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Article de méthode

Mise en œuvre de patch clamp en direct et microscopie de fluorescence pour surveiller propriétés fonctionnelles des fraîchement isolés PKD épithélium

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DOI :

10.3791/53035

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1 septembre 2015

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1Department of Physiology, Medical College of Wisconsin, 2Department of Integrative Biology & Pharmacology, University of Texas Health Science Center at Houston

Dans cet article

Résumé

Les canaux ioniques exprimés dans l'épithélium tubulaire rénal jouent un rôle important dans la pathologie de la maladie polykystique des reins. Nous décrivons ici les protocoles expérimentaux utilisés pour effectuer l'analyse et le niveau de calcium intracellulaire mesures patch-clamp dans l'épithélium kystique fraîchement isolées à partir de reins de rongeurs.

Résumé

Cyst initiation et l'expansion au cours de la maladie polykystique des reins est un processus complexe caractérisé par des anomalies dans la prolifération des cellules tubulaire, l'accumulation de fluide luminal et formation de la matrice extracellulaire. L'activité des canaux ioniques et la signalisation intracellulaire de calcium sont des paramètres physiologiques clés qui déterminent les fonctions de l'épithélium tubulaire. Nous avons développé une méthode appropriée pour l'observation en temps réel de l'activité des canaux ioniques avec la technique de patch-clamp et l'enregistrement de Ca2 + intracellulaire niveau dans les monocouches épithéliales fraîchement isolés à partir de kystes rénaux. Rats PCK, un modèle génétique autosomique récessive de la maladie polykystique des reins (ARPKD), ont été utilisés ici pour l'analyse ex vivo de canaux ioniques et des flux de calcium. Décrit ici est une procédure étape par étape détaillé destiné à isoler monocouches kystiques et tubules non dilatée de PCK ou rats normaux Sprague Dawley (SD), et de surveiller l'activité de canal unique et dynamique intracellulaire de Ca2 +.Cette méthode ne nécessite pas de traitement enzymatique et permet une analyse dans un cadre natif de monocouche épithéliale fraîchement isolés. De plus, cette technique est très sensible aux variations de calcium intracellulaire et génère des images à haute résolution pour des mesures précises. Enfin, isolé épithélium kystique peut encore être utilisé pour la coloration avec des anticorps ou des colorants, la préparation des cultures primaires et la purification de différents dosages biochimiques.

Introduction

Les canaux ioniques jouent un rôle important dans de nombreuses fonctions physiologiques, y compris la croissance et la différenciation cellulaires. Les maladies rénales autosomiques dominants et récessifs polykystiques (PKRAD et PKRAR, respectivement) sont des troubles génétiques caractérisées par le développement de kystes remplis de fluide rénal de l'origine des cellules épithéliales tubulaires. PKD est causée par des mutations de gènes codant pour PKD1 ou PKD2 polycystines 1 et 2, des protéines membranaires impliquées dans la régulation de la prolifération cellulaire et la différenciation. PKD2 par lui-même ou sous forme de complexe avec PKD1 fonctionnent également en tant que cation -permeable canal 1 de Ca2 +. Les mutations du gène codant fibrocystine PKHD1 (une protéine de type récepteur cils associés impliqués dans le tubulogenèse et / ou maintien de la polarité de l'épithélium) sont l'impulsion génétique de ARPKD 2. La croissance de kyste est un phénomène complexe accompagnée de la prolifération perturbée 3,4, 5 l'angiogenèse, la dédifférenciation et la perte de polairelité de cellules tubulaires 6-8.

Réabsorption défectueuse et la sécrétion augmentée dans l'épithélium kystique contribuent à l'accumulation de liquide dans la lumière et l'expansion kyste 9,10. Facultés dépendant du débit [Ca2 +] i la signalisation a été également liée à kystogenèse cours PKD 11-15.

Ici, nous décrivons une méthode appropriée pour la mesure de patch-clamp de l'activité de canal unique et les niveaux intracellulaires de Ca2 + dans des monocouches epitheliales kystiques isolés de rats PCK. Cette méthode a été appliquée avec succès par nous pour caractériser l'activité du canal Na + épithélial (ENAC) et 10 [Ca2 +] i dépendante processus induits par le Ca 2+ TRPV4 -permeable et purinergique cascade de signalisation 13.

Dans ces études, nous avons utilisé des rats PCK, un modèle de ARPKD causée par une mutation spontanée dans le gène PKHD1. La souche PCK était originallY provenant de rats 16 rats ainsi SD sont utilisés comme un contrôle approprié pour la comparaison avec la souche PCK Sprague-Dawley (SD). En conséquence, les deux segments de rats SD néphron et des conduits non dilaté collecte isolés à partir de rats PCK mêmes peuvent servir de deux groupes de comparaison différents pour des expériences sur l'épithélium kystique.

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Protocole

Les procédures expérimentales décrites ci-dessous ont été approuvés par le Comité de soin et l'utilisation institutionnelle animale au Collège médical du Wisconsin et de l'Université du Health Science Center Texas à Houston et étaient en conformité avec les National Institutes of Health Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. La figure 1 montre principales étapes de la séparation des tissus et la procédure de traitement. En bref, les reins des rats PCK ou SD sont utilisés pour l'isolation manuelle de monocouches épithéliales des canaux collecteurs soit de tubes ou des kystes non-composé en bonne santé. Ici, nous avons étudié les reins à partir de 4-16 semaines vieux rats PCK 10,13.

1. Isolement des kystes rénaux et tubules communicantes (CNT) / des tubes collecteurs (CD) Segments

  1. Anesthetize animal expérimental avec de l'isoflurane (5% induction, 1,5 à 2,5% de maintenance) / note 2 O médical ou autre méthode approuvée. Les animaux doivent être surveillés en permanence pour assurer le suffisantevel de l'anesthésie. Respiratoires vitesse de réaction et de pincement de l'orteil Stable sont utilisés pour confirmer l'anesthésie appropriée.
  2. Laparotomie et rincer les reins, avec un tampon phosphate salin (PBS) à travers l'aorte abdominale 17.
    1. Préparer un cathéter de tuyaux en polyéthylène (PE50) et le connecter à une pompe seringue remplie de PBS. Couper la peau et la paroi abdominale le long de la ligne blanche, puis faire une incision abdominale transversale à travers l'abdomen de droite à gauche et déplacer les organes abdominaux avec des cotons-tiges pour obtenir l'accès à l'aorte descendante avec branchement mésentériques et coeliaques artères. Humidifiez les organes internes avec une solution saline au chaud pendant d'autres procédures pour empêcher leur sécheresse.
    2. Placez une ligature (# 1) autour des artères mésentériques et la maladie cœliaque et une autre ligature (n ° 2) autour de l'aorte sous le diaphragme (ne pas attacher). Séparez délicatement un. abdominalis par émousser disséquer les tissus conjonctifs autour de lui avec des pinces fines et placez deux ligatures ~ 3mm au-dessous de l'artère rénale gauche (n ° 3) et au-dessus de la bifurcation artères iliaques (n ° 4).
    3. Attachez ligature N ° 4 et attacher un collier de récipient autour de l'aorte entre l'artère rénale gauche et ligature # 3. Faire une incision entre la pince et la ligature # 4 à sonder l'aorte, utiliser ligature n ° 3 pour fixer fermement le cathéter.
    4. Relâchez la pince et assurez-vous que l'impulsion de sang est visible dans le cathéter pour assurer une bonne installation. Commencez la perfusion à un débit de 6 ml / min, cravate ligatures # 1 et # 2, et couper la veine rénale gauche. Continuer à rincer pendant 1-2 min jusqu'à ce que les organes sont complètement blanchis.
    5. Couper les vaisseaux sanguins rénaux, l'urètre et autour des tissus conjonctifs et adipeux avec des ciseaux pour recueillir les reins. Ensuite, faire une courte déchirure dans capsule rénale et éplucher les reins pour les décapsuler. Placez les reins en PBS glacé. L'euthanasie est confirmée par une thoracotomie.
  3. Préparer 5 x 5 mm éclats de verre de recouvrement revêtues de poly-L-Lysine. Coupez un gla de couvertureSS avec un crayon de diamant et lieu environ 20 pi de solution à 0,01% stérile filtrée Poly-L-lysine sur chaque puce de verre. Préparer une solution saline et deux paires de pinces horloger pour la dissection.
  4. Couper les reins avec une lame de rasoir le long du plan frontal en tranches d'épaisseur 2/1 ~ mm. Placez l'une des tranches sous un stéréomicroscope. Isolement de tissus devrait être fait dans une solution saline glacée.
  5. Localiser kystes sous un stéréomicroscope comme cavités forme arrondie (figure 2A); leurs murs contiennent souvent important réseau de vaisseaux sanguins proliféré. Aide d'une pince à pointe fine dissèquent la couche épithéliale interne d'un kyste aussi mince que possible pour obtenir une zone de monocouche. Attacher à une puce en verre recouvert de poly-L-Lysine. Collant surface Poly-L-lysine permet au chercheur de positionner fermement la couche interne du kyste sur verre. Exposer le kyste avec le côté apical pour fournir un accès pour les pipettes (figure 2B).
  6. Utilisez PCK ou SD rat enfanttranches centrales ney contenant papille pour l'isolement de non dilatées CNT / CCDsegments 18-21.
    REMARQUE: tissus papillaires sont plus durables que le cortex et en maintenant des bandes tubulaires papillaires avec une pince et déchirant le long axe radial de la tranche peut être clivée en secteurs minces. Tubules individuels sont visibles et peuvent être retirées pour être placé sur des puces de verre de couverture.
  7. Identifier les segments CNT / CCD par bifurcations, de transparence plus élevé que les tubules proximaux et grandes cellules bien visible (figure 2C). Placez la puce de verre de couverture avec tubules fixés sous un microscope équipé d'micromanipulateurs appropriés pour micropipettes conduite. Utilisation micropipettes pointus tubules split-ouvertes et joindre leurs bords pour le verre pour rendre la surface apicale accessible (figure 2D).

Électrophysiologie 2. Single Channel patch-clamp

  1. Remplir la chambre de patch-clamp avec une solution de bain et transférer la puce de verre de couvertureavec des tissus isolés à la chambre. Veiller à ce que les micro-pipettes de patch-clamp ont une résistance de 7-10 MQ pour des mesures fiables (cellule attachée) sur des cellules.
  2. Pour les mesures cellule attachée, définir le taux de gain de l'amplificateur à 20x et passe-bas les courants à 300 Hz par un filtre à huit pôles Bessel. Pour les canaux ENaC surveillance, utiliser une solution de bain, en mm: 150 NaCl, CaCl2 1, 2 MgCl 2, 10 HEPES (pH 7,4); pipette: 140 LiCl, MgCl 2 2 et 10 HEPES (pH 7,4).
  3. Mener une expérience de patch-clamp conventionnel dans un mode cellule attachée 10. Sélectionner une cellule dans la monocouche epitheliale et l'approche de la pipette à la membrane apicale. Former un joint haute résistance entre une pipette et la membrane cellulaire en appliquant une aspiration douce. Une fois un joint gigaohm haute résistance est formée, un protocole sans interstice à un potentiel de maintien devrait être lancé pour l'activité de surveillance du canal d'intérêt.
  4. Simples données actuelles Channel Store écart-libres de gigaPhoques Ohm pour analyse ultérieure. Analyser les événements de canaux en utilisant un logiciel généralement fourni avec des configurations de patch-clamp 18. Calculer l'activité du canal que NPo où N désigne le nombre de canaux actifs dans le patch et P o est ouverte probabilité moyenne des canaux.
    REMARQUE: Utilisez des kystes ou des tubules isolés dans des expériences de patch-clamp pour pas plus de 30 min.

3. Ratiométrique épifluorescence mesures de la concentration intracellulaire de calcium dans les cellules épithéliales

  1. Utilisez 5 mM Fura-2 heures dissous dans le DMSO. Solution aliquote du stock dans des tubes coniques de 500 pi individuels (environ 10 pi). Protéger de la lumière et de stocker dans le congélateur à -20 ° C pour un maximum de six mois.
  2. Incuber kystes isolés et les tubules dédoublé ouvert pour 30-40 min dans PSS (en mm: 145 NaCl, KCl 4,5, 2 MgCl 2, CaCl 2 2 et 10 HEPES à pH 7,35) contenant 5 uM de Fura-2 heures colorant et 0.05% d'acide pluronique pour aider à disperser les esters acétoxyméthyliques. Pour cela, placez les tissus dans le 3,5 cm plat contenant le chargement cocktail, protéger de la lumière et incuber sur un agitateur lent à la température ambiante.
  3. Changer Fura-deux heures contenant les médias à nettoyer PSS après incubation et placez le tissu sous un microscope pour effectuer une imagerie complémentaire à épifluorescence.
  4. Tournez sur la caméra CCD et source de lumière stable (système de monochromateur) équipé de roue à filtres (chaque position du filtre peut être associé à son propre niveau d'atténuation, sélectionné chaque fois que le filtre est appelé).
  5. Trouver le tissu dans le champ lumineux. Commutateur de détection du signal de fluorescence et régler l'intensité de la source de lumière en utilisant des filtres de densité neutre et puissance de la lampe pour éviter la saturation du signal.
  6. Surveiller Fura-2 AM fluorescence dans l'échantillon de tissu avec une excitation à 340/380 nm ratiométrique avec une fréquence de 0,125 Hz ou plus. Utilisez un 40 × / NA 1.3 ou similaire objectif pour bon résolutionsimage tion.
  7. Pour le traitement et les calculs d'image importer la séquence d'images. Assurez-vous de séparer les canaux et utiliser un mode HyperStack en niveaux de gris. Sélectionnez plusieurs régions d'intérêt (cellules simple kyste ou des zones sélectionnées de tissu kystique) et de calculer les valeurs d'intensité pour chaque canal (340 et 380 nm) dans le logiciel d'analyse de données pratique; valeurs d'intensité de fond soustraire de chaque point de données.
  8. Pour chaque point de temps de calculer le rapport des intensités des Fura-2 AM 340 à 380 canaux. Terrain scatter / ligne des changements de point de temps de la Ca transitoire pour chaque région et de calculer des valeurs moyennes / SE.

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Résultats

Implication potentielle dans ENaC cystogénèse a été démontrée par de nombreuses études qui observe perturbé le facteur de croissance épidermique (EGF) de signalisation dans la progression PKD 22-25 et la réabsorption du sodium dans anormal ARPKD Les modèles murins et les cultures de tissus 26-28. Par exemple, Veizis et al. Ont montré que l'absorption de Na + sensible à l'amiloride est diminuée dans les cellules CD à partir du modèle de non-orthologue de souris BPK ARPKD ...

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Discussion

Nous avons décrit ici applications de la technique de patch-clamp conventionnel et imagerie épifluorescence de calcium à des monocouches épithéliales kystiques dérivées d'un modèle génétique murine de ARPKD. Le protocole se compose de trois étapes, dont la plus grande attention devrait être accordée à l'isolement des kystes (étape 1.5 de la section des protocoles) et les études électrophysiologiques. Ces procédures clés nécessitent une formation approfondie et de patience, et le lecteur ne devrait pas être frust...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) et Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc) pour une excellente assistance technique avec des expériences de microscopie. Cette étude a été financée par les Instituts nationaux de la santé accorde R01 HL108880 (AS), R01 DK095029 (à OPO) et K99 HL116603 (TSP), National Kidney Foundation IG1724 (TSP), l'American Heart Association 13GRNT16220002 (à OPO) et Ben Lipps J. bourse de recherche de l'American Society of Nephrology (DVI).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Fura-2 AMLife TechnologiesF-14185
Fluo-8AAT Bioquest21091
Poly-L-lysineSigma-AldrichP4707
Acide pluroniqueSigma-AldrichF-68  ;solution
ShakerBoekel Scientific260350
Source lumineuseSutter Instrument CoLambda XLavec obturateur/pilote de roue à filtres
intégré Filtres à densité neutreNikonND4, ND8
ObjectifNikonSFluo  ;40/1.3 DIC WD 0.22  ;   ; huile
Appareil photoAndor TechnologiesZyla sCMOS
Nikon  ; microscope (inversé)NikonNikon Eclipse TE2000-S
Cover GlassThermo Scientific6661B52
Crayondiamant Fisher Scientific22268912
Logiciel d’acquisition d’imagesNikonNikon NIS-Elements  ;
logiciel d’analyse d’imagesImageJhttp://imagej.nih.gov/ND Le plugin Utility permet d’importer des images au format natif Nikon Instruments .nd2
Chambre d’enregistrement/de perfusion WarnerInstrumentsRC-26
Patch ClampMolecular Devices
Dispositifs moléculairesDigidata 1440AAxon Digidata® ; Système
Filtre passe-basWarner InstrumentsLPF-88 pôles Bessel
Capillaires en verre borosilicatéWorld Precision Instruments1B150F-4
Extracteur de micropipettesSutter Instrument CoP-97Extracteur de micropipettes de type Flaming/Brown
MicroforgeNarishigeMF-830Japon
MicromanipulateurmotoriséSutter Instrument CoMP-225
Microscope inverséNikonEclipse Ti
Table d’isolation des microvibrationsTMCéquipée d’une cage de Faraday
Système de perfusion de valves multicanauxAutoMake ScientificValve Bank II
Chambre d’enregistrement/de perfusionWarner InstrumentsRC-26
LogicielMolecular DevicespClamp 10 . 2
Table chirurgicale à température contrôlée  ;Noyaupour rongeurs
Stéréomicroscope binoculaireNikonSMZ745
Système de perfusion basé sur une pompe à seringueHarvard Appareil
Tube en polyéthylèneSigma-AldrichPE50
Anesthésie isofluoranehttp://www.vetequip.com/911103
Autres réactifs de baseSigma-Aldrich
Le amplificateur Système d’acquisition de données MultiClamp 700B MCW

Références

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Activit des canaux ioniquescalcium intracellulaireisolement de monocouches cystiquesenregistrement lectrophysiologiqueimagerie calciquemicroscopie confocalechargement de colorants fluorescents
Mise en œuvre de patch clamp en direct et microscopie de fluorescence pour surveiller propriétés fonctionnelles des fraîchement isolés PKD épithélium
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