Article de méthode

Sur mesure Microdialyse Probe Conception

DOI :

10.3791/53048

⸱

21 juillet 2015

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1Department of Pharmacology, Goethe University of Frankfurt, 2Department of Pharmaceutical Chemistry, Goethe University of Frankfurt, 3Department of Clinical Pharmacology, Goethe University of Frankfurt

Dans cet article

Résumé

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Microdialyse est une technique couramment utilisée dans la recherche en neurosciences. Par conséquent sondes commerciales sont en grande demand.In ce travail un ensemble de sonde est expliqué en détail à construire une concentrique, sonde de microdialyse fiable, sur mesure pour moins de 10 $.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microdialyse est une technique couramment utilisée dans la recherche en neurosciences. Par conséquent sondes commerciales sont en grande demande pour surveiller les changements physiologiques, pharmacologiques et pathologiques dans le liquide céphalo-rachidien. Malheureusement, sondes commerciales sont coûteux pour les groupes de recherche dans les institutions publiques. Dans ce travail, un ensemble de sonde est expliqué en détail à construire une concentrique, sonde de microdialyse fiable, sur mesure pour moins de 10 $. La sonde de microdialyse est constitué d'une membrane en polysulfone avec un seuil de coupure moléculaire de 30 kDa. Probe in vitro recouvrements de substances ayant un poids moléculaire différent (dans la gamme de 100-1,600 Da) et différentes propriétés physico-chimiques sont comparées. La sonde donne un recouvrement d'environ 20% in vitro pour le petits composés de glucose, le lactate, l'acétylcholine et de l'ATP. In vitro recouvrements pour neuropeptides avec un poids moléculaire entre 1,000-1,600 Da montant à 2-6%. Ainsi, alors que le poids moléculaire plus élevéhuit des neuropeptides abaissé dans les valeurs de récupération in vitro, la dialyse de composés dans la fourchette basse (jusqu'à 500 Da) de poids moléculaires n'a pas grand impact sur ​​le taux de récupération in vitro dans. Le présent procédé permet l'utilisation d'une membrane de dialyse avec une autre valeur de seuil et le matériau de membrane. Par conséquent, cet ensemble de sonde sur mesure a l'avantage de la souplesse suffisante pour dialyser substances dans une large gamme de poids moléculaire. Ici, on introduit une sonde de microdialyse avec une longueur d'échange de 2 mm, ce qui est applicable pour microdialyse dans les régions du cerveau de souris et de rat. Cependant, les dimensions de la sonde peuvent être facilement adaptés pour les grandes longueurs change pour être utilisé dans de plus grands animaux.

Introduction

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Microdialyse est une technique couramment utilisée dans la recherche en neurosciences. Au cours des 50 dernières années, la technique de microdialyse minimale invasive a été continuellement amélioré pour devenir une méthode bien établie pour surveiller les concentrations locales de petits composés de poids moléculaire dans l'espace extracellulaire. Presque chaque fluide de tissu interstitiel peut être étudiée chez les animaux se déplacent librement.

Gaddum introduit la technique push-pull dans les années 1960. Il a modifié une approche de Feldberg et al. Dans laquelle tubocurarine a été perfusé à travers une canule qui se termine dans le ventricule latéral et en recueillant l'effluent également via une canule 1. Gaddum développé la technique push-pull dans lequel une canule constituée de deux aiguilles en acier concentriques a été implanté dans des zones distinctes du cerveau et perfusé par une solution tout en enlevant simultanément les neurotransmetteurs libérés par les neurones entourant la pointe 2. Malheureusement, dama de tissusge causé par la canule autour de la pointe a limité l'application de cette méthode. Comme autre avancement de ce procédé, Bito et ses collaborateurs ont introduit une méthode des sacs de dialyse, dans lequel la solution recueillie a été séparée du tissu environnant par une membrane de dialyse. Ils ont implanté un sac de dialyse dans le tissu sous-cutané de cou de chien. Le contenu du sac de dialyse est exempt de protéines et pourrait être analysée plusieurs semaines plus tard pour les ions et les acides aminés 3. L'étape suivante fut l'dialytrode, une sonde de microdialyse primitive, qui à l'origine a été décrit par Delgado en 1972 4. Enfin, Ungerstedt et ses collègues ont amélioré la conception de la sonde de microdialyse de sorte qu'il était plus petit et moins de tissu déplacé 5.

Une sonde de microdialyse concentrique se comporte comme un capillaire sanguin. Le système est continuellement perfusé par une solution présentant la composition ionique du liquide de tissu environnant tout en manquant de l'analyte d'intérêt. The membrane de dialyse est exposé à la solution ou le tissu externe est semi-perméable. Elle permet la diffusion passive de substances dans la sonde le long de leur gradient de concentration 6. La perméabilité dépend de nombreuses variables telles que le poids moléculaire, la forme, la charge et le pH du composé. Il est également limitée en raison des propriétés du matériau de la membrane, la taille des pores de la membrane et le taux 7 couler.

Les figures 1 et 2 montrent une sonde de microdialyse concentrique. Le liquide de perfusion pénètre par une tubulure d'entrée dans le manchon métallique, qui entoure la silice fondue. A l'intérieur du manchon métallique, il ruisselle le long de la silice fondue et le laisse sur sa pointe. Dans l'espace entre la membrane de dialyse et le polytétrafluoroéthylène (PTFE) -tubing (tel que du Téflon) le liquide de perfusion circule alors vers le haut. Ici, la diffusion de substances à partir du tissu se produit qui entourent la membrane. Le dialysat laisse la sonde à travers la PTFE-tubes, qui est reliée à la sortie des tubes et peuvent être collectées.

La technique de microdialyse a plusieurs avantages par rapport aux autres dans des techniques in vivo. La sonde constitue une barrière physique, de sorte que le dialysat contient pas d'enzymes ou de cellules. Par conséquent, il n'y a pas besoin de purification de l'éluat avant l'analyse, et aucune dégradation enzymatique des analytes a lieu. La dégradation par oxydation peut se produire pendant le passage de substances à analyser dans le tube, mais cela peut souvent être évitée en ajoutant un antioxydant (par exemple l'acide ascorbique) pour le perfusat. Sinon, les dommages oxydatifs à neuropeptides, par exemple, a été efficacement réprimée par le remplacement de la tubulure de sortie avec une pointe de recueillir le dialysat 8. Le dialysat peut être étudiée directement avec presque tout type de méthode analytique et des analytes multiples peuvent être collectées simultanément. Ce système peut être utilisé chez les animaux éveillés, et presque toutes les régions du cerveau peut êtreexaminé. En outre, la perfusion de médicaments à travers la sonde est possible (retrodialysis). Cependant, il existe aussi des limitations de la technique de microdialyse. La résolution temporelle peu faible ne fournit pas d'informations en temps réel concernant les changements de neurotransmetteurs. Parce qu'il est une technique invasive, sonde implantation provoque un traumatisme chirurgical et d'anesthésie, ce qui peut affecter les concentrations neurotransmetteurs, est requis lors de cette étape 7,9,10.

La concentration en substance dans le dialysat comprend seulement une petite quantité de la concentration du composé réel dans le fluide extracellulaire. Pour le calcul de la concentration du composé inconnu dans le liquide extracellulaire, par rapport récupération in vitro doit être calculée. Détermination de l 'individu dans recouvrements in vitro pour chaque sonde et chaque composé est nécessaire avant de commencer l'expérience in vivo. A cet effet, la sonde est plongée dans une solution contenant leanalyte d'intérêt alors que le liquide de perfusion est la même solution dépourvue de la substance à analyser d'intérêt. Après détermination des concentrations de composés dans le dialysat, ces données doit être soumis à leur concentration dans le fluide environnant. In vitro déterminations de récupération de plusieurs substances peuvent être mises en œuvre simultanément 9.

Beaucoup de groupes de recherche en neurosciences utilisent la technique de microdialyse pour enquêter sur les neurotransmetteurs et de métabolites dans l'espace extracellulaire des zones distinctes du cerveau. Ainsi, les sondes commerciales sont en grande demande dans l'environnement de la recherche en neurosciences. Un grand avantage de sondes disponibles dans le commerce est la fiabilité de fonctionnement élevée. Le dispositif expérimental pour les sondes commerciales est bien établi et validé pour de nombreux neurotransmetteurs et de métabolites connus. Cependant, alors que l'équipement de microdialyse disponible dans le commerce est coûteux et a moins de souplesse dans l'application 11, dans eest fonctionne un ensemble de sonde de microdialyse est présenté en détail, qui peut être adapté à toute application et peut être fabriqué pour moins de 10 $. Cette sonde sur mesure est une sonde de microdialyse concentrique testé pour les enquêtes dans différentes zones du cerveau 8.

Dans les recouvrements de la sonde in vitro de substances ayant des poids moléculaires différents (gamme de 100-1,600 Da) et avec différentes propriétés physico-chimiques sont comparées. In vitro de détermination de récupération de glucose, le lactate et l'acétylcholine avec un poids moléculaire inférieur à 200 Da, de l'ATP ayant un poids moléculaire d'environ 500 Da et le neuropeptides angiotensine II, substance P et la somatostatine avec un poids moléculaire supérieur à 1000 Da est exécutée.

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Protocole

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1. Préparation de tubes en PTFE-

  1. Raccourcir PTFE-tube dans 2,5 cm pièce. Utilisez un papier à l'échelle pour estimer les dimensions physiques. (Voir Figure 3a)
  2. Couper une fin à un angle pour faciliter la connexion d'un tube de sortie. (Voir Figure 3a)
  3. Rugueux PTFE tube par utilisation de papier de verre pour permettre le collage de la colle époxy.

2. Préparation de silice fondue

  1. Raccourcir la silice fondue en 2,25 cm pièce. (Voir Figure 3a)

3. Insertion de la silice fondue dans le tube PTFE-

  1. Insérez une canule 30 G dans la fibre de PTFE creux pour percer à une distance de 1 cm de l'extrémité plat. Plier le PTFE-tube pour simplifier le processus. (Voir Figure 3b)
  2. Insérez la silice fondue dans le PTFE-tubage à l'aide de la canule que l'orientation. (Voir figure 3c)
  3. Retirez délicatement la canule et de sécuriser la silice fondue. (VoirFigure 3d)
  4. La silice fondue est censé projeter 5 mm à l'extrémité plat. (Voir Figure 3e)
  5. Collez la silice fondue en place sur le site de ponction par la colle cyanoacrylate et laisser durcir pendant la nuit. (Voir Figure 3e)

4. Préparer Colle époxy (Glue deuxième volet)

  1. Ajouter 30 parties de durcisseur jaune à 70 parties de la colle époxy noir par l'aide d'une aiguille fine et mélanger délicatement. Il est directement prêt à l'emploi.

5. Application de la membrane (Tous les autres étapes doivent être effectuées sous le microscope et un Livre de l'échelle est utilisée pour estimer Dimensions physiques)

  1. Tirez la membrane de polysulfone attentivement sur la silice fondue, puis tirez la membrane dans le PTFE-tube et régler la membrane à 5,5 mm en utilisant un scalpel. (Voir Figure 3f)
  2. Définir un point de marquage sur la membrane avec une plume fine pour définir la longueur d'échange de 2 mmà partir de l'extrémité de la membrane.
  3. Appliquez une petite quantité de colle époxy pour couvrir la pointe de la membrane à l'aide d'une aiguille fine. (Voir la figure 3g)
  4. Fermez le joint entre la membrane de dialyse et de fibres PTFE par l'aide de la même aiguille fine utilisée dans l'étape 5.3) avec de la colle époxy. (Voir la figure 3g)
  5. Ajouter suffisamment de colle époxy sur la membrane jusqu'au point de marquage pour assurer une longueur d'échange de 2 mm. Laisser durcir pendant la nuit. (Voir la figure 3g) Avant de détermination de la longueur d'échange, la membrane est de 5,5 mm. Après l'application de la colle époxy sur la membrane, seulement 2 mm de la membrane est disponible pour diffusion.

6. Application de la Manche Métal

  1. Couper une aiguille de 25 G morceaux de 1 cm de manches en métal par l'aide d'une pince de pliage.
  2. Tirer le 1 cm manchon métallique (25 G) sur la partie restante de la silice fondue. Le manchon métallique permet par la suite de la connexion de la tubulure d'entrée avec la MICRODIAsonde de lyse. (Voir la figure 3h)
  3. Joint d'étanchéité entre le manchon métallique et PTFE-tube avec le reste de la colle époxy. Laisser durcir pendant au moins 24 heures. (Voir la figure 3i)
  4. L'application de la colle à chaud autour de la bifurcation de la sonde de fixation et de stabilisation supplémentaire.
    NOTE: Le volume interne d'entrée de la sonde est 0,045 pl et le volume interne de sortie est de 2,5 ul. Par conséquent, avec une vitesse de 1 pl d'écoulement / min, il faut environ 2,5 min après le raccordement du tube d'entrée pour commencer la collecte du dialysat. Avec le présent protocole, la procédure d'assemblage de la sonde donne des sondes de microdialyse qui sont 95% fiable.

7. Performance des expériences in vitro récupération

  1. Trempez la sonde avec une coupure de 30 kDa et une longueur d'échange de 2 mm dans une solution de réserve composée de aCSF contenant 1 mM de glucose et 1 mM de lactate et, dans une expérience séparée, dans un CSF contenant 100nM et 100 nM d'ATP acétylcholine.
  2. Perfuser les sondes avec aCSF. Réglez débit à 1 pl / min et réaliser des expériences à température ambiante (22 ° C). Laisser les sondes à équilibrer pendant 1 h dans la solution de réserve, et de recueillir les échantillons toutes les 30 minutes après et conserver à -80 ° C jusqu'à la mesure.
  3. Pour le calcul des recouvrements in vitro, comparer les concentrations d'analytes dans les dialysats avec les concentrations connues en analyte dans la solution de stock. Exprimez les résultats sous forme de pourcentages de concentration de la substance dans le dialysat vs. solution de stock.

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Résultats

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La sonde de microdialyse sur mesure concentrique est constitué d'une membrane en polysulfone avec un seuil de coupure moléculaire de 30 kDa. L'assemblage de sonde est illustrée sur la figure 3.

Il présentait une récupération in vitro pour le petit métabolites énergétiques glucose (180,16 Da) et lactate (112,06 Da) de 19,10 ± 1,2% et 21,2 ± 1,6%, respectivement. Pour l'acétylcholine chargé positivement avec une masse moléculaire de 181,66 Da, il a montré une valeur d...

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Discussion

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La figure 3 montre un exemple de montage de la sonde. Dimensions de diamètre intérieur et extérieur correctes doivent être étroitement surveillés pour les tubes (1.6 mm OD; ID 350 um), la silice fondue (OD 105 um; ID 40 um) et la membrane de dialyse (DO 245 um; ID 210 um). Il est également important de maintenir un espace entre la membrane et de la silice fondue (105 pm) et entre la membrane et le tube (105 um), ainsi. Si les valeurs diffèrent, la pression dans la sonde peut augmenter et entraîner des f...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Les auteurs remercient G. Barka (SunChrom GmbH, Friedrichsdorf, Allemagne) pour son soutien et pour avoir fourni la colle époxy. De plus, les auteurs remercient Fresenius Medical Care (Bad Homburg, Allemagne) pour la fourniture du filtre capillaire hémodien FXCorDiax. Le financement a été obtenu de l’Université Goethe de Francfort.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Colle époxySunChrom GmbH, Fiedrichsdorf, Allemagne  ;   ;   ;
Silice fondue ID 40 µ ; m OD 105 et micro ; mZiemer-Chromatographie, Mannheim, AllemagneArt. N° : 6.040105
Membrane polysulfone (filtre d’hémodialyse FX Cor Diax 600)Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA, Bad Homburg, AllemagneREF : F00001593
Colle cyanacrylate (plastique superglue Pattex® ;)Henkel AG&Co. KGaA, Dü ; sseldorf, Allemagne
Tube TEFLON 1,6 x 0,35 mmSunChrom® ; GmbH, Friedberg, AllemagneArt. N° : 969-195.219
Scalpel (Feather® ; Lame chirurgicale n° 10)pfm medical ag, cologne, AllemagneArt. N° : 07310
MicroscopeMEIJI Techno  ;EMZ-8TR
Canule de 30 G x 11" (0,3 x 25 mm) Sterican® ZB.Braun Melsungen AG, Melsungen, AllemagneREF : 9324500
Canule 25 G x 11/2" (0,5 x 40 mm) 100 Sterican® ;B.Braun Melsungen AG, Melsungen, AllemagneRÉF : 9186166
Stylo fin (Stabilo point 88 fin 0.4)Schwan-STABILO Schwanhä ; uß ; er GmbH & Co. KGArt. N° : 88/36
Colle chaude (Bâtons de colle ULTRA Power x 11 mm)Steinel® ; GmbH, Herzebrock-Clarholz, AllemagneArt. N° : 4007841046910
Papier de verre P60 230 x 280Robert Bosch GmbH, Gerlingen-Schillerhö ; he, AllemagneNuméro de catalogue : 2608605397

Références

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  1. Feldberg, W., Malcom, J. Experiments on the site of action of tubocurarine when applied via the cerebral ventricles. J Physiol. 149, 58-77 (1959).
  2. Gaddum, J. H. Push-pull cannulae. J Physiol. 155 (1 P), (1961).
  3. Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
  4. Delgado, J. M., Lerma, J., Martín del Río, R., Solís, J. M. Dialytrode technology and local profiles of amino acids in the awake cat brain. J Neurochem. 42 (5), 1218-1228 (1984).
  5. Ungerstedt, U., Pycock, C. Functional correlates of dopamine neurotransmission. Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30 (1-3), 44-55 (1974).
  6. Ungerstedt, U. Microdialysis--principles and applications for studies in animals and man. J Intern Med. 230 (4), 365-373 (1991).
  7. Bourne, J. A. Intracerebral microdialys: 30 years as a tool for the neuroscientist. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30 (1-2), 16-24 (2003).
  8. Lietsche, J., Gorka, J., Hardt, S., Karas, M., Klein, J. Self-built microdialysis probes with improved recoveries of ATP and neuropeptides. J Neurosci Methods. 237, 1-8 (2014).
  9. Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of Brain Microdialysis. Curr Protoc Neurosci. 7, Unit 7.1(2009).
  10. Neurochem, J. Brain Microdialysis. J. Neurochem. 52 (6), 1667-1679 (1989).
  11. Jolly, D., Vezina, P. In vivo microdialysis in the rat: low cost and low labor construction of a small diameter, removable, concentric-style microdialysis probe system. J Neurosci Methods. 68 (2), 259-267 (1996).
  12. Sumbria, R., Klein, J., Bickel, U. Acute depression of energy metabolism after microdialysis probe implantation is distinct from ischemia-induced changes in mouse brain. Neurochem Res. 36, 109-116 (2010).

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Mots-clés

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