen, S. L., Hultgren, S. J., Seed, P. C. Population Dynamics and Niche Distribution of Uropathogenic Escherichia coli. during Acute and Chronic Urinary Tract Infection. Infect. Immun. 79, 4250-4259 (2011).
  61. Chan, C. Y., St John,, L, A., Abraham, S. N. Mast Cell Interleukin-10 Drives Localized Tolerance in Chronic Bladder Infection. Immunity. 38, 349-359 (2013).
  62. Justice, S. S., Lauer, S. R., Hultgren, S. J., Hunstad, D. A. Maturation of intracellular Escherichia coli. communities requires SurA. Infect. Immun. 74, 4793-4800 (2006).
  63. Justice, S. S., Hunstad, D. A., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Filamentation by Escherichia coli. subverts innate defenses during urinary tract infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19884-19889 (2006).
  64. Justice, S. S., et al. Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli. in urinary tract pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 1333-1338 (2004).
  65. Guiton, P. S., Hannan, T. J., Ford, B., Caparon, M. G., Hultgren, S. J. Enterococcus faecalis. Overcomes Foreign Body-Mediated Inflammation To Establish Urinary Tract Infections. Infect. Immun. 81, 329-339 (2013).
  66. Thumbikat, P., Waltenbaugh, C., Schaeffer, A. J., Klumpp, D. J. Antigen-specific responses accelerate bacterial clearance in the bladder. Journal of Immunology. 176, 3080-3086 (2006).
  67. Rosen, D. A., Hung, C. -S., Kline, K. A., Hultgren, S. J. Streptozocin-induced diabetic mouse model of urinary tract infection. Infect. Immun. 76, 4290-4298 (2008).
  68. Daneshgari, F., Leiter, E. H., Liu, G., Reeder, J. Animal Models of Diabetic Uropathy. Journal of Urology. 182, S8-S13 (2009).
  69. Guiton, P. S., et al. Combinatorial Small-Molecule Therapy Prevents Uropathogenic Escherichia coli. Catheter-Associated Urinary Tract Infections in Mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56, 4738-4745 (2012).
  70. Totsika, M., et al. A FimH Inhibitor Prevents Acute Bladder Infection and Treats Chronic Cystitis Caused by Multidrug-Resistant Uropathogenic Escherichia coli. ST131. Journal of Infectious Diseases. 208, 921-928 (2013).

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Réimpressions et autorisations

Erratum


Formal Correction: Erratum: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model
Posted by JoVE Editors on 8/18/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. The Protocol section has been updated.

The ethics statement has been updated from:

Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20120216, which was approved 01/11/2013 and expires 01/11/2016. Overall care of the animals was consistent with The guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”

to:

Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20150226, which expires 12/10/2018. Overall care of the animals was consistent with The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”

Step 3 has been updated from:

3. Bacterial Inoculation

  1. Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
  2. Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
    NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.
  3. Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
  4. Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a 32 ounce glass jar containing a tea-infuser ball with cotton balls soaked with 3 ml of isoflurane or vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
    NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a jar or vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
    NOTE: If glass jar with tea-ball and/or nose cone with isoflurane-soakd cotton balls are used, the animal must be carefully observed to avoid anesthetic overdose and death. The advantage of using a vaporizer and anesthesia chamber is that it provides controlled isoflurane administration that avoids accidental overdoses. CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.
  5. Remove the mouse from the jar/vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
  6. Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) or 50 ml conical tube with a cotton ball containing a small amount (approximately 1-2 ml) of isoflurane.
  7. Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
  8. Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
    NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.
  9. Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.  
    NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.

to:

3. Bacterial Inoculation

  1. Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
  2. Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
    NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.
  3. Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
  4. Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
    NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
    CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.
  5. Remove the mouse from the vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
  6. Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) to maintain anesthetization.
  7. Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
  8. Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
    NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.
  9. Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.  
    NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.

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