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Article de méthode

L'isolement et la culture primaire de cellules endothéliales aortiques de souris

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⸱

DOI :

10.3791/52965

⸱

19 décembre 2016

 ,  , 
1Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University, 2Third Xiangya Hospital and the Institute of Vascular Disease and Translational Medicine, Central South University

Dans cet article

Résumé

Les cellules endothéliales vasculaires jouent un rôle important dans de nombreux troubles cardiovasculaires importants. Cet article décrit une méthode simple pour isoler et étendre les cellules endothéliales de l’aorte de souris sans utiliser d’équipement spécial. Notre protocole fournit un moyen efficace d’identifier les mécanismes de la physiopathologie des cellules endothéliales.

Résumé

L’endothélium vasculaire est essentiel à l’homéostasie vasculaire normale. Son dysfonctionnement participe à divers troubles cardiovasculaires. La souris est un modèle important pour la recherche sur les maladies cardiovasculaires. Cette étude démontre une méthode simple pour isoler et cultiver des cellules endothéliales de l’aorte de souris sans aucun équipement spécial. Pour isoler les cellules endothéliales, l’aorte thoracique est rapidement retirée du corps de la souris, et le tissu adipeux et le tissu conjonctif attachés sont retirés de l’aorte. L’aorte est coupée en anneaux de 1 mm. Chaque anneau aortique est ouvert et ensemencé sur une matrice réduite en facteur de croissance, l’endothélium vers le bas. Les segments sont cultivés dans un milieu de croissance de cellules endothéliales pendant environ 4 jours. La germination endothéliale commence dès le jour 2. Les segments sont ensuite retirés et les cellules sont cultivées continuellement jusqu’à ce qu’elles atteignent la confluence. Les cellules endothéliales sont récoltées à l’aide de protéinase neutre et cultivées dans un milieu de croissance de cellules endothéliales pendant deux autres passages avant d’être utilisées pour des expériences. La coloration par immunofluorescence a indiqué qu’après le deuxième passage, la majorité des cellules étaient doublement positives pour l’absorption de Dil-ac-LDL, la liaison à la lectine et la coloration CD31, les caractéristiques typiques des cellules endothéliales. Il est suggéré que les cellules des deuxième à troisième passages conviennent aux expériences in vitro et in vivo pour étudier la biologie endothéliale. Notre protocole fournit un moyen efficace d’identifier des mécanismes cellulaires et moléculaires spécifiques dans la physiopathologie des cellules endothéliales.

Introduction

L'endothélium vasculaire est non seulement une couche barrière qui sépare le sang et les tissus, on considère une vaste glande endocrine qui étend sur la totalité de l' arbre vasculaire avec une surface spécifique de 400 mètres carrés 1. Le bien-être de l'endothélium est essentiel à l'homéostasie vasculaire. L'endothélium dysfonctionnel participe à divers troubles cardiovasculaires, y compris l' athérosclérose, la vasculite et les blessures d' ischémie / reperfusion, etc. 2-4. À ce jour, les mécanismes cellulaires et moléculaires spécifiques impliqués dans ces paramètres de la maladie ne sont pas bien comprises en raison de la nature anatomique diffuse de l'endothélium.

La souris est un modèle important pour la recherche parce que les techniques de manipulation génétique sont plus développés chez les souris que chez les autres espèces de mammifères. Cependant, l'isolement des cellules endothéliales aortiques murins primaires est considérée comme particulièrement difficile en raison de la petite taille de l'aorte fait enzymatic digestion de l'endothélium impraticable. Certaines procédures pour isoler et purifier CEs nécessitent 5-7 signalé.

L'objectif de ce protocole est d'utiliser une méthode simple pour isoler et développer les cellules endothéliales de l'aorte de la souris sans utiliser aucun équipement spécial. Dans ce protocole, l'aorte fraîchement isolée est coupée en petits segments et ensemencées sur une matrice avec l'endothélium vers le bas pour permettre la germination endothéliale. Après segments sont enlevés, les cellules endothéliales sont développées dans le milieu de l'endothélium favorisée et sont prêts pour des expériences après deux ou trois passages. Les avantages du procédé décrit sont les suivants: 1) des nombres très élevés de cellules endothéliales sont récoltées à partir d'une seule aorte; 2) la viabilité des cellules est bien conservé; et 3) aucun équipement ou d'une technique spéciale est nécessaire. Il fournit un moyen efficace d'identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires spécifiques dans la physiopathologie des cellules endothéliales. Pour ceux qui sont intéressés à étudier prles cellules endothéliales cultivées imary provenant soit des souris knock-out, le gène souris knock-in, ou un modèle murin de la maladie, ce protocole est très utile et facile à pratiquer.

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Protocole

1. Isolement de l'aorte de souris

Toutes les procédures décrites ici ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université Wayne State.

  1. Placer la souris dans la chambre d'aspiration de la machine d'anesthésie. Régler le débit de l' isoflurane à 4% en conjonction avec 25% d' air frais et de 75% de O 2. Anesthetize la souris par inhalation d'isoflurane (4% pour l' induction, ± 1,0% pour la maintenance) en conjonction avec 25% d' air frais et de 75% O 2 par chambre d'induction suivie d'un cône de nez dédié. NOTE: L'anesthésie avec de l'isoflurane peut être livré dans 75% d'oxygène / 25% d'air ou 100% d'oxygène.
  2. Vérifiez la souris toutes les 5 min jusqu'à ce que le niveau approprié de l'anesthésie est atteinte (absence de retrait pincement de l'orteil).
  3. Prendre la souris hors de la chambre d'induction et continuer l'isoflurane par inhalation si le cône de nez dédié qui est connecté à la machine d'anesthésie. Mettez leisoflurane écoulement à 1% pour maintenir l'anesthésie.
  4. Alors qu'il est sous anesthésie, mettez la souris sur un bloc de chirurgie, positionné sur son dos. Utilisez du ruban de laboratoire pour sécuriser les membres.
  5. Utilisez une lampe chauffante pour maintenir la chaleur de la souris. Gardez la lampe à une distance appropriée de la souris pour que la souris ne sera pas trop de chaleur.
  6. Vaporiser la poitrine avec 70% d'éthanol.
  7. Utilisez des ciseaux de dissection pour ouvrir l'abdomen de la ligne médiane, et d'exposer l'aorte abdominale. Ouvrez la cavité thoracique et d'exposer le cœur et les poumons.
  8. Couper l'aorte abdominale au milieu avec des ciseaux de dissection pour libérer le sang.
  9. Remplir une seringue de 1 ml (avec 25 aiguille G) avec 1 mL de PBS contenant 1 000 U / ml d'héparine. Injecter du PBS contenant 1 000 U / ml d'héparine dans le ventricule gauche et perfuser l'aorte. Poussez le cœur et le poumon avec une pince sur les grandes artères du côté droit de la souris pour exposer l'aorte thoracique.
  10. Retirez rapidement l'aorte thoracique à l'aide de micro-dipinces ssection et le mettre dans la glace froide 1x PBS (stérile), puis transporter le conteneur dans une hotte à flux laminaire.
  11. Insérez une seringue de 1 ml équipé 25 aiguille G dans une extrémité de l'aorte, et rincer doucement l'aorte avec PBS glacé pour enlever le sang.
  12. Utilisez une pince micro-dissection pour enlever autant du tissu adipeux ci-joint et de petits vaisseaux latéraux que possible.
  13. transférer immédiatement l'aorte endothéliales milieu de croissance.
  14. Couper l'aorte en 1 mm anneaux à l'aide d'une lame de scalpel stérile. Récolte environ 8 - 10 anneaux par aorte.
  15. Ouvrez chaque anneau aortique en utilisant une paire de ciseaux micro-dissection.

2. Seed les Segments aortiques sur matrice

  1. Lorsqu'ils ne sont pas en cours d'utilisation, maintenir la matrice de facteur réduit la croissance de -20 ° C pour empêcher la solidification. Placer la matrice de facteur de croissance réduite à 4 ° C au moins pendant une nuit pour permettre une décongélation complète.
  2. Prérefroidissement un 6 puits conseils de plaque et de pipettes à -20 ° C pendant au moins10 minutes. Mettez la plaque de 6 puits sur la glace et le manteau d'un puits de la plaque avec 1 ml de matrice sans introduire de bulles d'air. Placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C pendant 20 min pour permettre à la matrice de se solidifier.
  3. Implanter les morceaux de l'aorte sur la matrice solidifiée en utilisant une pince micro-dissection stériles. Placez les morceaux du côté lumière vers le bas sur la matrice sans toucher l'endothélium. Place 3 - 4 segments aortiques proches les uns des autres sur la matrice.
  4. Ajoutez juste assez milieu de croissance des cellules endothéliales pour maintenir les segments humide (~ 200 pi).
  5. Incuber la plaque à 37 ° C sous 5% de CO 2 pendant 4 à 6 heures. A la fin de la journée, ajoutez juste assez moyen pour couvrir les segments de l'aorte.
  6. Observez le segment aortique germination périodiquement sous un microscope à contraste de phase. Vérifier le niveau moyen et la croissance cellulaire chaque jour. Ajouter moyen si nécessaire pour maintenir les segments aortiques couverts.
  7. Sur le 4 ème jour, retirez délicatement le moyen et retirer les segments de l' aorte felon la matrice à l'aide d'une aiguille stérile sans interrompre les cellules endothéliales en croissance.
  8. Ajouter 2 ml de nouveau milieu de croissance des cellules endothéliales et les cellules endothéliales permettent continuent de proliférer sur la matrice 2 - 3 jours.

3. repiquage initial des cellules endothéliales aortiques Souris

  1. Enduire un nouveau flacon de T12.5 avec de la gélatine (0,1%), incuber à 37 ° C pendant 30 min.
  2. Laver les plaques de matrice avec soin stérile 37 ° C PBS.
  3. Ajouter 2 mL de proteinase neutre (50 U / ml) sur les plaques de matrice et incuber à température ambiante sur la plate-forme rocker avec agitation occasionnelle. Vérifiez les cellules sous un microscope à contraste de phase pour vous assurer que la majorité des cellules sont détachés.
  4. Ajouter 2 mL de D-Val pour inactiver la proteinase neutre.
  5. Recueillir le surnageant avec précaution dans un tube de 15 ml centrifugeuse. Laver la plaque avec 2 ml D-Val et recueillir le surnageant.
  6. Centrifuger la suspension cellulaire à 900 xg pendant 5 min à room température.
  7. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 4 ml de milieu de croissance des cellules endothéliales et la plaque dans le flacon T12.5 enrobé avec de la gélatine. Incuber les cellules à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant 2 h.
  8. Remplacez le support. Incuber les cellules à 37 ° C, 5% de CO2 jusqu'à ce qu'elles soient 85% - 90% de confluence.

4. repiquage des cellules endothéliales aortiques Souris

  1. Manteau deux nouvelles fioles de T12.5 avec de la gélatine (0,1%), incuber à 37 ° C pendant 30 min. Pré-chauffage de la trypsine-EDTA (0,25% de trypsine, 0,02 EDTA dans du PBS) et du PBS stérile à 37 ° C pendant environ 15 min.
  2. Laver les cellules avec soin stérile 37 ° C PBS.
  3. Ajouter 0,5 ml de Trypsine-EDTA (0,25% de trypsine, 0,02 EDTA dans du PBS) et incuber à 37 ° C pendant environ 1 minute ou jusqu'à ce que la majorité des cellules se retourner.
  4. Ajouter 2 mL de milieu de croissance des cellules endothéliales pour arrêter la digestion. Introduire à la pipette la suspension de cellules et vers le bas dans le temps de plusieurs flacons. Si nécessaire, utilisez une cellulegrattoir pour recueillir les cellules.
  5. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml de la centrifugeuse. Centrifuger la suspension cellulaire à 900 g pendant 5 min à température ambiante.
  6. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 4 ml de milieu de croissance des cellules endothéliales et de la plaque dans des ballons de 2 T12.5 revêtues de gélatine. Incuber les cellules à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant 2 h.
  7. Remplacez le support. Incuber les cellules à 37 ° C, 5% de CO2 jusqu'à ce qu'elles soient 85% - 90% de confluence.
  8. Utiliser les cellules endothéliales aortiques de souris après 2 - 3 passages.

5. Caractérisation des cellules endothéliales aortiques de souris

  1. Re-plaque les cellules.
    1. Enduire une plaque à 6 puits avec de la gélatine (0,1%), incuber à 37 ° C pendant 30 min. Rincer la plaque avec du PBS.
    2. Préchauffer la trypsine-EDTA et du PBS stérile à 37 ° C pendant environ 15 min.
    3. Laver les cellules avec du PBS stérile 3 fois. Ajouter 0,5 ml de solution de trypsine / EDTA pour les cellules, incuber pendant environ 1 min à 37 ° C or jusqu'à ce que la majorité des cellules se retourner.
    4. Ajouter 2 mL de milieu de croissance des cellules endothéliales pour arrêter la digestion. Introduire à la pipette la suspension de cellules et vers le bas dans le temps de plusieurs flacons. Si nécessaire, utiliser un grattoir cellulaire pour recueillir les cellules.
    5. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml de la centrifugeuse. Centrifuger la suspension cellulaire à 900 g pendant 5 min à température ambiante.
    6. Jeter le surnageant, remettre en suspension les cellules dans un milieu de croissance des cellules endothéliales. Ensemencer les cellules en plaque de 6 puits revêtus avec de la gélatine à la densité de 3 x 10 5 / puits.
    7. Incuber les cellules pendant une nuit à 37 ° C, 5% de CO 2 pour permettre aux cellules de se fixer à la surface de culture.
  2. Dil-ac-LDL uptaken et Ulex -lectin liaison.
    1. Stocker le 1,1'-dioctadécyl-3,3,3 ', 3'- tetramethylindo-carbocyanine perchlorate marqué LDL acétylé (Dil-ac-LDL) à -20 ° C. Avant la coloration, dégeler Dil-ac-LDL sur la glace. La solu Stock Dil-ac-LDLtion est de 1 mg / ml. Stocker le europaeus agglutinine marqué FITC Ulex (Ulex -Lectin, 1 pg / ml) à 4 ° C. La solution stock Ulex -Lectin est de 1 mg / mL. Magasin Hoechst 33342 à 4 ° C. La 33342 solution mère Hoechst est de 100 pg / mL.
    2. Ajouter 10 ul d'Dil-ac-LDL solution mère à 1 ml de milieu de culture pour obtenir une concentration finale de 10 pg / ml.
    3. Avant coloration, retirez l'ancien milieu et laver les cellules dans chaque puits par un nouveau milieu.
    4. Retirez le nouveau moyen et ajouter le milieu de coloration Dil-ac-LDL.
    5. Incuber les cellules à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant 1 h.
    6. Laver les cellules avec stériles 1x PBS 3 fois.
    7. Ajouter 1 ml de formol à 10% pour fixer les cellules. Mettre la plaque dans la température ambiante pendant environ 30 min.
    8. Laver les cellules avec stériles 1x PBS 3 fois. Évitez la lumière.
    9. Ajouter 1 mL stérile 1x PBS qui contient 10 pi de Ulex -Lectin.
    10. Incuber les cellules à chambre tempérare dans l'obscurité pendant 1 h.
    11. Retirer la Ulex lectine-en lavant les cellules avec du PBS stérile 1x 3 fois.
    12. Ajouter de Hoechst 33342 à une concentration finale de 1 pg / ml, incuber pendant 10 minutes dans l'obscurité.
    13. Voir la fluorescence de Dil-ac-LDL (rouge, excitation longueur d'onde de 576 nm), Ulex -Lectin (vert, excitation longueur d'onde de 519 nm) et Hoechst (bleu, excitation longueur d'onde de 361 nm) avec un microscope à fluorescence inversé.
  3. coloration fluorescente pour CD31, VEGFR2, eNOS, VE-cadhérine et calponine.
    1. Magasin de l'anticorps conjugué au FITC anti-souris CD31, un anticorps eNOS, la VE-cadhérine anticorps, conjugué à FITC IgG anti-lapin à 4 ° C dans l'obscurité. Magasin VEGFR2 anticorps -20 ° C.
    2. Laver les cellules avec stériles 1x PBS 3 fois.
    3. Ajouter 1 ml de formol à 10% pour fixer les cellules. Mettre la plaque dans la température ambiante pendant environ 30 min.
    4. Laver les cellules avec stériles 1x PBS 3 fois.
    5. Pour colorer CD31, ajouter 1 ml de 1x stérilePBS contenant 10 pi d'anticorps CD31-FITC. Pour colorer soit VEGFR2, eNOS, VE-cadhérine ou calponin, ajouter 1 ml de solution stérile 1x PBS contenant 4 pi de VEGFR2, eNOS, VE-cadhérine ou calponin anticorps primaire, respectivement.
    6. Incuber les cellules sur de la glace pendant 1 h dans l'obscurité.
    7. Retirer les anticorps par lavage des cellules avec du PBS stérile 3 fois.
    8. Pour la coloration de VEGFR2 eNOS, la VE-cadhérine ou calponin, ajouter 1 ml de solution stérile PBS 1x contenant 10 ul de FITC conjugué IgG anti-lapin. Incuber les cellules sur de la glace pendant 1 h dans l'obscurité. Éliminer les IgG en lavant les cellules avec du PBS stérile 3 fois.
    9. Ajouter de Hoechst 33342 à une concentration finale de 1 pg / ml, incuber pendant 10 minutes dans l'obscurité.
    10. Voir la fluorescence de CD31, VEGFR2, eNOS, VE-cadhérine, calponin (vert, excitation longueur d'onde de 518-535 nm) et Hoechst (bleu, excitation longueur d'onde de 361 nm) avec un microscope à fluorescence inversé.

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Résultats

Cellules endothéliales Germination

cellules endothéliales spontanée germination a commencé à partir d'un segment d'aorte de souris. Le segment d'aorte de souris a été autorisée à se développer sur une matrice de facteurs de croissance, puis réduit dans un milieu de croissance des cellules endothéliales pendant 4 jours. La germination des cellules endothéliales apparaît généralement dans 2 - 4 jours. Photomicrographies ont été prises le jour 4 (Figure 1).<...

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Discussion

Cette étude démontre une méthode simple pour isoler et cultiver des cellules endothéliales d'une aorte de souris sans aucun équipement spécial. La coloration par immunofluorescence a indiqué que la majorité des cellules sont des cellules endothéliales après le second passage. Il est suggéré que les cellules au deuxième à la troisième passage sont adaptés pour in vitro et in vivo des expériences pour étudier la biologie endothéliale.

Les billets clés du protocole...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette étude est soutenue par la subvention de développement scientifique 13SDG16930098 de l’American Heart Association et le prix de la jeunesse de la Fondation nationale des sciences de Chine 81300240 (PI : Wang). Nous remercions Roberto Mendez de la Wayne State University pour son aide dans la préparation du manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Souris âgées de 4 ou 6 semainesJackson Laboratory#000664
Stérile 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Gibco#10010-023
Stérile 1x PBS contenant 1 000 U/mL d’héparineSigma AldrichH3149
Milieu de croissance des cellules endothéliales (Dulbeccos Aigle modifié' s Medium [DMEM] avec 25  ; mM HEPES [Gibco, #12320-032], complété par 100  ; &mu ; g/mL de supplément de croissance des cellules endothéliales à partir de tissu neural bovin [ECGS, Sigma, #2759], sérum fœtal bovin à 10 % [FBS, Gibco, #10082-147], 1 000 U/mL d’héparine [Sigma Aldrich, H3149], 10 000 U/mL de pénicilline et 10 mg/mL de streptomycine [Gibco, #15140-122])Matrice
réduite par facteur de croissanceBD Biosciences356231
protéinase neutre (Dispase, 1  ; U/mL, Fisher Scientific, #CB-40235) et le milieu D-Val (D-Valine, 0,034  ; g/L, Sigma, #1255), dans Aigle modifié' s Glucose moyen, faible (Gibco, #12320-032)
1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'- tétraméthylindo-carbocyanine perchlorate LDL acétylé (Dil-ac-LDL)Life TechnologiesL3484
FITC marqué Ulex europaeus agglutinine (Ulex-Lectin)SigmaL9006
Anticorps conjugué anti-souris CD31-FITCBD Biosciences553372
Anticorps anti-anticorps anti-facteur de croissance de l’endothélium vasculaire de2 Signalisation cellulaire9698
Oxyde nitrique synthase anti-endothélial de sourisAbcamab5589
Endothélium-cadhérine vasculaire anti-sourisAbcam33168
Calponine anti-sourisAbcam700
IgG anti-lapin conjuguée FITCSigmaF6005
Seringue de 1 mL équipée d’une aiguille 25 GFisher Scientific50-900-04222
Péri-boîtes de 100 mmFisher Scientific07-202-516
Plaques de culture cellulaire à six puitsFisher Scientific08-772-1B
Fiole de culture T12.5Fisher Scientific50-202-076
Ciseaux, pinces, ciseaux de microdissection et pinces, Lame de scalpelFine Science Tools, Inc.
Appareil d’anesthésie avec isofluraneWebster Veterianary Supply07-806-3204
lampe
Centrifugeuse
contraste de phase inversé
fluorescence inversée
souris chauffanteMicroscope àMicroscope à

Références

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